FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ

FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ KATEDRA ANORGANICKÉ A ORGANICKÉ CHEMIE DIPLOMOVÁ PRÁCE VYUŽITÍ NMR PŘI STRUKTURNÍ ANALÝZE PŘÍRODNÍCH LÁTEK Hradec Králové, 2010 Hana Dohnalová

Prohlašuji, že tato práce je mým původním autorským dílem, které jsem vypracovala samostatně. Veškerá literatura a další zdroje, z nichž jsem při zpracování čerpala, jsou uvedeny v seznamu použité literatury a v práci řádně citovány. 2

Za všestrannou a obětavou pomoc, cenné rady a připomínky při vypracovávání diplomové práce děkuji doc.pharmdr. Jiřímu Kunešovi, CSc. a Ing.Lucii Cahlíkové, Ph.D. 3

OBSAH 1. Abstrakt 5 2. Úvod 7 1.1. Eschscholtzia californica 7 1.2. Obsahové látky E.californica 8 1.3. Využití E.californica 10 3. Cíl práce 11 4. Výsledky s komentářem 12 3.1. Použité experimentální postupy 12 3.2. LC-004 13 3.3. LC-006 20 3.4. LC10-4 28 5. Závěr 36 6. Literatura 37 7. Přílohy 38 7.1. NMR spektra sloučeniny LC-004 38 7.2. NMR spektra sloučeniny LC-006 44 7.3. NMR spektra sloučeniny LC-10-4 51 4

Abstrakt 1. Abstrakt Diplomová práce je věnována určení struktury neznámých látek. Na Katedře farmaceutické botaniky a ekologie Farmaceutické fakulty v Hradci Králové byla z rostliny Eschscholtzia californica z čeledi Papaveraceae izolována celá řada alkaloidů. Některé z nich byly předány do Laboratoře struktury a interakcí biologicky aktivních molekul s žádostí o určení jejich struktury. Cílem diplomové práce byla identifikace tří neznámých vzorků pomocí NMR analýzy. U neznámých sloučenin byla na základě provedených NMR experimentů ( 1 H-NMR, 13 C-NMR, DEPT, ghmqc, ghsqc, ghmqfcops a dpfgnoe) určena jejich struktura. Ta byla potvrzena na základě srovnání s údaji uvedenými v literatuře. Identifikované sloučeniny patří mezi isochinolinové alkaloidy. Jedná se o skulerin a retikulin, třetí sloučenina nebyla v literatuře pojmenována. 5

Abstrakt Abstract This Diploma work is dedicated to the determination of the structure of unknown substances. A large number of alkaloids was isolated from an Eschscholtzia Californica plant (Papaveraceae) at the Department of Pharmaceutical Botanic and Ecology of the Pharmaceutical Faculty in Hradec Králové. Some of them were passed to the Laboratory of the structure and interaction of the biological aktive molecules along with the request for the structure analysis.the main object of this Diploma work was the identification of three of unknown subjects by the help of NMR analysis. The structures of unknown substances were identified on the basis of the NMR experiments ( 1 H-NMR, 13 C-NMR, DEPT, ghmqc, ghsqc, ghmqfcops a dpfgnoe). These structures were confirmed based on the comparison with the data provided in the subject publications. Now identified substances belong to isochinoline alkaloids. Namely, it is scoulerine and retikuline. The third substance was not specified in the subject publication. 6

Úvod 2. ÚVOD 2.1. Eschscholtzia californica Eschscholtzia californica sluncovka kalifornská z čeledi Papaveraceae je tradiční léčivá rostlina indiánů užívaná pro své sedativní a analgetické účinky 1. Divoce roste po celé Kalifornii (obvykle pod hranicí 1 500 metrů), v některých částech Oregonu a ve Washingtonu 2. V 19. století byla dovezena do Evropy jako dekorativní zahradní rostlina 3. Eschscholtzia patří do čeledi Papaveraceae a pojmenoval ji Albert von Chamisso podle svého přítele, profesora Johanna Friedricha Eschscholtze, německého fyzika a přírodovědce, který se účastnil ruské expedice do Kalifornie 4. Eschscholtzia californica je jednoletá bylina, má 30-40 cm vysokou, řídce větvenou lodyhu s jemně zpeřenými šedozelenými listy. Kvete žlutě až oranžově. Květy velikosti 5-6 cm vyrůstají jednotlivě, mají nálevkovitý nebo miskovitý tvar. Dva kališní lístky jsou kápovitě srostlé a při rozkvětu odpadávají. Korunní lístky jsou čtyři. Kvete od května do září, květ se však rozevře pouze za svitu slunce 4,5,6. 7

Úvod 2.2. Obsahové látky E.californica Obsahové látky Eschscholtzia californica jsou poměrně dobře známy. Bylina obsahuje asi 0.29-0.38% alkaloidů. Byla izolována komplexní směs asi třiceti terciálních a kvarterních isochinolinových alkaloidů, náležících do 6 strukturních typů 3. Hlavním alkaloidem Eschscholtzia californica je kvartení báze californidin (N-methylescholzinium hydroxid) 7, který se v rostlině vyskytuje v množství 0.19-0.23% 6. Obsah terciálních alkaloidů v rostlině je 0.14-0.16%. Hlavními složkami terciálních nefenolických bází jsou escholtzin, allocryptopin a protopin (každý asi 0.02-0.03%) 7. Escholtzin je typickou složkou nadzemní části rostliny, v kořenech obsažen není. Hlavním zástupcem fenolických terciálních bazí je aporfin, N- metyllaurotetanin (lauroscholzin), který se však v rostlině vyskytuje v nepatrných množstvích, stejně jako další aporfiny korydin, isokorydin a pavinany karyachin, isokaryachin, isonorargemonin, norargemonin a bisnorargemonin. Z kvarterních isochinolinových alkaloidů jsou v rostlině ve stopách obsaženy protoberberinové alkaloidy berberin, koptsin a korysamin, benzylisochinoliny escholamidin a escholamin, aporfin magnoflorin a ve velmi nepatrném množství se vyskytují benzofenantridiny sanqinarin a chelerytrin, doprovázené chelirubinem, makarpinem a chelilutinem 6,7. 8

Úvod H 2 C O O O N OR 1 H 3 CO HO HO N + CH 3 CH 3 OR 2 H 3 CO protopin R 1 +R 2 =CH 2 allokryptopin R 1 =R 2 =CH 3 magnof lorin H 2 C O O N + H 2 C O O N + O CH 3 OR 1 O CH 3 OR 2 berberin escholamin R 1 +R 2 =CH 2 escholamidin R 1 =CH 3,R 2 =H Kromě alkaloidů obsahuje Eschscholtzia californica také flavonoidy, které se vyskytují hlavně jako glykosidy kvercetinu a isorhamnetinu 2. Jsou to například flavonolové glykosidy rutin a kvercetin a isoflavony 2 -metoxyformononetin a 7-metoxy-2,4 - dihydroxyisoflavony 1. 9

Úvod 2.3. Využití E.californica V lidové medicíně se nadzemní část rostliny využívá pro analgetické, diaforetické, diuretické, sedativní a spasmolytické účinky. Různé farmakologické studie potvrdily sedativní a anxiolytickou aktivitu a nepřítomnost nežádoucích účinků extraktu z rostliny 3. Mechanismus sedativní a anxiolytické aktivity zatím není objasněn. Uvažuje se o zapojení benzodizepinových receptorů. Navíc by aktivita mohla být spojena s inhibicí rozkladu katecholaminů inhibicí enzymů dopamin-β-hydroxylázy a monoaminooxidázy 2. Obecně se soudí, že na aktivitě extraktu z Eschscholtzia californica se podílí isochinolinové alkaloidy, zatím to však nebylo potvrzeno žádnou studií s izolovanými sloučeninami 3. V Americe a v Evropě se rostlina používá jako mírné sedativum. V Americe jsou přípravky z drogy předepisovány při poruchách spánku, především v pediatrii a ve Francii při léčbě nervozity. Výjimečně je Eschscholtzia využívána jako náhradní droga za marihuanu. Po požití nebo vykouření navozuje mírnou euforii trvající 20-30 minut. Pravidelné a dlouhodobé užívání nevyvolává návyk 6. 10

