Metody výzkumu patofyziologie volných radikálů Milan Číž 1
Metody detekce Chemiluminiscence Spektrofotometrie NBT-test redukce cytochromu C Elektronová spinová resonance Elektrochemie stanovení spotřeby kyslíku detekce NO Fluorimetrie (průtoková cytometrie) 2
Metody stanovení: volných radikálů aktivity zdrojů volných radikálů antioxidační aktivity biologických vzorků jednotlivých antioxidantů poškození biologických makromolekul 3
Spektrofotometrie superoxidový aniont: cytochrom C assay Princip metody je založen na redukci oxidovaného (Fe3+) cyt C superoxidovým aniontem na Fe2+ cyt C 550 nm NBT test: NBT je silný redoxní indikátor, který po redukci RKM tvoří nerozpustný diformazan, 605 nm nespecifický oxid dusnatý: Griessova reakce (nitrity, nitráty), detekční limit 100 nm, 548 nm. 4
Elektronová spinová resonance ESR (EPR) je spektroskopická metoda, která se zabývá mikrovlnnými přechody mezi energetickými stavy nepárových elektronů se spinem a orbitálním momentem hybnosti. 5
Elektrochemie oxid dusnatý: selektivní elektroda pro NO ostatní RKM stanovení spotřeby kyslíku 6
Průtoková cytometrie povrchové antigeny: MAb značené různými fluorescenčními značkami tvorba RMK neutrofily a makrofágy: Dichlorodihydrofluorescein diacetate peroxid vodíku, peroxynitrit Dihydrorhodamine 123 - peroxid vodíku, peroxynitrit Dihydroethidium bromide superoxidový anion. oxid dusnatý: 1,2-diaminoanthroquinone buněčný cyklus, buněčná viabilita: propidium iodide 7
Dichlorodihydrofluorescein diacetát Detekce H 2 O 2 ale i dalších intracelulárních oxidantů včetně oxidů dusíku Výhody shodná vlnová délka s fluoresceinem používána nejdelší dobu (od roku 1983) Nevýhody unikání z buněk nelze fixovat vysoká citlivost vůči světlu toxicita nezbytná aktivita esteráz 8
Dichlorodihydrofluorescein diacetát 9
Dihydrorhodamin Detekce H 2 O 2 ale i dalších intracelulárních oxidantů včetně oxidů dusíku Výhody až 10x vyšší citlivost oproti DCFH-DA stabilita - možnost fixace Nevýhody nespecifická detekce oxidantů závislost na mitochondriálním membránovém potenciálu? 10
Dihydrorhodamin 11
Dihydroethidium bromid Detekce O 2 - Výhody dobrá specificita pro O 2 - stabilita - možnost fixace Nevýhody HE katalyzuje dismutaci O 2 - toxický nelze použít současně s PI 12
Dihydroethidium bromid 13
Metody stanovení: volných radikálů aktivity zdrojů volných radikálů antioxidační aktivity biologických vzorků jednotlivých antioxidantů poškození biologických makromolekul 14
Luminometrické metody Luminofory jsou oxidovány RMK. Při návratu do základního energetického stavu emitují fotony. Jejich detekce je možná pomocí luminometrů nebo scintilačních spektrofotometrů. Nejčastěji používané luminofory: - Luminol - Lucigenin - Izoluminol - Pholasin 15
Luminometrické metody aktivita MPO: bromid-dependentní chemiluminiscence v přítomnosti vzorku a peroxidu vodíku buněčná proliferace a cytotoxicita: luciferin-luciferáza 16
Oxidativní vzplanutí fagocytů NADPH + H + NADPH oxidáza NADP + O 2 - O 2 luminol + oxidant (O - 2, H 2 O 2, OH ) -aminoftalát + N 2 + světlo (425 nm) 17
Oxidativní vzplanutí fagocytů 18
Oxidativní vzplanutí fagocytů Aktivátory fagocytů Místo působení osponizované částice (OZP) povrchové receptory fmlp povrchové receptory PMA proteinkináza C vápníkový ionofor A23187 Ca 2+ PKC 19
Intra- a extracelulární tvorba RMKD SOD, kataláza, křenová peroxidáza, azid sodný luminol vs. isoluminol Streptococcus mutans 20
Intra- a extracelulární tvorba RMKD 100 Rat PMNLs + non-opsonized S. mutans CL (RLU) 80 60 40 20 0 Control SOD/CAT 0 10 20 30 40 50 60 Čas (min) 21
Intra- a extracelulární tvorba RMKD 250 Rat PMNLs + opsonized S. mutans CL (RLU) 200 150 100 50 SOD/CAT Control 0 0 10 20 30 40 50 60 Čas (min) 22
Intra- a extracelulární tvorba RMKD 23
Intra- a extracelulární tvorba RMKD 24
Intra- a extracelulární tvorba RMKD 25
Intra- a extracelulární tvorba RMKD 26
Rozlišení mezi RMK a RMD antioxidanty NO donory (sodium nitropruside, SIN-1) analogy L-argininu (L-NMMA, L-NAME, L- NNA) 27
Metody stanovení: volných radikálů aktivity zdrojů volných radikálů antioxidační aktivity biologických vzorků jednotlivých antioxidantů poškození biologických makromolekul 28
Systémy generující RMKD xanthin/xanthin oxidáza peroxid vodíku + ionty přech.kovů O 2 - OH peroxid vodíku H 2 O 2 ABAP ROO SIN-1 ONOO - buněčné systémy (fagocyty) 29
Metoda TRAP Total (peroxyl) Radical-trapping Antioxidative Parameter stanovení celkové antioxidační kapacity ve vodě rozpustných antioxidantů referenční vzorek: trolox 30
Metoda TRAP 2,2 -azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride 2,2 -azobis(2-methylpropionamide) dihydrochloride 31
Metoda TRAP v lipidové fázi 2,2 -azobis(2,4-dimethylvaleronitrile) 32
Metoda TRAP RN == NR N 2 + 2R * R 2, další reakce 2O 2 2RO 2 * peroxylový radikál 33
Metoda TRAP CL Přidání vzorku 50% peak 1/2 peak-time Čas 34
Metoda TRAP 7 6 5 CL [mv] 4 3 backgr abap trolox 2 1 0 0 10 20 30 40 50 Čas [min] 35
Metody stanovení: volných radikálů aktivity zdrojů volných radikálů antioxidační aktivity biologických tekutin jednotlivých antioxidantů poškození biologických makromolekul 36
Spektrofotometrie jednotlivé antioxidanty: kyselina močová kyselina askorbová albumin bilirubin Metody stanovení oxidativního stresu 37
Metody stanovení: volných radikálů aktivity zdrojů volných radikálů antioxidační aktivity biologických tekutin jednotlivých antioxidantů poškození biologických makromolekul 38
Poškození biologických makromolekul Lipidová peroxidace Stanovení konjugovaných dienů pomocí CL Stanovení MDA spektrofotometricky, HPLC Stanovení 4-hydroxynonenalu (spektrometrie, GC-MS) 39
Poškození biologických makromolekul Oxidativní poškození bílkovin Stanovení karbonylových skupin proteinů (HPLC, spektrometrie) Stanovení proteinových hydroperoxidů 40
Poškození biologických makromolekul Oxidativní poškození DNA Stanovení 8-hydroxy-deoxy-guanosinu (8-OHdG) -HPLC, GC-MS 41