Stanovení cholesterolu ve vaječném žloutku a mléce kapilární elektroforézou Úkol Stanovte obsah cholesterolu ve vaječném žloutku a mléce pomocí kapilární elektroforézy. Teoretická část Cholesterol je steroidní látka, kterou lidský organismus potřebuje pro tvorbu hormonů a vitamínu D a je také důležitou součástí buněčných membrán. Je důležitou stavební jednotkou nervů, mozkových buněk a některých hormonů. Cholesterol je produkován jak lidským tělem, je také přijímán ve stravě, především v živočišných produktech jako vejcích, mléčných výrobcích a mase. Struktura molekuly cholesterolu. Příliš vysoká koncentrace v krvi však nese pro organismus zdravotní rizika, především srdečně-cévních onemocnění. Při zvýšené hladině cholesterolu je třeba upravit životosprávu a dodržováním zásad zdravého životního stylu se snažit o její snížení. Maximální denní doporučená dávka je 300 mg cholesterolu, v případě zvýšené hladiny je doporučováno příjem omezit na 200 mg denně. Z tohoto důvodu je důležitá kontrola obsahu v konzumovaných potravinách. Kapilární zónová elektroforéza (CZE) patří spolu s dalšími elektromigračními metodami mezi moderní a vysokoúčinné separační techniky. CZE je založena na elektroforetické migraci iontů v elektrickém poli, je tedy použitelná pro analyty schopné nést náboj v důsledku jejich disociace. Separace je uskutečňována v kapiláře, která je vyrobena z taveného křemene a je 1
pokryta vrstvou polyamidu, který zabezpečuje mechanickou odolnost. Polyamid je opticky nepropustný, proto v místě detekce je potřeba jeho vrstvu odstranit. Konce kapiláry jsou umístěny v nádobkách se separačním elektrolytem a do nádobek jsou vloženy platinové elektrody. Separace analytů probíhá vložením vysokého napětí, které je používáno v rozmezí od 0 do 30 kv. Rozseparované analyty jsou poté detekovány pomocí detektoru, který je umístěn na opačném konci kapiláry než dávkovaný vzorek. Po naplnění kapiláry elektrolytem dochází k disociaci povrchových silanolových skupin (Si-OH). Vnitřní stěna tak získává záporný náboj, který je kompenzován kationty z elektrolytu. Po vložení elektrického pole na kapiláru dochází k pohybu těchto kationtů s jejich solvatačními obaly, což strhává celý objem kapiláry ve směru migrace kationtů. Tento jev se nazývá elektroomostický tok (electroosmotic flow, EOF) a ovlivňuje migraci všech látek ve vzorku - urychluje tedy migraci kationtů, unáší neutrální látky i anionty směrem k detektoru. Je tak možné během jedné analýzy detekovat jak kationty, neutrální látky, tak i anionty. Čím je vyšší ph elektrolytu, tím větší negativní náboj je rozprostřen na vnitřní stěně a tím rychlejší elektroosmotický tok pozorujeme. Elektroosmotický tok vykazuje téměř plošný rychlostní profil, který vede k velmi malému rozmývání zón separovaných látek, a proto se v elektromigračních separačních metodách setkáváme s mnohem užšími píky než v kapalinové chromatografii. Schéma vzniku elektroosmotického toku u povrchu křemenné kapiláry. 2
Kapilární elektroforéza využívá nejčastěji vodné elektrolyty jako separační prostředí, avšak elektrolyty založené na jiných rozpouštědlech také nacházejí uplatnění díky svým odlišným vlastnostem. Organická rozpouštědla jako methanol, ethanol, propanol, acetonitril, dimethylformamid nebo tetrahydrofuran se vyznačují zejména nižší relativní permitivitou a odlišnou autoprotolytickou konstantou významně ovlivňující disociační rovnováhy látek, ale také jinou viskozitou a povrchovým napětím ovlivňující celkové separační podmínky. Těchto vlastností se dá s výhodou využít pro separace látek, které by bylo jinak obtížné analyzovat ve vodných elektrolytech např. pro jejich podobné chování nebo rozpustnost. V případě analýzy cholesterolu je třeba zdůraznit