Cíl práce 3. CÍL PRÁCE Cílem mé práce byla identifikace 3 neznámých látek s kódovým označením LC-004, LC-006 a LC10-4, které byly, ing. Lucií Cahlíkovou z Katedry farmaceutické botaniky a ekologie, izolovány z rostliny Eschscholtzia californica z čeledi Papaveraceae. 11

Výsledky s komentářem 4. VÝSLEDKY S KOMENTÁŘEM 4.1. Použité experimentální postupy Nadzemní část a kořen rostliny Eschscholtzia californica byly získány od prodejce rostlin Planta Naturalis (Markvartice u Sobotky). Doklad vzorku je uložen v herbáři Farmaceutické fakulty v Hradci Králové. Extrakt alkaloidů byl připraven perkolací suché rostliny s kořeny (36.54 kg) pomocí 95% etanolu (328 l). Extrakt alkaloidů byl zahuštěn za sníženého tlaku na 4 litry a následně 3x digerován při 50 C několika litry 1% H 2 SO 4 ; vodná vrstva byla vždy slita. Byl získán hnědý roztok o ph 2. Tento spojený hnědý digerát byl zfiltrován nejprve přes viskózový filtr, posléze přes vrstvu křemeliny. Jeho celkový objem byl 17.2 litrů. Další zpracování primárního extraktu a izolace alkaloidů bylo provedeno na Katedře farmaceutické botaniky a ekologie v rámci diplomových a rigorózních prací (J. Doležal) 8. Některé alkaloidy byly předány do Laboratoře struktury a interakcí biologicky aktivních molekul s žádostí o určení jejich struktury. Měření hmotnostních spekter všech látek bylo provedeno na hmotnostním spektrometru Thermo Finningan LCQ Duo (ionizace elektrosprejem, analyzátor iontová past). NMR spektra ( 1 H, 13 C, DEPT, ghmqc, ghsqc, ghmqfcops a dpfgnoe) všech látek byla měřena v roztocích CDCl 3 nebo CD 3 OD při laboratorní teplotě na přístroji VARIAN Mercury Vx BB 300 MHz pracujícím při 300 MHz pro 1 H a při 75 MHz pro 13 C. Chemické posuny byly změřeny jako hodnoty δ v pars per milion (ppm) a byly nepřímo vztaženy k tetramethylsilanu (TMS) jako standardu pomocí zbytkového signálu rozpouštědla (7.26 pro 1 H a 77.0 pro 13 C pro CDCl 3 resp. 3.30 pro 1 H a 49.0 pro 13 C pro CD 3 OD). Data jsou prezentována v následujícím pořadí: chemický posun (δ), integrovaná intenzita (v protonovaných spektrech), multiplicita (s: singlet, d: dublet, t: triplet, q: kvartet, qd: kvartet dubletů, bs: široký singlet, dd: dublet dubletů, m: multiplet), interakční konstanta (Hz) a přiřazení (v některých produktech). 12

Výsledky s komentářem 4.2. LC-004 Neznámá sloučenina s kódovým označením LC-004 byla získána izolací z rostliny Eschscholtzia californica z čeledi Papaveraceae. V klasickém 1 H spektru jsem si podle integrálu určila, kolik atomů vodíku odpovídá jednotlivým signálům. Podle chemického posunu je zřejmé, že neznámá sloučenina obsahuje 4 atomy vodíku navázané na aromatickém jádře. Podle štěpení se jedná o dublet δ=6.84 ppm, singlet δ=6.76 ppm a v oblasti δ=6.70 6.65 ppm dublet a singlet. Singlety odpovídají dvěma atomům vodíku ležící na aromatickém jádře v poloze para (aromatické jádro je substituováno v polohách 1, 2, 4 a 5), viz obr.1, nebo izolovaným atomům vodíku vázaným na dvou různých aromatických jádrech. Dublety s interakční konstantou J=8.5 Hz náleží dvěma sousedním aromatickým atomům vodíku (viz obr.2). Neznámá sloučenina obsahuje minimálně 2 aromatická jádra. Signál s chemickým posunem δ=4.36 ppm náleží jednomu atomu vodíku a je štepen na dublet. Chemický posun δ=4.36 ppm napovídá, že se tento atom vodíku nachází v blízkosti elektronegativního atomu, nebo skupiny atomů, které způsobí jeho odstínění. Signál s chemickým posunem δ=3.71-3.89 ppm odpovídá podle integrálu osmi atomům vodíku a je složen z několika signálů, které se vzájemně překrývají. Této skupině dominují výrazné singlety při chemickém posunu δ=3.82 ppm, typické pro methoxy skupiny navázané na aromatickém jádře. Dalším výrazným signálem je dublet při chemickém posunu δ=3.71 ppm. Podle integrálu odpovídá signál s chemickým posunem δ=3.71-3.89 ppm osmi atomům vodíku. Musí tedy náležet kromě dvěma methoxy skupinám a jednomu atomu vodíku s chemickým posunem δ=3.71 ppm ještě jednomu atomu vodíku. Signály s chemickým posunem δ=3.47-2.72 ppm náleží dalším šesti alifatickým atomům vodíku. V klasickém 13 C spektru je patrné, že se v neznámé sloučenině nachází 12 aromatických atomů uhlíku. Sloučenina tedy pravděpodobně obsahuje 2 aromatická jádra, což odpovídá rozvržení atomů vodíku vázaných na aromatických jádrech podle obr.1 a obr.2. 13

Výsledky s komentářem Chemický posun atomů uhlíku 143.7, 146.6, 146.8 a 148.4 ppm je typický pro atomy uhlíku aromatického jádra, na které je vázán atom kyslíku. Neznámá sloučenina tedy obsahuje 4 atomy kyslíku. V oblasti chemického posunu 28.3-60.8 ppm leží celkem 7 alifatickým atomů uhlíku. Z MS spektra vyplývá, že neznámá sloučenina má molekulovou hmotnost 327. V 13 C- NMR spektru je patrné, že sloučenina obsahuje 19 atomů uhlíku a 4 atomy kyslíku viz úvaha výše. Z 1 H spektra jsem určila, že neznámá sloučenina obsahuje pouze 2 methoxy skupiny, na další 2 atomy kyslíku tedy musí být navázány atomy vodíku. Zatím jsem tedy určila, že sloučenina obsahuje 19 atomů uhlíku, 21 atomů vodíku a 4 atomy kyslíku. Součtem jejich molárních hmotností jsem získala číslo 313 a do celkové molekulové hmotnosti mi chybí 14, což je přesně molární hmotnost atomu dusíku. Neznámá sloučenina tedy ve své molekule obsahuje ještě atom dusíku. Sumární vzorec neznámé sloučeniny bude C 19 H 21 NO 4. Pomocí experimentu DEPT jsem určila počet methylových, methylenových a methinových skupin. Atomy uhlíku při chemickém posunu δ=119.8, 125.1, 127.1, 128.7, 143.7, 146.6, 146.8 a 148.4 ppm odpovídají kvarterním uhlíkovým atomům. Methinové jsou atomy uhlíku při chemickém posunu δ=120.1, 113.1, 112.5, 111.7 a 60.8 ppm, methylenovým skupinám odpovídají atomy uhlíku při chemickém posunu δ=54.1, 52.6, 35.6 a 28.3 ppm. Metylovou skupinu tvoří atomy uhlíku s chemickým posunem δ=56.5 a 56.3 ppm. Experiment ghsqc mi umožnil určit konkrétní atomy vodíku, které jsou navázané na jednotlivé atomy uhlíku. C (120.1)..H(6.70) C(113.1)..H(6.76) C(112.5)..H(6.69) C(111.7)..H(6.84) C(60.8)....H(3.89-3.76) C(56.5).H(3.82) C(56.3)...H(3.82) C(54.1)...H(3.71, 4.36) C(52.6)...H(2.72-3.01, 3.47-3.36) C(35.6)...H(2.72-3.01, 3.47-3.36) C(28.3)...H(2.72-3.01; 3.04-3.21) Neznámá sloučenina obsahuje 2 aromatická jádra a tedy 6 atomů uhlíku na každé jádro. Na každé aromatické jádro jsou navázány dva atomy vodíku. Pomocí experimentu ghsqc jsem již určila, na které atomy uhlíku jsou tyto atomy vodíku navázány. Z toho vyplývá, že je třeba ještě určit umístění zbývajících čtyř kvarterních atomů uhlíku na každém aromatickém jádře. Podle experimentu ghmqc je patrné, že atom vodíku δ=6.70 ppm má korelaci na atomy uhlíku 128.7 a 146.6. Tyto atomy uhlíku musí ležet ve vzdálenosti tří vazeb od atomu vodíku δ=6.70 ppm, musí tedy ležet v polohách 2 a 4 aromatického jádra, tedy blíže k atomu vodíku δ=6.76 ppm. Atom vodíku δ=6.76 ppm má korelaci na atomy uhlíku 125.1 a 14

