VNITRODRUHOVÁ VARIABILITA BOTANICKÝCH TAXONŮ VYBRANÝCH V ZÁVISLOSTI NA ZPŮSOBU ROZMNOŽOVÁNÍ

VNITRODRUHOVÁ VARIABILITA BOTANICKÝCH TAXONŮ VYBRANÝCH V ZÁVISLOSTI NA ZPŮSOBU ROZMNOŽOVÁNÍ INTRASPECIFIC VARIABILITY OF BOTANIC SPECIES SELECTED IN RELATION TO THEIR PROPAGATION ŠÁRKA VAŠÍČKOVÁ, PAVEL VEJL, JANA ZOUFALÁ, JANA ČESKÁ Česká zemědělská univerzita v Praze Czech University of Life Sciences Prague VAŠÍČKOVÁ, Š. VEJL, P. ZOUFALÁ, J. ČESKÁ, J.: Intraspecific variability of botanic species selected in relation to their propagation. Agriculture (Poľnohospodástvo), vol. 55, 2009, N. 2, pp. 62 68. Genetic variability of natural population of fourteen selected species in locality Sorgen near Františkovy Lázně was evaluated by RAPD method. The intra specific and inter specific variability was investigated by using four RAPD primers. RAPD profiles were statistically evaluated within the frame of each species and categories by means of Dice s similarity coefficient. The values of Dice s coefficients were following: for self-pollinated plants Epilobium palustre L. 62.44%, Erophila verna (L.) DC. 71.93%, Viola odorata L. 85.81%, for allogamous species Agrostis capillaris L. 58.69%, Alopecurus pratensis L. 59.38%, Achillea millefolium L. 66.45%, Achillea ptarmica L. 62.07%, Lupinus polyphyllus Lindl. 63.63% and Plantago lanceolata L. 59.29%, for apomictic species Hypericum perforatum L. 71.45% and Poa pratensis L. 68.16% and for vegetatively propagated plants Equisetum arvense L. 88.60%, Chamerion angustifolium L. 72.46% and Typha latifolia L. 86.00%. The hypotheses, that the individual plants of vegetatively propagated taxon are more similar than those of selfpollinated species, allogamous species and species with apomictic reproduction was verified. Key words: DNA, RAPD, genetic variability, Dice s coefficient, plant propagation. Rozmanitost umožňuje v přirozené populaci zachování druhu ve smyslu přežití pod vlivem negativního vnějšího prostředí a tlaku parazitů. Vytvoření znaků, vlastností, metabolismu látek a energie záleží na převedení genetické informace z genů do speciálních proteinů, tzv. expresi genů (Chloupek 2000). Za genetický polymorfismus je odpovědná přítomnost dvou či více alel od jednotlivých genů (Flegr 2005), jejichž kombinace je ovlivněna způsobem rozmnožování a šíření. Za účelem zjištění míry genetické variability druhů byla analyzována DNA rostlin s odlišným způsobem reprodukce a distribuce. PCR-fingerprintingové metody, mezi které patří i metoda náhodné amplifikace polymorfní DNA (Random Amplified Polymorphic DNA), jsou v současnosti zřejmě nejvhodnějšími metodami pro genealogickou analýzu na úrovni vnitrodruhové i pro fylogenetickou analýzu na úrovni rodů (Flegr 2005). Použití několika různých RAPD oligonukleotidů dovoluje získat data vedoucí k určení variability (nebo i konkrétní identifikaci) u druhů, které nebyly dosud geneticky mapovány a pro něž nebyly dosud vyvinuty specifické markery (Vejl et al. 2002). Byla stanovena hypotéza, že jedinci vegetativně množených druhů si jsou podobnější než zástupci druhů autogamních, apomiktických a alogamiích. Byly vybrány druhy, kterým doposud nebyla na molekulární úrovni na našem území věnována větší pozornost. MATERIÁL A METODY Rostlinný materiál a DNA izolace Ve vegetačním období roku 2006 byly ode- Ing. Šárka Vašíčková, Doc. Dr. Ing. Pavel Vejl, Ing. Jana Zoufalá, Ing. Jana Česká, Czech University of Life Sciences Prague, 165 21 Praha 6 Suchdol, Kamýcká 129, Czech Republic. Email: vasickovas@af.czu.cz 62