jeho nerozpustnost ve vodném prostředí, z toho důvodu je pro jeho analýzy využít jiného rozpouštědla. Cholesterol neobsahuje žádnou disociovatelnou funkční skupinu, díky které by jej bylo možné separovat pomocí kapilární zónové elektroforézy. Výhodou analýzy v nevodném prostředí je tendence látek vytvářet iontové asociáty (viz Vybrané aspekty užití nevodných rozpouštědel v analytické chemii, Kapitola 5), kdy cholesterol získá zápornou mobilitu při analýze v nevodném elektrolytu s přídavkem kyseliny octové. Díky elektroosmotickému toku lze cholesterol detekovat v relativně rozumném čase při pozitivní polaritě vkládaného napětí. Praktická část Vybavení: Agilent HP 3D CE s UV detektorem, vodní lázeň, odparka, váhy Pomůcky: Kádinky, odměrné baňky, uzavíratelné zkumavky, nylonové filtry s velikostí pórů 0,45 µm, křemenná kapilára (s vnitřním průměrem 50 µm a celkové délky 33 cm), řezátko, vialky, mikrozkumavky Chemikálie: Octová kyselina, octan sodný, hydroxid draselný, standard cholesterolu, methanol, ethanol, hexan, deionizovaná voda 3
Pracovní postup Příprava elektrolytu: - 95 mm octan sodný, 5 mm octová kyselina v methanolu - v odměrné baňce rozpusťte odpovídající množství octanu sodného v methanolu - přidejte odpovídající množství kyseliny octové Příprava standardů: - navažte do mikrozkumavky cholesterol na přípravu roztoku, aby výsledná koncentrace byla 1 mg/ml (rozpustit v připraveném elektrolytu) - ze zásobního roztoku odpipetujte odpovídající množství pro přípravu standardů o koncentracích 0,1; 0,2; 0,3; 0,5 a 0,7 mg/ml (doplnit připraveným elektrolytem) Příprava vzorku: - ke vzorku 0.1 g vaječného žloutku (zjistěte i hmotnost celého žloutku pro pozdější vyhodnocení) a k druhému vzorku 1 g mléka přidejte 3 ml etanolu a třepejte 3 minuty - poté k roztoku přidejte 2 ml 50% hydroxidu draselného a ponechte 30 minut při 60 C s občasným protřepáním - po zchladnutí přidejte 3 ml hexanu a 3 minuty třepejte - přidejte 3 ml deionizované vody a 3 minuty třepejte - po oddělení fází odeberte 0,5 ml organické fáze do mikrozkumavky a odpařte do sucha po proudem dusíku - odparek rozpusťte v připraveném elektrolytu Příprava separační kapiláry: - podle pokynů vedoucího cvičení uřízněte separační kapiláru o délce 33 cm - ve vzdálenosti 8,5 cm odstraňte pomocí vypalovače vrstvu polyamidu a okénko otřete gázou navlhčenou v metanolu - podle pokynů vedoucího cvičení umístěte kapiláru do interface a vložte kapiláru do přístroje - kapiláru promyjte 5 minut 1M NaOH, 5 minut vodou, 5 minut 0,1 M NaOH, 5 minut vodou a následně separačním elektrolytem; nastavte parametry metody (+25 kv, detekce při 210 nm, nástřik 50 mbar 5 sekundy) 4
Měření vzorků: - proměřte standardy cholesterolu o různých koncentracích (měření opakujte 3x) - proměřte vzorky vaječného žloutku a mléka, v případě potřeby nařeďte (měření opakujte 3x) Vyhodnocení: Vyhodnoťte plochy píků pro měření standardů cholesterolu o různých koncentracích. Z hodnot ploch píků cholesterolu sestavte kalibrační křivku. Pomocí kalibrační závislosti vypočtěte množství cholesterolu ve vaječném žloutku a mléce. Údaje také uveďte v obvyklých spotřebitelských jednotkách. Otázky k přípravě: 1. Popište význam cholesterolu a rizika při jeho zvýšené hladině. 2. Vysvětlete kroky použité při úpravě vzorku. 3. Popište vznik elektroosmotického toku a k čemu ho lze využít. 4. Jaké způsoby kvantifikace látek znáte? Doporučená literatura: 1. Baker D.R., Capillary electrophoresis: Techniques in analytical chemistry. John Wiley and Sons Ltd, New York 1995. 2. Analytické separační metody, Karolinum Praha 2004, Štulik K. a kol. 3. Teoretické základy a separační principy kapilárních elektromigračních metod, Chemické listy, 91 (1997) 320 329, V. Kašička. 5