Výsledky s komentářem 148.4. Obdobnou úvahou jako v předchozím případě jsem určila, že tyto atomy uhlíku musí ležet v polohách 1 a 5 aromatického jádra (viz obr.3). Atom vodíku δ=6.84 ppm má korelaci na atomy uhlíku δ=143.7, 127.1 a 146.8. Výrazné korelace na atomy uhlíku 143.7 a 127.1 napovídají, že se jedná o korelace přes tři vazby a tyto atomy uhlíku se budou nacházet v polohách 2 a 4 aromatického jádra, tedy ve vzdálenosti tří vazeb od atomu vodíku δ=6.84 ppm. Korelace atomu vodíku δ=6.84 ppm na atom uhlíku 146.8 je výrazně menší, jedná se tedy o korelaci přes dvě vazby a tento atom uhlíku se bude nacházet v poloze 1 aromatického jádra. Atom vodíku δ=6.69 ppm má korelaci na atom uhlíku 119.8. Tento atom uhlíku se tedy bude nacházet v poloze 3 aromatického jádra (viz obr.4). 6.70 H 148.4 125.1 127.1 119.8 143.7 146.8 146.6 128.7 H 6.69 H 6.76 obr.3 Dalším mým krokem bylo určení napojení alifatických atomů uhlíku na aromatická jádra. Atom vodíku δ=6.70 ppm má korelaci na atom uhlíku 28.3. Tento atom uhlíku musí být vůči atomu vodíku δ=6.70 ppm ve vzdálenosti tří vazeb, musí tedy být na aromatické jádro vázán v poloze 1 nebo 5. V této poloze leží buď atom uhlíku 125.1, nebo atom uhlíku 148.4. Atom uhlíku 28.3 musí být vázán na atom uhlíku 125.1, protože na atom uhlíku 148.4 je navázán atom kyslíku. Atom vodíku δ=6.76 ppm má korelaci na atom uhlíku 60.8. Tento atom uhlíku musí být na aromatické jádro vázán v poloze 2, nebo 4, tedy v polohách, ve kterých leží atomy uhlíku 128.7 a 146.6. Na atom 146.6 je vázán atom kyslíku, atom uhlíku 60.8 musí být tedy na aromatické jádro navázán přes atom uhlíku 128.7. Podle chemického posunu atomu uhlíku 60.8 jsem usoudila, že tento atom uhlíku nemůže být vázán na další atom uhlíku, ale musí se nacházet v sousedství elektronegativního atomu. Z chemického posunu vyplývá, že atom uhlíku 60.8 musí ležet v sousedství atomu dusíku, který způsobí jeho odstínění (viz obr.5). Korelace atomu vodíku δ=2.72-3.01 ppm (navázán na atomu uhlíku 28.3) na atom uhlíku 128.7 mi umožnila určit, že atomy uhlíku 128.7 a 125.1 leží na aromatickém jádře vedle sebe a atomy uhlíku 60.8 a 28.3, které toto aromatické jádro substituují, leží na stejné straně vůči atomům vodíku δ=6.70 ppm a δ=6.76 ppm (viz obr.5). Atom vodíku δ=6.69 ppm druhého aromatického jádra má v experimentu ghmqc korelaci na alifatický atom uhlíku 35.6. Aby byla dodržená vzdálenost tří vazeb, musí být tento alifatický atom uhlíku vázán na aromatické jádro přes atom uhlíku vedle atomu uhlíku 15 H 6.84 obr.4

Výsledky s komentářem 112.5, který nese navázaný atom vodíku δ =6.69 ppm. Vedle atomu uhlíku 112.5 je navázán atom uhlíku 111.7, který nese navázaný atom vodíku δ=6.84 ppm. Z druhé strany vůči atomu uhlíku 112.5 je navázán buď atom uhlíku 127.1, nebo atom uhlíku 143.7. Na atom uhlíku 143.7 je navázán atom kyslíku. Alifatický atom uhlíku 35.6 tedy musí být na aromatické jádro vázán přes atom uhlíku 127.1, který se musí nacházet v poloze 4 aromatického jádra, tedy vedle atomu uhlíku 112.5 (viz obr.6). O O 6.70 3.04-3.21 H H R 4 125.1 28.3 2.72-3.01 148.4 H 146.6 128.7 R 1 N 60.8 R 2 R 3 H H 6.76 3.76-3.89 obr.5 3.36-3.47 H H 2.72-3.01 R 1 R 2 35.6 119.8 O 127.1 143.7 112.5 146.8 H O 6.69 111.7 H 6.84 obr.6 Z chemického posunu atomu uhlíku 28.3 je patrné, že tento atom uhlíku nemůže být vázán na elektronegativní atom, který by způsobil jeho odstínění. Na atom uhlíku 28.3 musí tedy být vázán další atom uhlíku. Atom vodíku δ=3.04-3.21 ppm (leží na atomu uhlíku 28.3) má korelaci na atom uhlíku 52.6. Tato korelace je velmi slabá, jedná se tedy pravděpodobně o korelaci přes dvě vazby. Atom uhlíku 52.6 bude ležet v těsném sousedství atomu uhlíku 28.3. Slabou korelaci přes dvě vazby na atom uhlíku 28.3 má i atom vodíku δ=3.36-3.47 ppm, který je navázán na atomu uhlíku 52.6. Z chemického posunu atomu uhlíku 52.6 je patrné, že musí být vázán na elektronegativní atom, který způsobí jeho odstínění. Tento atom uhlíku tedy musí ležet v sousedství atomu dusíku, a tím dojde k uzavření cyklu s alifatickým uhlíkem 60.8. Přítomnost tohoto cyklu ve struktuře neznámé sloučeniny potvrzuje korelace atomu vodíku δ=2.72-3.01 ppm (navázaný na atomu uhlíku 28.3) na atom uhlíku 60.8 a korelace atomu vodíku δ=2.72-3.01 ppm (navázaný na atom uhlíku 52.6) na tentýž atom uhlíku 60.8 (viz obr.7). 16

Výsledky s komentářem Atom uhlíku 60.8 má korelaci na atom vodíku δ=4.36 ppm, který je navázán na atom uhlíku 54.1. Z důvodu této korelace a z výrazného chemického posunu atomu uhlíku 54.1 jsem určila, že atom uhlíku 54.1 bude třetím atomem uhlíku navázaným na atom dusíku. Tento předpoklad jsem si potvrdila také korelací atomu vodíku δ=3.71 ppm (je navázán na atomu uhlíku 54.1) na atom uhlíku 52.6 (viz obr.8). Atom vodíku δ=2.72-3.01 ppm, který je navázán na atom uhlíku 35.6, má slabou korelaci (přes dvě vazby) na atom uhlíku 60.8. Atom uhlíku 35.6 bude tedy ležet v těsném sousedství atomu uhlíku 60.8. Z výše uvedeného rozboru vyplynulo, že atom uhlíku 35.6 je vázán na druhé aromatické jádro (korelace atomu vodíku δ=3.36-3.47 ppm na aromatický atom uhlíku 119.8). Vazbou atomu uhlíku 60.8 na atom uhlíku 35.6 jsem tedy spojila obě aromatická jádra do jednoho skeletu (viz obr.9). Na druhé aromatické jádro bude napojen i atom uhlíku 54.1. Toto tvrzení dokazuje korelace atomu vodíku δ=4.36 ppm i δ=3.71 ppm (oba jsou navázány na atom uhlíku 54.1) na atom uhlíku 119.8 a korelace atomu vodíku δ=4.36 ppm na atom uhlíku 127.1 i na atom uhlíku 143.7. Atom uhlíku 54.1 bude na druhé aromatické jádro vázán v poloze 3, tedy přes atom uhlíku 119.8 (viz obr.9). 17

