ANTIMIKROBIÁLNÍ ÚČINKY NANOVLÁKNITÝCH FILTRAČNÍCH MEMBRÁN PRO VODÁRENSKÉ TECHNOLOGIE Eva Trávníčková, Přemysl Mikula, Jakub Opršal, Marie Boháčová, Lubomír Kubáč, Dušan Kimmer, Jana Soukupová, Michal Bittner Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí, Masarykova univerzita, Kamenice 5, 625 00 Brno
Úvod filtrace jako nástroj pro čištění a úpravu vod - písková - membránová filtrace (mikro-, ultra-, nano-, reverzní osmóza) požadované vlastnosti: - vysoká účinnost odstraňování mikroorganismů - nejvyšší možný průtok ( úspora energie nižší náklady) - dlouhá životnost (mechanická odolnost, odolnost vůči zanášení) (SPUR Zlin, www.spur.cz)
Úvod zanášení membrány - tvorba mikrobiálních biofilmů (= biofouling) snížení účinnosti membrány hledání/použití pokročilých materiálů pro antimikrobiální účinky snížení adheze na membránu použití specifických polymerů přímý antimikrobiální účinek (https://commons.wikimedia.org/wiki/file:biofilm.jpg) Wageningen University & Research (www.wur.nl)
Materiál a metody ČSN ISO 20743 absorbční metoda resazurinová metoda kalibrace hodnocení vzorků membrány s obsahem QAS a AgNPs Escherichia coli CCM 3954 (G-, bf+) Enterococcus faecalis CCM 4224 (G+, bf-) Odtok ČOV (Ochozský potok, 1000 EO) https://static.wixstatic.com/media/72dee4_f35b2908c78c470ab8b91791778bb03e~mv2.png https://imgc.allpostersimages.com/img/print/posters/scientifica-escherichia-coli-bacteria-commonly-known-as-e-coli_a-g-9015336-14258389.jpg
Příprava membrán Membrány s obsahem QAS příprava PU: IDPI (isoforondiisokyanát) + 1,6-hexandiol v průběhu syntézy plynule přidávána QAS produkt naředěn DMF na 30% roztok zvláknění roztoku, multikanálová tryska 3 typy podpůrných vrstev: MFRF (microfiltration reinforced foam), PP, VS O CH 3 O HO Membrána s obsahem AgNPs roztok PU v DMF, s přídavkem síťovadla zvláknění roztoku podpůrná vrstva PP NH N + NH CH Br - 3 OH síťovadlo s funkčními skupinami s obsahem N navázány AgNPs
Resazurin - kalibrace max: 10 9 CFU/ml 10 8 min: 5 10 2 CFU/ml resazurin 20 µmol/ml v PBS koncentrace [CFU/ml] max min měření RFU λ ex = 520 nm λ em = 590 nm ihned po přidání resazurinu, 6 hod po 30 min
Resazurin - hodnocení membrán kultura v TSB, 10 5 CFU/ml voda z odtoku ČOV + TSB (1:1) S1 S2 C AB inkubace 4 h při 37 C resazurin 20 µmol/ml v PBS inkubace 30 min membrány odebrány měření RFU 6 hod po 30 min λ ex = 520 nm λ em = 590 nm
Hodnocení membrán dle ISO Antibakteriální účinnost dle ČSN ISO 20743 absorpční metoda kultivace bakteriální inokulum v TSB, 10 5 CFU/ml čas inkubace 0 h čas inkubace 4 h S1 S2 S3 C S1 S2 S3 C ke všem vzorkům přidán vytřepávací roztok (0,85% NaCl + Tween80), vortexováno vzorek zředěn, vyočkováno na agar, spočítány kolonie
F lu o re s c e n c e [R F U ]; 1 2 -w e ll p l. C o n c e n tra tio n [L o g C F U m L -1 ] Výsledky 1 2 0 0 0 1 0 0 0 0 8 0 0 0 6 0 0 0 4 0 0 0 2 0 0 0 0 0 1 0 0 2 0 0 3 0 0 4 0 0 5 0 0 6 0 0 7 0 0 T im e [m in ] 1 7 1 0 1 4 2 5 1 1 4 0 8 5 5 5 7 0 2 8 5 0 F lu o re s c e n c e [R F U ]; 9 6 -w e ll p l. C F U m L -1 6.0 E + 0 9 6.0 E + 0 8 6.0 E + 0 7 6.0 E + 0 6 6.0 E + 0 5 1.2 E + 0 5 2.4 E + 0 4 4.8 E + 0 3 9.6 E + 0 2 1.9 E + 0 2 0 1 0 0 2 0 0 3 0 0 4 0 0 5 0 0 6 0 0 7 0 0 E. coli: y = -0,0125x + 10,604, R 2 = 0,9993 v rozsahu 5,9 10 9 až 9,4 10 2 CFU/ml E. faecalis: y = 6 10-8 x 3 + 3 10-5 x 2 0.0174x + 8.1754, R² = 0.9778 v rozsahu 1,0 10 10 až 1,6 10 3 CFU/ml LOQ: 10 3 CFU/ml (pro obě bakterie, nejnižší bod kalibrační přímky/křivky) 1 0 9 8 7 6 5 4 3 2 T 2 0 0 0 [m in ] E n te r o c o c c u s fa e c a lis E s c h e r ic h ia c o li
RFU log CFU/ml Výsledky 16000 Metabolizační křivky bakterie + membrány 12 Množství bakterií po 4 hod. 14000 10 12000 10000 8000 6000 4000 QAS MFRF MFRF Ag ECOLI QAS PP PP 8 6 4 2 LOQ 2000 0 0 15 30 45 60 90 120 150 180 210 240 270 Čas [min] QAS VS VS 0 ecoli entflis odtok ČOV E. coli: y = -0,0125x + 10,604 [CFU/ml] E. faecalis: y = ax n ± [CFU/ml] odtok ČOV: dle E. coli [CFU EEQ /ml]
log CFU/ml log CFU/ml Výsledky 12 Množství bakterií po 4 hod. - resazurin 12 Množství bakterií po 4 hod. - kultivace 10 10 8 8 6 6 4 4 2 2 0 0 ecoli entflis odtok ČOV ecoli entflis
A [log CFU/ml] Výsledky 7 6 5 A = (logc 4h logc 0h ) (logs 4h logs 0h ) 4 3 2 1 0-1 A ecoli A entflis A wwtp resazurin kultivace antibakteriální účinnost Redukce CFU (log 10 ) A významná 2 A < 3 vysoká A 3
Tento výzkum byl podpořen projekty MPO (FV10323), MŠMT program NPU I (LO1504), RECETOX Research Infrastructure (LM2015051 and CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_013/0001761) a ERDF "Development of pre-applied research in nanotechnology and biotechnology" (No. CZ.02.1.01/0.0/0.0/17_048/0007323) Závěr screeningová metoda pro zjišťování antibakteriálních účinků membrán rychlá, jednoduchá přesností srovnatelná s ISO metodou nutnost předchozí kalibrace ale pouze u čistých kultur membrány s QAS nebyly dostatečně účinné membrána s AgNPs velmi účinná