bírány vzorky vybraných druhů rostlin na lokalitě Sorgen u Františkových Lázní (ČR). DNA analýzy pomocí PCR byly realizovány v Laboratoři genetických analýz Katedry genetiky a šlechtění FAPPZ ČZU v Praze. Pomocí izolační sady DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, SRN) byla izolována DNA čtrnácti taxonů s odlišným způsobem rozmnožování a šíření. Mezi pohlavně množené autogamní druhy byly zařazeny Epilobium palustre L. (vrbovka bahenní), Erophila verna (L.) DC. (osívka jarní) a Viola odorata L. (violka vonná), mezi pohlavně množené alogamní druhy byly začleněny Agrostis capillaris L. (psineček obecný), Alopecurus pratensis L. (psárka luční), Achillea millefolium L. (řebříček obecný), Achillea ptarmica L. (řebříček bertrám), Lupinus polyphyllus Lindl. (lupina mnoholistá) a Plantago lanceolata L. (jitrocel kopinatý). Nepohlavně množené apomiktické taxony zastupovaly druhy Hypericum perforatum L. (třezalka tečkovaná) a Poa pratensis L. (lipnice luční). Skupina nepohlavně rozmnožovaných rostlin s převládajícím vegetativním množením byla reprezentována druhy Equisetum arvense L. (přeslička rolní), Chamerion angustifolium L. (vrbka úzkolistá) a Typha latifolia L. (orobinec širolistý). Čtyřmi RAPD primery bylo hodnoceno 7, resp. 8 zástupců jednotlivých botanických druhů. Vždy byla určena rostlina hlavní, od které byly odebírány další v kruzích, ve vzdálenostech 1, 2, 5, 10, 15 a 20 m, u trav pak i ve vzdálenosti 0,5 m. T a b u l k a 1 Průběh reakce v termocykleru a teplotní podmínky Thermal and time conditions of PCR reaction Počet Kroky ( 2 ) Teplota Čas cyklů ( 1 ) [ C] ( 3 ) [s] ( 4 ) 1 Predenaturace ( 5 ) 94 180 45 Denaturace ( 6 ) 94 20 Annealing ( 7 ) 37,1 45 Prodlužování ( 8 ) 72 105 1 Závěrečné prodlužování ( 9 ) 72 360 ( 1 ) Number of PCR reaction cycles, ( 2 ) steps of PCR reaction, ( 3 ) temperature of each step, ( 4 ) time of each step, ( 5 ) predenaturation, ( 6 ) denaturation, ( 7 ) annealing, ( 8 ) elongation, ( 9 ) final elongation RAPD reakce Testovány byly komerční řady primerů firmy Operon (USA) OPC, OPD, OPE, OPF, OPH, OPI, OPM, OPN, OPO, OPP. Koncentrace jednotlivých složek RAPD reakce byla následující: 2 ng DNA 12,5 µl -1, 2 mm MgCl 2, 1 Taq pufr, 300 µm dntp, 15 ng primer 12,5 µl -1 a 0,5 U Taq polymerasy (Fermentas) 12,5 µl -1. Po optimalizaci RAPD metody probíhala amplifikace DNA dle tabulky 1. Elektroforetická analýza RAPD produktů a vyhodnocení elektroforeogramů Pro separaci molekul DNA byla použita elektroforéza Sub Cell (Bio Rad, USA). Doba separace na 1,5 % agarózovém gelu v 1 TBE pufru byla 210 minut. Statistické zpracování dat získaných použitím výše zmíněných molekulárních metod bylo zaznamenáno plně automatizovaným dokumentačním systémem firmy BioRad (USA) GelDoc XR. Získaná binární data byla zpracována formou Diceho podobnostního koeficientu. Diceho koeficienty prezentuje program formou podobnostních matic, které byly vyhotoveny pro každý primer a každou rostlinu. Postupně byly porovnávány v programu Statistica 2007 Diceho koeficienty nejen jednotlivých rostlin mezi sebou, ale také jednotlivých skupin lišících se způsobem rozmnožování. VÝSLEDKY A DISKUSE Vnitrodruhová variabilita a počet polymorfních zón RAPD profilů jednotlivých botanických druhů Byly vybrány primery OPH 13, OPN 5, OPO 15, OPP 9 poskytující nejvíce zřetelné RAPD profily. Počet polymorfních zón jednotlivých botanických druhů uvádí tabulka 2. Vnitrodruhová variabilita je graficky charakterizována na obrázku 1. Hodnocení variability RAPD profilů uměle vytvořených skupin botanických druhů podle způsobu jejich rozmnožování Soubory Diceho podobnostních koeficientů pro jednotlivé skupiny rostlin byly hodnoceny t-testem pro dva nezávislé výběry s využitím programu Statistica 2007. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 4. Byl prokázán statisticky významný 63