Výsledky s komentářem Ještě mi zbývalo rozhodnout, na kterém atomu kyslíku je navázaná methylová skupina a který atom kyslíku nese atom vodíku a tvoří fenolickou skupinu. Podle experimentu ghmqc má jedna metylová skupina s chemickým posunem δ=3.82 ppm korelaci na atom uhlíku 148.4 a druhá na uhlík 146.8. Methoxy skupiny budou navázané na atomy uhlíku 148.4 a 146.8 (viz obr.10). Tím jsem určila strukturu celé sloučeniny se sumárním vzorcem: C 19 H 21 NO 4. 1 H NMR: (300 MHz, CD 3 OD) δ 6.84 (1H, d, J=8.5 Hz, H10); 6.76 (1H, s, H1); 6.70 (1H, s, H4); 6.69 (1H, d, J=8.5 Hz, H11); 4.36 (1H, d, J=15.7 Hz, H7); 3.89-3.76 (1H, m, NCH); 3.82 (3H, s, OCH 3 ); 3.82 (3H, s, OCH 3 ); 3.71 (1H, d, J=15.7 Hz, H7); 3.47-3.36 (2H, m, H6, H12); 3.21-3.04 (1H, m, H5); 3.01-2.72 (3H, m, H5, H6, H12). 13 C NMR: (75 MHz, CD 3 OD) δ 148.4, 146.8, 146.6, 143.7, 128.7, 127.1, 125.1, 120.1, 119.8, 113.1, 112.5, 111.7, 60.8, 56.5, 56.3, 54.1, 52.6, 35.6, 28.3. ESI-MS m/z 328 [M+H] + 18

19 Výsledky s komentářem

Výsledky s komentářem 4.3. LC-006 Neznámá sloučenina s kódovým označením LC10-4 byla získána izolací z rostliny Eschscholtzia californica z čeledi Papaveraceae. V klasickém 1 H-NMR spektru jsem si podle poměru integrálů určila, kolik atomů vodíku připadá jednotlivým signálům. V aromatické oblasti bylo zřetelně pozorováno 5 signálů při chemickém posunu δ=6.40 ppm, δ=6.53 ppm, δ=6.59 ppm, δ=6.73 ppm, δ=6.77 ppm, které náleží pěti atomům vodíku navázaným na aromatickém jádře. Signály s chemickým posunem δ=6.40 ppm a δ= 6.53 ppm nejsou štěpené, což je v aromatickém systému typické pro atomy vodíku navázané na jednom aromatickém jádře substituovaném v polohách 1, 2, 4 a 5 (viz obr.1), nebo pro izolované atomy vodíku na dvou různých aromatických jadrech. Signály s chemickým posunem δ=6.59 ppm, δ=6.73 ppm a δ=6.77 ppm jsou štěpené na dublet dubletů (interakční konstanta J=1.9 Hz, J=8.2 Hz), dublet s interakční konstantou J=8.2 Hz (δ=6.73 ppm) a dublet s interakční konstantou J=1.9 Hz (δ=6.77 ppm), což je štěpení typické pro atomy vodíku na aromatickém jádře substituovaném v polohách 1,2 a 4 (viz obr.2). H 6.53 H 6.77 5 1 4 2 4 2 H 6.59 1 H 6.40 H 6.73 obr.1 obr.2 Singlety s chemickými posuny δ=3.85 ppm a δ=3.84 ppm odpovídají podle integrálu šesti atomům vodíku. Chemický posun δ=3.85 ppm a δ=3.84 ppm je typický pro methoxy skupinu na aromatickém jádře. Neznámá chemická látka tedy ve své struktuře obsahuje dvě methoxy skupiny na aromatickém jádře. Dále jsem určila, že singletu s chemickým posunem δ=2.45 ppm odpovídají 3 atomy vodíku. Z chemického posunu, který je větší než chemický posun odpovídající methylové skupině vázané na kvarterní atom uhlíku, jsem určila, že se jedná o methylovou skupinu navázanou na heteroatom, který způsobí odstínění. Z 1 H-NMR spektra je patrné, že signál s chemickým posunem δ=3.66 ppm, odpovídající jednomu atomu vodíku, je štěpen na triplet. Musí být tedy v sousedství CH 2 skupiny. Chemický posun také napovídá, že v sousedství CH skupiny bude elektronegativní atom způsobující odstínění. Ve spektru je také vidět široký singlet s chemickým posunem δ=5.63 ppm, který náleží atomu nebo atomům vodíku na heteroatomu. 20

Výsledky s komentářem Signály s chemickým posunem δ=3.25-2.49 ppm náleží dalším 9 alifatickým atomům vodíku. V 13 C-NMR spektru se nachází 19 signálů, které náleží atomům uhlíku neznámé chemické sloučeniny, 12 z nich leží v aromatické oblasti. Neznámá sloučenina obsahuje 2 aromatická jádra a atomy vodíku s chemickým posunem δ=6.40 ppm a δ=6.53 ppm musí tedy ležet na jednom aromatickém jádře. 4 signály se nachází v oblasti okolo 145 ppm, což je chemický posun typický pro atomy uhlíku aromatického jádra, na které je navázaný atom kyslíku. Pomocí ghsqc experimentu jsem určila, příslušnost atomů vodíku k jednotlivým atomům uhlíku: C (120.8)..H(6.59) C(115.5)..H(6.77) C(113.6)..H(6.40) C(110.5)..H(6.53) C(110.4)..H(6.73) C(64.5)....H(3.66) C(55.9)...H(3.85) C(55.8)...H(3.84) C(46.8)...H(2.65-2.87; 3.10-3.25) C(42.5)...H(2.45) C(41.0)...H(2.65-2.87; 3.01) C(25.1)...H(2.49-2.63; 2.65-2.87) Správnost přiřazení atomů vodíku k jednotlivým atomům uhlíku jsem si zkontrolovala pomocí experimentu DEPT. Z tohoto experimentu jsem určila, že atomy uhlíku s chemickým posunem 145.2, 145.0, 144.9, 143.3, 130.5 a 125.4 jsou kvarterní, což odpovídá tomu, že v experimentu ghsqc jim nebyl přiřazen žádný atom vodíku. Methinové jsou atomy uhlíku 120.8, 115.5, 113.6, 110.5, 110.4 a 64.5. Methylenovým skupinám náleží atomy uhlíku při chemických posunech 46.8, 41.0 a 25.1. Atomy uhlíku 55.9, 55.8 a 42.5 jsou methylové. Rozmístění atomů vodíku na aromatickém jádře jsem si zkontrolovala pomocí experimentu gmqfcops. Atomy vodíku s chemickým posunem δ=6.59 ppm a δ=6.73 ppm mají v tomto experimentu vzájemnou korelaci, což je v souladu s mým předpokladem, že leží na aromatickém jádře vedle sebe. Ostatní aromatické atomy vodíku v gmqfcops žádnou korelaci nemají, leží tedy izolovaně. V alifatické části je výrazná korelace atomu vodíku δ=3.66 ppm (na atomu uhlíku 64.5) a atomů vodíku δ=3.01 ppm a δ=2.65-2.87 ppm (oba na atomu uhlíku 41.0). Tyto atomy vodíku musí být v neznámé sloučenině umístěny vedle sebe (viz obr.3). Umístění CH 2 skupiny vedle atomu uhlíku, na kterém je navázaný atom vodíku δ=3.66 ppm odpovídá štěpení signálu atomu vodíku δ=3.66 ppm na triplet. 21

Výsledky s komentářem Pomocí ghmqc experimentu jsem určila, které kvarterní atomy uhlíku leží na jednotlivých aromatických jádrech. Atom vodíku s chemickým posunem δ=6.40 ppm má z kvarteních atomů uhlíku korelaci na atomy uhlíku 125.4, 145.0 a 143.3. Korelace na uhlík 143.3 je výrazně menší, jedná se pravděpodobně o méně výraznou korelaci přes dvě vazby. Tento atom uhlíku je tedy pravděpodobně umístěn v poloze 2 nebo 4 na aromatickém jádře podle číslování na obr.1. Korelace na atomy uhlíku 125.4 a 145.0 jsou korelace přes 3 vazby, tyto uhlíky se tedy nachází v polohách 1 nebo 5 na aromatickém jádře (viz obr.4). Atom vodíku δ=6.53 ppm má korelace na atomy uhlíku 130.5, 145.0 a 143.3. Korelace na atom uhlíku 145.0 je slabší, jedná se tedy o korelaci přes dvě vazby, což neodporuje umístění uhlíku 145.0 v poloze 1 nebo 5 na aromatickém jádře podle jeho korelace na atom vodíku δ=6.40 ppm. Korelace atomu vodíku δ=6.53 ppm přes tři vazby na atomy uhlíku 130.5 a 143.3 je důvodem jejich umístění v polohách 2 a 4 na aromatickém jádře (viz obr.4). Atomy uhlíku, které nesou navázané atomy vodíku, jsem už určila pomocí experimentu ghsqc. Atom vodíku δ=6.77 ppm má korelace na atomy uhlíku 120.8 a 144.9. Atom uhlíku 120.8 na sobě nese navázaný atom vodíku δ=6.59 ppm a již jsem ho umístila do polohy 5 na druhém aromatickém jádře, podle štěpení signálu jeho atomu vodíku (viz obr.2). Další poloha, která je ve vzdálenosti tří vazeb od atomu vodíku δ=6.77 ppm, je poloha 1. Zde je tedy umístěn atom uhlíku 144.9. Tomu odpovídá i jeho korelace přes tři vazby na atom vodíku δ=6.59 ppm. Atom vodíku δ=6.73 ppm má korelace na atomy uhlíku 133.3 a 145.2. Tyto atomy uhlíku jsou tedy umístěny v polohách 2 nebo 4 na druhém aromatickém jádře (viz obr.5). Zbývající 3 atomy uhlíku druhého aromatického jádra, na které jsou navázány atomy vodíku, jsem již určila pomocí experimentu ghsqc. 22

Výsledky s komentářem V dalším kroku jsem řešila napojení alifatických atomů uhlíku na aromatická jádra, což mi umožnil 2D experiment ghmqc. Atom vodíku s chemickým posunem δ=6.40 ppm má korelaci na atom uhlíku 64.5. Aby atom uhlíku ležel ve vzdálenosti tří vazeb od atomu vodíku δ=6.40 ppm, musí být na aromatické jádro navázán v poloze 2, nebo 4. Již jsem určila, že v poloze 2 tohoto aromatického jádra se nachází buď atom uhlíku 130.5, nebo atom uhlíku 143.3. Podle chemických posunů těchto uhlíkových atomů jsem rozhodla, že atom uhlíku 64.5 bude na aromatické jádro vázám přes atom uhlíku 130.5, protože z chemického posunu atomu uhlíku 143.3 vyplývá, že na něho bude navázán atom kyslíku (viz obr.6). Atom vodíku δ=6.53 ppm má korelaci na alifatický atom uhlíku 25.1. Tento atom uhlíku musí ležet ve vzdálenosti tří vazeb od atomu vodíku δ=6.53 ppm, bude tedy vázán v polohách 1, nebo 5. V těchto polohách leží buď atom uhlíku 125.4, a nebo atom uhlíku 145.0. Obdobnou úvahou jako v předchozím případě jsem rozhodla, že atom uhlíku 25.1 bude na aromatické jádro vázán přes atom uhlíku 125.4 (viz obr.6). Pomocí ghmqc experimentu jsem také určila vzájemnou polohu atomů uhlíku 125.4 a 130.5. Atom vodíku δ=3.66 ppm (na atomu uhlíku 64.5) má korelaci na atom uhlíku 125.4 a atom vodíku δ=2.49-2.63 ppm (na uhlíku 25.1) má korelaci na atom uhlíku 130.5. Atomy uhlíku 125.4 a 130.5 musí ležet na aromatickém jádře vedle sebe (viz obr.6). Atomy vodíku δ=6.59 ppm a δ=6.77 ppm mají korelaci na atom uhlíku 41.0. Aby byla splněna podmínka, že tento atom uhlíku musí ležet ve vzdálenosti tří vazeb od obou atomů vodíku, musí být na aromatické jádro navázán v poloze 4. V této poloze leží buď atom uhlíku 133.3, nebo atom uhlíku 145.2. Obdobně jako v předchozích případech jsem určila, že atom uhlíku 41.0 bude navázán na atom uhlíku 133.3 (viz obr.7). Podle experimentu gmqfcops jsem určila, že atomy uhlíku 64.5 a 41.0 leží vedle sebe (obr.3). To znamená, že tento alifatický řetězec spojuje obě aromatická jádra. Tento předpoklad jsem si potvrdila podle korelací atomu vodíku δ=3.66 ppm (je navázán na atomu uhlíku 64.5) na atom uhlíku 133.3 a atomu vodíku δ=3.01 ppm (náleží atomu uhlíku 41.0) na atom uhlíku 130.5 (viz obr.8). 23

Výsledky s komentářem V dalším kroku jsem určila atom, nebo skupinu, která je navázaná na atom uhlíku 25.1, který substituuje aromatické jádro. Chemický posun 25.1 ppm je příliš malý, aby byl tento uhlík vázán na heteroatom. Musí být tedy navázán na uhlíkový atom. Pokud by tento uhlíkový atom nesl navázané atomy vodíku, projevilo by se to korelacemi v experimentech gmqfcops a ghmqc. V experimentu ghmqfcops má atom vodíku δ=2.49-2.63 ppm korelaci na atom vodíku δ=3.10-3.25 ppm. Tento atom vodíku je podle ghsqc navázán na atom uhlíku 46.8. Atom vodíku δ=3.10-3.25 ppm má v ghmqc korelaci na atom uhlíku 125.4. Tato korelace potvrzuje můj předpoklad, že atom uhlíku 46.8 je navázán na atom uhlíku 25.1 (viz obr.9). Od neznámé sloučeniny byla naměřena MS spektra. Molekulový pík této látky byl 330. Podle 13 C-NMR spektra je patrné, že sloučenina obsahuje 19 atomů uhlíku a podle 24

Výsledky s komentářem chemických posunů 4 atomů uhlíku δ=143.3 ppm, δ=144.9 ppm, δ=145.0 ppm a δ=145.2 ppm je zřejmé, že se ve sloučenině nachází 4 atomy kyslíku. Z 1 H-NMR spektra jsem určila, že sloučenina obsahuje pouze 2 methoxy skupiny na aromatickém jádře, na další 2 atomy kyslíku musí tedy být navázán atom vodíku tvořící fenolickou skupinu. Široký singlet s chemickým posunem δ=5.63 ppm musí odpovídat dvěma atomům vodíku a celá sloučenina tedy obsahuje 23 atomů vodíku. Pokud sečtu molární hmotnosti 19 atomů uhlíku, 23 atomů vodíku a 4 atomů kyslíku, dostanu číslo 315. Celková molární hmotnost neznámé sloučeniny je 329, zbývá mi tedy 14, což je přesně molární hmotnost jednoho atomu dusíku. Atom dusíku nemůže být vázán na aromatické jádro, protože substituenty obou aromatických jader jsou již přiřazeny. Musí být tedy vázán v alifatické oblasti. V alifatické části jsem ještě neurčila substituenty na atomech uhlíku 64.5 a 46.8 a umístění methylové skupiny atomu uhlíku 42.5. Z chemického posunu těchto atomů je patrné, že jsou odstíněné, jedinou možností je tedy jejich vazba na atom dusíku. Cyklizaci alifatického řetězce uhlíků 25.1 a 46.8 pomocí atomu dusíku s atomem uhlíku 64.5 jsem si ověřila v ghmqc experimentu. Tuto teorii dokazují korelace atomu vodíku δ=3.66 ppm (na atomu uhlíku 64.5) s atomem uhlíku 46.8 a korelace atomu vodíku δ=3.10-3.25 ppm (na atomu uhlíku 46.8) s atomem uhlíku 64.5 (viz obr.10). Umístění methylové skupiny na atom dusíku potvrzují kromě chemického posunu také korelace jejího atomu uhlíku (42.5) s atomy vodíku δ=3.66 ppm (na atomu uhlíku 64.5) a δ=3.10-3.25 ppm (na atomu uhlíku 46.8), stejně tak jako korelace jejích atomů vodíku δ=2.45 ppm na atomy uhlíku 64.5 i 46.8 (viz obr.10). Výše uvedenou úvahou jsem určila skelet neznámé sloučeniny a ještě mi zbývalo rozhodnout o umístění fenolických a methoxy skupin na aromatických jádrech. Pomocí experimentu ghmqc však přiřazení není možné, protože v 1 H-NMR spektru mají methoxy skupiny signály, které se překrývají, nelze tedy rozlišit, které methoxy skupině náleží jednotlivé korelace na atomy uhlíku. V této situaci bylo třeba použít experimenty na prostorovou blízkost, pomocí kterých lze určit vzájemné ovlivnění substituentů v prostoru. Pro toto zjištění se využívají NOE-experimenty. Pomocí experimentu dpfgnoe jsem zjistila, 25