rozdíl (a = 0,05) u všech skupin kromě autogamních druhů s apomiktickými. Hodnoty variačních koeficientů se pohybují v rozmezí 4,64 6,27 %, což poukazuje na poměrně vysokou vyrovnanost Diceho podobnostních koeficientů u jednotlivých skupin. T a b u l k a 2 Počet polymorfních zón RAPD profilů u jednotlivých botanických druhů The number of polymorphic RAPD zones for each botanical species Vnitrodruhová variabilita autogamních botanických druhů Hodnoty Diceho podobnostních koeficientů se pohybovaly v rozmezí 62,44 85,81 % a dosahovaly největšího rozptylu. Tato skutečnost je zřejmě způsobena existencí druhů, které se za určitých, často extrémních přírodních podmínek dokáží rozmnožovat i cizosprášením (Briggs a Walters 2002). Průměru 72,15 % se nejvíce blížila hodnota koeficientu osívky jarní. Průměr Diceho podobnostních koeficientů tohoto taxonu byl 71,93 %. Jak uvádějí Slavík et al. (1990) může být osívka jarní velmi vzácně hmyzosnubná, ale převážně je autogamním druhem, u kterého se vyskytuje kleistogamie. Naopak hodnota velice odlehlá a velmi blízká hodnotám koeficientů alogamních rostlin byla zjištěna u druhu Epilobium palustre L. (62,44 %). Tuto skutečnost by mohl vysvětlovat fakt, že vrbovka bahenní je převážně autogamní rostlina, avšak vzácně může docházet k entomogamii uváděné autory Slavík et al. (2004). Vzhledem k habitu rostliny, kdy lodyha běžně dosahuje výšek 70 cm a tobolky jsou hustě chmýřité, jsou semena větrem nesena do značných vzdáleností a je tedy možné, že byly odebrány rostliny různých linií. Z hlediska zkoumání vnitrodruhové variability nepatří vrbovka bahenní mezi často studované botanické druhy. Neočekávaně vysoká hodnota blízká koeficientům vegetativně se množících rostlin byla stanovena u druhu Viola odorata L. (85,81 %). Značnou variabilitu související s místem původu rostlin potvrzuje Marcussen (2006). Jak uvádí např. Hölldobler a Wilson (1997), Slavíková (1986) či Zlatník (1973), semena tohoto rostlinného druhu mohou být šířena myrmekochorií, což by mělo koeficient podobnosti snižovat. Z výsledků genetické studie lze vyvodit závěr, že ve zkoumané populaci violek zřejmě dlouhá léta nedocházelo k cizosprášení a tak dochází k úspěšnému množení ověřeného genotypu ve formě čisté linie. Hodnocení vnitrodruhové variability u alogamních botanických druhů U rostlin z čeledě Poaceae byly záměrně odebírány rostliny také ve vzdálenosti 0,5 m za účelem ověření větší podobnosti jednotlivých rostlin díky předpokládanému intenzivnímu vegetativnímu množení výběžky. Tato domněnka však Použité primery ( 2 ) Botanický druh ( 1 ) OPN 5 Epilobium palustre L. 19 17 16 14 Erophila verna (L.) DC. 17 9 21 18 Viola odorata L. 19 10 11 15 Agrostis capillaris L. 23 21 25 17 Alopecurus pratensis L. 31 19 28 22 Achillea millefolium L. 18 10 17 12 Achillea ptarmica L. 12 16 22 24 Lupinus polyphyllus Lindl. 19 20 16 17 Plantago lanceolata L. 19 14 21 16 Hypericum perforatum L. 7 17 14 13 Poa pratensis L. 20 23 26 15 Equisetum arvense L. 16 15 10 12 Chamerion angustifolium L. 12 11 24 9 Typha latifolia L. 17 9 20 10 ( 1 ) Botanic species, ( 2 ) used primers OPO 15 OPP 9 OPH 13 Hodnoty Diceho koeficientů (%) 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Přeslička rolní Orobinec širolistý Violka vonná Vrbka úzkolistá Osívka jarní Třezalka tečkovaná Lipnice luční Řebříček obecný Lupina mnoholistá Vrbovka bahenní Řebříček bertrám Psárka luční Jitrocel kopinatý Psineček obecný Obr. 1. Průměrná hodnota Diceho podobnostních koeficientů jednotlivých taxonů Fig. 1. The value of Dice s koeficient of each species 64