Výsledky s komentářem že atomy vodíku methoxy skupiny (δ=3.85 ppm, δ=3.84 ppm) jsou v prostorové blízkosti atomů vodíku δ=6.53 ppm a δ=6.73 ppm. Atomy vodíku δ=6.53 ppm a δ=6.73 ppm jsou každý na jiném aromatickém jádře, methoxy skupiny tedy budou ležet na různých jádrech a umístěny tak, aby byly v prostorové blízkosti těchto atomů vodíku. První methoxy skupina je v prostorové blízkosti atomu vodíku δ=6.53 ppm, musí být tedy navázaná na atom uhlíku 145.0 ppm (viz obr.11). Toto umístění jsem si zkontrolovala pomocí experimentu dpfgnoe zjištěním, které atomy vodíku leží v prostorové blízkosti atomu vodíku δ=6.40 ppm. Methoxy skupina v prostorové blízkosti atomu vodíku δ=6.40 ppm neleží, což odpovídá mému předpokladu. V prostorové blízkosti atomu vodíku δ=6.40 ppm leží pouze alifatický atom vodíku δ=3.66 ppm (viz obr.11). Druhá methoxy skupina se musí nacházet v prostorové blízkosti atomu vodíku δ=6.73 ppm. Musí být tedy vázána na atom uhlíku 144.9 (viz obr.11). Tím jsem dokončila určení struktury neznámé sloučeniny se sumárním vzorcem C 19 H 23 NO 4. 1 H NMR: (300 MHz, CDCl 3 ) δ 6.77 (1H, d, J=1.9 Hz, H2 ); 6.73 (1H, d, J=8.2 Hz, H5 ); 6.59 (1H, dd, J=1.9 Hz, J=8.2 Hz, H6 ); 6.53 (1H, s, H5); 6.40 (1H, s, H8); 5.63 (2H, bs, OH), 3.85 (3H, s, OCH 3 ); 3.84 (3H, s, OCH 3 ); 3.66 (1H, t, J=6.0 Hz, H1); 3.25-3.10 (1H, m, H3); 3.01 (1H, dd, J=14.0 Hz, J=6.3 Hz, CH 2 ); 2.87-2.65 (3H, m, H3, H4, CH 2 ); 2.63-2.49 (1H, m, H4); 2.45 (3H, s, NCH 3 ). 13 C NMR: (75 MHz, CDCl 3 ) δ 145.2, 145.0, 144.9, 143.3, 133.3, 130.5, 125.4, 120.8, 115.5, 113.6, 110.5, 110.4, 64.5, 55.9, 55.8, 46.8, 42.5, 41.0, 25.1. ESI-MS m/z 330 [M+H] + 26

Výsledky s komentářem 3.85 55.9 O HO 6.53 2.65-2.87 2.49-2.63 110.5 25.1 145.0 125.4 46.8 143.3 113.6 6.40 130.5 3.66 64.5 3.01 2.65-2.87 41.0 6.59 N 3.10-3.25 2.65-2.87 42.5 6.77 133.3 115.5 120.8 110.4 6.73 2.45 OH 145.2 144.9 55.8 O 3.84 27

Výsledky s komentářem 4.4. LC10-4 Neznámá sloučenina s kódovým označením LC10-4 byla získána izolací z rostliny Eschscholtzia californica z čeledi Papaveraceae. Základní informace o struktuře neznámé sloučeniny jsem získala prostudováním 1 H- NMR spektra. Z poměru integrálů jednotlivých píků, jsem určila počet atomů vodíku, které náleží k jednotlivým signálům. Podle chemických posunů jsem určila, že sloučenina obsahuje 5 atomů vodíků navázaných na aromatickém jádře. Jde o atomy vodíku s chemickým posunem δ=6.25 ppm, δ=6.53 ppm; δ=6.59 ppm; δ=6.74 ppm a δ=6.77 ppm. Na základě štěpení je velmi pravděpodobné, že sloučenina obsahuje nejméně 2 aromatická jádra. Po expandování této oblasti spektra je patrné štěpení jednotlivých signálů. Signály s chemickým posunem δ=6.25 ppm a δ=6.53 ppm jsou singlety, jde tedy o atomy vodíku navázané na jednom aromatickém jádře vzájemně v poloze para (aromatické jádro je substituováno v polohách 1, 2, 4 a 5), viz obr.1, nebo by se mohlo jednat o izolované atomy vodíku na dvou různých aromatických jádrech. Zbývající 3 atomy vodíku v aromatické oblasti mají štěpení: dublet dubletů δ=6.59 ppm s interakční konstantou J=1.9 Hz, J=8.2 Hz, dublet δ=6.74 ppm s interakční konstantou J=8.2 Hz a dublet δ=6.77 ppm s interakční konstantou J=1.9 Hz. Toto štěpení je typické pro atomy vodíku na aromatickém jádře substituovaném v polohách 1, 2 a 4 (viz obr.2). Signály s chemickým posunem δ=5.87 ppm a δ=5.85 ppm podle integrálu odpovídají každý jednomu atomu vodíku. Podle chemického posunu by se mohlo jednat o dva aromatické atomy vodíku, o dvě silně odstíněné CH skupiny nebo o CH 2 skupinu, která je navázaná na silně elektronegativní atom, nebo atomy. Rozhodnutí mezi těmito možnostmi mi umožní až přiřazení atomů vodíku k jednotlivým atomům uhlíku pomocí experimentu ghsqc. Singlet s chemickým posunem δ=3.86 ppm odpovídá třem atomům vodíku. Chemický posun 3.86 je typický pro methoxy skupinu navázanou na aromatickém jádře. Obdobně singlet s chemickým posunem δ=2.46 ppm odpovídá třem atomům vodíku, jde tedy o CH 3 skupinu. Chemický posun δ=2.46 ppm je příliš velký na to, aby se dalo 28