nebyla potvrzena. Nízkou hodnotou průměrného Diceho podobnostního koeficientu u alogamních druhů 61,07 % bylo potvrzeno, že vzájemné křížení jedinců populací alogamních druhů je příčinou jejich vysoké genetické i fenotypové variability (Chloupek 2000). Nejvyšších hodnot vnitrodruhové podobnosti dosahoval řebříček obecný (66,45 %), což se neshoduje s výsledky studie rakouských a německých biologů Wallner et al. z roku 1996, kteří zkoumali A. millefolium L. a další příbuzné druhy dvěma metodami. Metoda oligonukleotidového fingerprintigu použitím 13 mikrosatelitních sond prokázala v přirozených populacích vysokou míru variability vnitro- i mezidruhové, zatímco analýza týchž vzorků metodou RAPD při použití deseti primerů poskytla mnohem méně polymorfismů. Příbuzný druh řebříček bertrám dosahoval zhruba o 4 % nižšího T a b u l k a 3 Sekvence použitých RAPD primerů The sequence of used RAPD primers Primer ( 1 ) Sekvence 5 3 ( 2 ) OPH 13 OPN 5 OPO 15 OPP 9 GACGCCACAC ACTGAACGCC TGGCGTCCTT GTGGTCCGCA ( 1 ) Used primer, ( 2 ) sequence of nucleotids in direction 5 3 průměru Diceho podobnostních koeficientů. Rozdílnost hodnot koeficientů obou řebříčků by mohla být vysvětlována odlišným způsobem šíření semen, které je u řebříčku bertrám endozoochorní na rozdíl od anemochorního řebříčku obecného (Slavík et al. 2004). Druhý nejvyšší Diceho podobnostní koeficient alogamních rostlin, a sice 63,63 % byl vypočten pro druh Lupinus polyphyllus Lindl. Na molekulární úrovni studovali variabilitu lupiny Wheeler et al. (2005), kteří provedli analýzu variability ITS regionů. Variabilita použitých DNA markerů korespondovala geograficky, ale mnohdy neodpovídala variabilitě fenotypů. U dalších zkoumaných druhů v této kategorii se Diceho podobnostní koeficienty pohybovaly kolem 59 % Plantago lanceolata L. (59,29), Agrostis capillaris L. (58,68) a Alopecurus pratensis L. (59,38). Veliké rozpětí vnitrodruhové variability psinečků obecných získaných z NPGS (National Plant Germplasm System) potvrzují Rajasekar et al. (2007). Vysoká míra diverzity byla potvrzena také Zhao et al. (2006), při hledání genů rezistence k houbovým chorobám metodou AFLP. U dalšího alogamního druhu jitrocele kopinatého se všeobecně předpokládal větrosnubný způsob opylení, ale pokus Stellmana (1978) potvrzuje, že k přenosu pylu u této rostliny dochází hmyzem, nikoli větrem, jak běžně uvádějí např. Slavík et al. (2006). Při detekci nového typu CMS (Cytoplasmatic Male Sterility) byla u tohoto druhu potvrzena de Haa- T a b u l k a 4 Výsledky t-testu průměrných hodnot Diceho podobnostních koeficientů u skupin botanických druhů vytvořených na základě jejich rozmnožování The t-test value of Dice s coeficients of groups with distinct propagation systems Porovnávaná dvojice ( 1 ) Průměr 1 ( 2 ) Průměr 2 ( 3 ) t ( 4 ) Sv ( 5 ) P ( 6 ) Autogamní / Vegetativní ( 7 ) 72,12065 81,24906 5,90386 394 0,000000 Autogamní / Alogamní ( 8 ) 72,12065 61,07231 8,389182 666 0,000000 Autogamní / Apomiktické ( 9 ) 72,12065 69,52986 1,494639 326 0,135976 Vegetativní / Alogamní ( 10 ) 61,07231 81,24906 16,8474 694 0,000000 Vegetativní / Apomiktické ( 11 ) 81,24906 69,52986 7,616179 354 0,000000 Alogamní / Apomiktické ( 12 ) 61,07231 69,52986 6,11062 626 0,000000 ( 1 ) Comparing group, ( 2 ) average of first group, ( 3 ) average of second group, ( 4 ) t-test value, ( 5 ) number of samples, ( 6 ) P-value, ( 7 ) comparison of self-pollinated plants and vegetatively propagated plants, ( 8 ) comparison of self-pollinated plants and allogamous species, ( 9 ) comparison of self-pollinated plants and apomictic species, ( 10 ) comparison of vegetatively propagated plants and allogamous species, ( 11 ) comparison of vegetatively propagated plants and apomictic species, ( 12 ) comparison of allogamous species and apomictic species 65