Výsledky s komentářem uvažovat o skupině navázané na kvarterním atomu uhlíku. Jde tedy o CH 3 skupinu, která je navázaná na elektronegativní atom. Z chemického posunu vyplývá, že by se mohlo jednat buď o atom dusíku, nebo atom síry. Signál s chemickým posunem δ=3.67 ppm je štěpený na triplet, z čehož jsem usoudila, že musí mít v těsném sousedství 2 atomy vodíku, pravděpodobně CH 2 skupinu. Chemický posun svědčí o odstínění. V sousedství musí být buď atom, nebo skupina způsobující výrazné odstínění. Ostatní signály ve spektru (δ=3.23-2.50 ppm) odpovídají dalším 6 alifatickým vodíkovým atomům. Z 13 C-NMR spektra jsem zjistila, že 12 atomů uhlíku má chemický posun větší než 100 ppm. Sloučenina tedy obsahuje 2 aromatická jádra. Chemický posun okolo 145 ppm je typický pro uhlíkové atomy aromatického jádra, na které je navázaný atom kyslíku. Dalších 6 atomů uhlíku má chemický posun menší než 70 ppm. Jedná se o alifatické uhlíky. Pomocí 2D experimentu ghsqc jsem mohla přiřadit jednotlivé vodíky příslušným uhlíkům: C (120.9)..H(6.59) C(115.5)..H(6.77) C(110.4)..H(6.74) C(108.3)..H(6.53) C(107.8)..H(6.25) C(100.5)..H(5.85; 5.87) C(65.1)....H(3.67) C(55.9) H(3.86) C(46.5)...H(2.67-2.87; 3.10-3.23) C(42.5)....H(2.46) C(41.0)....H(2.67-2.87; 3.02) C(25.6)....H(2.50-2.61; 2.67-2.87) Atomy uhlíku s chemickým posunem 145.7; 145.3, 144.9; 133.2; 130.8 a 127.1 jsou kvarterní. Atomy vodíku s chemickým posunem δ=5.87 ppm a δ=5.85 ppm náleží jednomu atomu uhlíku. Jedná se tedy o silně odstíněnou CH 2 skupinu. V důsledku toho je ve spektru pouze 11 uhlíkových atomů náležících aromatického systému. Je pravděpodobné, že 2 atomy uhlíku budou mít velice podobné chemické posuny, jedná se o atomy uhlíku s chemickým posunem 145.3 ppm, což vyplývá z integrálu tohoto signálu. V 2D experimentu gmqfcops je patrné rozložení atomů vodíků na aromatických jádrech. Vodíkový atom s chemickým posunem δ=6.59 ppm má korelaci na atom s chemickým posunem δ=6.74 ppm, což mému rozvržení odpovídá, protože tyto atomy leží na aromatickém jádře vedle sebe. Ostatní vodíkové atomy aromatického systému na sebe korelaci nemají, nejsou tedy na aromatickém jádře vázány vedle sebe. 29

Výsledky s komentářem V alifatické oblasti je výrazná korelace tripletu δ=3.67 ppm na dva vodíkové atomy CH 2 skupiny (δ=2.67-2.87 ppm; δ=3.02 ppm), což odpovídá rozštěpení signálu na triplet (viz obr.3). Pomocí 2D experimentu ghmqc jsem nejdříve určila, které kvarterní atomy uhlíku patří jednotlivým aromatickým jádrům. Aromatické jádro s dvěma atomy vodíku v para poloze vůči sobě musí obsahovat další 4 kvarterní atomy uhlíku. Jsou to atomy uhlíku s chemickým posunem 127.1, 145.7 (díky korelaci na atom vodíku s chemickým posunem δ=6.25 ppm) a atomy uhlíku s chemickým posunem 130.8, 145.3 (díky korelaci na atom vodíku s chemickým posunem δ=6.53 ppm), viz obr.4. Na druhé aromatické jádro jsou navázány 3 atomy vodíku, musela jsem tedy přiřadit další 3 kvarterní atomy uhlíky. Prvním z přiřazených atomů je atom uhlíku s chemickým posunem 144.9 z důvodu jeho korelace s atomem vodíku s chemickým posunem δ=6.59 ppm. Díky této korelaci jsem mohla přesně určit jeho umístění v poloze 1 aromatického jádra substituovaného v polohách 1, 2 a 4. Další pozorovatelná korelace atomu vodíku δ=6.59 ppm je na atom uhlíku 115.5, který nese atom vodíku δ=6.77 ppm jehož umístění jsem už určila z 1 H spektra. Správnost umístění atomu uhlíku 144.9 jsem si potvrdila jeho korelací přes tři vazby s atomem vodíku δ=6.77 ppm. Z korelací s atomem vodíku δ=6.74 ppm jsem určila zbývající kvarterní atomy uhlíku: 133.2 a 145.3 (viz obr.5). Dalším mým krokem bylo určení napojení alifatických řetězců na aromatická jádra. Určení jsem prováděla pomocí korelací atomů vodíku na aromatickém systému s alifatickými atomy uhlíku. Atom vodíku δ=6.25 ppm má korelaci na atom uhlíku 65.1. Protože jde o 30

Výsledky s komentářem korelaci přes tři vazby, je tento atom uhlíku (65.1) vázán na aromatické jádro v poloze ortho vůči atomu vodíku δ=6.25 ppm. Už jsem určila, že vedle atomu uhlíku 107.8 jsou atomy uhlíku s chemickým posunem 145.3 a 130.8. Chemický posun 145.3 odpovídá vazbě na atom kyslíku. Alifatický atom uhlíku 65.1 bude tedy na aromatické jádro připojen přes atom uhlíku 130.8 (viz obr.6). Tuto úvahu jsem si zkontrolovala pomocí korelace atomu vodíku δ=3.67 ppm navázaném na uhlíku 65.1, který má korelaci na atom uhlíku 130.8 a nemá korelaci na atom uhlíku 145.3. Atom vodíku δ=6.53 ppm má korelaci na atom uhlíku 25.6. Obdobným postupem jako v případě atomu uhlíku 65.1 jsem dospěla k závěru, že atom uhlíku 25.6 je na aromatické jádro vázán přes atom uhlíku 127.1 (viz obr.6). Díky korelacím atomu uhlíku 130.8 s atomem vodíku δ=2.50-2.61 ppm (navázaným na uhlík 25.6) a atomu uhlíku 127.1 s atomem vodíku δ=3.67 ppm (vázáným na uhlík 65.1) jsem určila, že atomy uhlíku 130.8 a 127.1 jsou na aromatickém jádře vedle sebe a alifatické uhlíky 65.1 a 25.6 leží na stejné straně vůči atomům vodíku δ=6.25 ppm a δ=6.53 ppm. Atom uhlíku 41.0 má korelaci na atomy vodíku δ=6.59 ppm a δ=6.77 ppm, z čehož vyplývá, že musí být vázán na aromatické jádro v poloze 4. V této poloze je buď atom uhlíku 133.2, nebo atom uhlíku 145.3. Obdobně jako v minulém případě bude na atom uhlíku 145.3 vázán atom kyslíku a atom uhlíku 41.0 bude vázán na aromatické jádro přes atom uhlíku 133.2 (viz obr.7). Z gmqfcops experimentu jsem už určila, že CH skupina uhlíku 65.1 se nachází v sousedství CH 2 skupiny uhlíku 41.0. CH skupina uhlíku 65.1 je vázána na jedno jádro a CH 2 skupina uhlíku 41.0 na jádro druhé. Z toho plyne, že obě aromatická jádra jsou spojena alifatickým fragmentem CH(65.1)-CH 2 (41.0), viz obr.8. Tuto úvahu jsem zkontrolovala pomocí korelace atomu vodíku δ=3.67 ppm (na uhlíku 65.1) s uhlíkem 133.2 (náleží vzdálenějšímu jádru) a korelace atomu vodíku δ=3.02 ppm (na uhlíku 41.0) s uhlíkem 130.8. 31

Výsledky s komentářem Dalším mým krokem v určování struktury neznámé látky bylo určení druhého substituentu CH 2 skupiny uhlíku 25.6 (jednou vazbou je vázána na aromatické jádro). Chemický posun atomu uhlíku je 25.6 ppm, což je v oblasti vyššího pole. Tento chemický posun vylučuje vazbu na elektronegativní atom typu např. kyslíku nebo dusíku. CH 2 skupina tedy musí být vázaná na atom uhlíku. Z gmqfcops experimentu není jasné, zda korelace atomu vodíku δ=2.50-2.61 ppm s atomem vodíku δ=2.67-2.87 ppm je korelací mezi diastereotopickými atomy vodíku téhož atomu uhlíku, nebo mezi dvěma sousedními atomy vodíku náležící dvěma různým atomům uhlíku. Pokud by šlo o korelaci dvou sousedních atomů vodíku, sousedil by s atomem uhlíku 25.6 atom uhlíku 46.5 nebo 41.0. Atom uhlíku 41.0 to být nemůže, protože je jasně potvrzeno, že leží vedle atomu uhlíku 65.1 a vedle druhého aromatického jádra. Z ghmqc experimentu vyplývá korelace atomu vodíku δ=3.10-3.23 ppm s atomem uhlíku 127.1. Z toho vyplývá, že v sousedství atomu uhlíku 25.6 je CH 2 skupina atomu uhlíku 46.5 (viz obr.9). H 127.1 H 2 C 25.6 H3.10-3.23 46.5 H 2.67-2.87 H C R 1 R 2 H H H 2 C H H obr.9 32

Výsledky s komentářem V alifatické části mi zůstaly nevyřešené volné vazby z atomů uhlíku 65.1 a 46.5 a také methylová skupina atomu uhlíku 42.5. Všechny tyto atomy uhlíku jsou odstíněny, musí tedy být vázané na elektronegativní atom. V případě dvojvazného kyslíku by mi zbyla neumístěná methylová skupina a atomy uhlíku by byly mnohem více odstíněné. Jediným řešením je vazba těchto tří atomů uhlíku přes trojvazný atom dusíku. Tuto úvahu jsem si zkontrolovala součtem molárních hmotností všech atomů ve sloučenině. Z údajů získaných z hmotnostního spektra vím, že neznámá sloučenina má molekulový pík M = 328 (M = M R +1) a tedy molární hmotnost 327. Zatím jsem při tvorbě struktury sloučeniny použila 19 atomů uhlíku, 21 atomů vodíku a 4 atomy kyslíku. Sečtením jejich molárních hmotností jsem dostala číslo 313. Když jsem ho odečetla od celkové molární hmotnosti neznámé sloučeniny, dostala jsem číslo 14, což je přesně molární hmotnost jednoho atomu dusíku. Uzavření alifatických řetězců do kruhu potvrzují korelace atomu uhlíku 65.1 s atomem vodíku δ=3.10-3.23 ppm (vázán na atomu uhlíku 46.5) a korelace atomu uhlíku 46.5 s atomem vodíku δ=3.67-3.87 ppm (vázán na atomu uhlíku 65.1). Umístění methylové skupiny potvrzují korelace jejích atomů vodíku (δ=2.46 ppm) na oba atomy uhlíku, 65.1 i 46.5 (viz obr.10). Umístění methoxy skupiny jsem určila pomocí experimentu ghmqc. Atomy vodíku methoxy skupiny (δ=3.86 ppm) mají korelaci na atom uhlíku 144.9. Methoxy skupina je tedy navázaná na atom uhlíku 144.9 a atom uhlíku 145.3 na témže aromatickém jádře nese hydroxylovou skupinu (viz obr.11). Dalším problémem bylo umístění atomu uhlíku s chemickým posunem 100.5, na který jsou navázané 2 atomy vodíku s chemickým posunem δ=5.87 ppm a δ=5.85 ppm. Chemický posun napovídá silnému odstínění. Jedinou korelací atomů vodíku této skupiny je korelace s atomem uhlíku 145.3. Tato skupina bude tedy navázaná přes atom kyslíku na atom uhlíku 145.3 a vytvoří můstek na vedlejší atom kyslíku navázaný na sousedním atomu uhlíku 33

Výsledky s komentářem aromatického jádra (145.7), viz obr.11. Chemický posun atomu uhlíku (100.5) i atomů vodíku (δ=5.87 ppm a δ=5.85 ppm) této CH 2 skupiny odpovídá jejímu umístění mezi dvěma atomy kyslíku, které jsou silně elektronegativní a způsobí silné odstínění. Tím jsem dokončila určení struktury neznámé látky. Sloučenina má sumární vzorec C 19 H 21 NO 4 a tedy molární hmotnost 327. 1 H NMR: (300 MHz, CDCl 3 ) δ 6.77 (1H, d, J=1.9 Hz, H2 ); 6.74 (1H, d, J=8.2 Hz, H5 ); 6.59 (1H, dd, J=1.9 Hz, J=8.2 Hz, H6 ); 6.53 (1H, s, H5); 6.25 (1H, s, H8); 5.87 (1H, d, J=1.5 Hz, OCH 2 ), 5.85 (1H, d, J=1.5 Hz, OCH 2 ); 3.86 (3H, s, OCH 3 ); 3.67 (1H, t, J=6.2 Hz, H1); 3.23-3.10 (1H, m, H3); 3.02 (1H, dd, J=14.0 Hz, J=6.1 Hz, CH 2 ); 2.87-2.67 (3H, m, H3, H4, CH 2 ); 2.61-2.50 (1H, m, H4); 2.46 (3H, s, NCH 3 ). 13 C NMR: (75 MHz, CDCl 3 ) δ 145.7, 145.3, 145.3, 144.9, 133.2, 130.8, 127.1, 120.9, 115.5, 110.4, 108.3, 107.8, 100.5, 65.1, 55.9, 46.5, 42.5, 41.0, 25.6. ESI-MS m/z 328 [M+H] + 34

35 Výsledky s komentářem

Závěr 5. ZÁVĚR V rámci této diplomové práce byla určena struktura 3 neznámých sloučenin získaných izolací z rostliny Eschscholtzia californica (sluncovka kalifornská) z čeledi Papaveracea provedenou na katedře farmaceutické botaniky a ekologie Farmaceutické fakulty v Hradci Králové. Neznámá látka s kódovým označením LC-004 byla identifikována jako skulerin a její struktura byla ověřena na základě porovnání naměřeného 13 C-NMR spektra se spektry v literatuře 9. Neznámá látka s kódovým označením LC-006 je retikulin a porovnáním naměřeného 13 C-NMR spektra se spektry v literatuře 10 byla jeho identita potvrzena. Struktura látky s kódovým označením LC10-4 byla ověřena porovnáním naměřeného 1 H-NMR se spektrem v literatuře 11. 36

Literatura 6. LITERATURA 1. Beck M. A., Häberlein H., Phytochemistry, 1999, 50, 329-332. 2. Gafner S. et al., J. Nat. Prod. 2002, 69, 432-435. 3. Fabre N. et al., J.Chromatogr. A, 2000, 904, 35-46. 4. Větvička V., Letničky a dvouletky, 1.vydání, Praha, Aventinum, 1999, 223 s., ISBN 80-7151-078-5, 92-93. 5. Simon H., Letničky, 1.vydání, Čestlice, Rebo Productions, 2006, 95 s., ISBN 80-7234- 502-8, 52-53. 6. Blaschek, W. et al.: HagerROM 2006. Hagers Handbuch der Drogen und Arzneistoffe. CD-Realisierung: Informatik II, Universität Würzburg, [Programmversion 6.1], Springer Medizin Verlag Heidelberg 2006. 7. Slavík J., Slavíková L. Coll. Czech. Chem. Commun. 1986, 51, 1743-1751. 8. Doležal J., Biologická aktivita obsahových látek VIII. Vliv alkaloidů z různých rostlinných taxonů na acetylcholinesterázu. (Diplomová práce) Hradec Králové, Univerzita Karlova, Farmaceutická fakulta, 2008 9. Eisenreich W.J., Isolierung, Identifizierung und Partialsynthese von Pflanzeninhaltsstoffen aus Croton Flavens L. (disertační práce) München, Ludwig- Maximilians-Universität München, Fakultät für Chemie und Pharmazie, 2002, str.17. 10. Tosce S.G., Cooper S.D., Morello D.R., Hays P.A., Casale J.F., Casale E., J.Forensic Sci, 2006, 51, 308-320. 11. Pinna G.A., Cignarella G., Scolastico S., Porceddu S.C., Eur. J. Med. Chem., 1994, 29, 55-60. 37

Přílohy 7. PŘÍLOHY 7.1. NMR spektra sloučeniny LC-004 38

Přílohy 1 H-NMR 39

Přílohy 13 C-NMR 40

Přílohy DEPT 41

Přílohy ghsqc 42

Přílohy ghmqc 43

Přílohy 7.2. NMR spektra sloučeniny LC-006 44

Přílohy DEPT 47

Přílohy gmqfcops 48

Přílohy ghsqc 49

Přílohy ghmqc 50

Přílohy NMR spektra sloučeniny LC10-4 51

Přílohy gmqfcops 54

Přílohy ghsqc 55

Přílohy ghmqc 56