nem et al. (1997) vysoká míra různorodosti mitochondriální DNA. Byla prověřena i různost chloroplastové DNA a byly identifikovány 3 haploidní typy, kdy odlišnost cpdna prokázala, že typ CMSI byl rozšířen uvnitř druhu, spíše během migrace než rekurentní mutací. Sahin et al. (2007) použili několik polymorfních míst jaderné ribosomální DNA jako DNA markery pro identifikaci 8 druhů jitrocele a výsledky shrnuje ve fylogenetické studii. Hodnocení vnitrodruhové variability u apomikticky se rozmnožujících botanických druhů U apomikticky se množících druhů byl získán průměr Diceho podobnostních koeficientů 69,53 %. Tento výsledek odpovídá poznatkům o funkci apomiktického množení. Briggs a Walters (2002) uvádějí, že úplná obligátní apomixie vedoucí k minimální variabilitě je mnohem méně rozšířená než částečná či fakultativní apomixie. Obligátní apomixie vede k minimální variabilitě. U fakultativně apomiktických rostlin dochází k šíření genotypů, které úspěšně prošly selekcí nepohlavním způsobem, ale současně také k rozšiřování pohlavním způsobem, protože fakultativně apomiktické rostliny vytváří semena po cizosprášení. Na kombinaci obou uvedených způsobů rozmnožování a možnosti opylování hmyzem se shodují autoři Arnholdt a Schmitt (2000) a Slavík et al. (1990). RAPD markery pro odlišení apomiktických a pohlavně se rozmnožujících potomků třezalky použili Steck et al. (2001). Průměr Diceho podobnostních koeficientů všech primerů druhého zástupce skupiny - lipnice luční je 68,16 %. K podobným výsledkům při použití stejné metody dospěli Johnson et al. (2002), kteří zjišťovali variabilitu lipnic získaných z NPGS pro ministerstvo zemědělství USA. Obdobný závěr publikovali rovněž Ning et al. (2005), kteří zkoumali použitím 25 RAPD primerů genetické souvislosti 16 odrůd lipnic v Číně. Hodnocení variability u vegetativně se rozmnožujících botanických druhů Hodnota Diceho podobnostního koeficientu pro vegetativně se množící druhy se pohybovala v rozmezí 72,46 88,60 %. Vysoké hodnoty podobnosti byly zjištěny u druhů přeslička rolní (88,60 %) a orobninec širolistý (86,00 %), u nichž se vegetativní způsob množení vyskytuje společně s rozmnožováním pohlavním, kdy o strategii reprodukce a šíření rozhodují vnější podmínky. Vegetativní propagace má oproti generativní reprodukci výhodu v tom, že umožňuje úspěšně obsazovat stanoviště, která jsou porostlá již vegetací s vysokou pokryvností, kde je vyklíčení semen nemožné (Slavíková 1986). Oba tyto druhy nepatří do popředí oblasti zájmu molekulárních genetiků. Mariasem et al. (2003) byl proveden fylogenetický výzkum vybraných druhů rodu Equisetum s využitím cpdna, které však poskytovaly nejednoznačné výsledky. Keane et al. (1999) dospěli při analyzování VNTR (Variable Number Tandem Repeat) orobince širolistého metodou k hodnotě průměrného koeficientu podobnosti o 5 % vyšší, než uvádí naše studie. U vrbky úzkolisté činí míra podobnosti dle Diceho koeficientů 72,46 %, což je hodnota zhruba o 10 % nižší než u ostatních vegetativně množených rostlin. Na zkoumané lokalitě evidentně nedochází k rozsáhlému vegetativnímu šíření tohoto druhu, který popisují autoři Dunnet a Willis (2000) a Slavík et al. (1997). Jedním z vysvětlení by mohly být specifické pedologické a hydrologické podmínky lokality, kdy vysoká hladina spodní vody a jilovitá půda nepředstavují vhodné prostředí pro šíření podzemních výhonů. ZÁVĚR Byla potvrzena hypotéza, že jedinci vegetativně množených druhů si jsou podobnější než zástupci druhů autogamních, apomiktických a alogamních. Z celkového počtu 200 testovaných primerů byly pro testování vnitrodruhové variability metodou RAPD vhodné 4 primery uvedené v tabulce 3. Optimální anelační teplota pro metodu RAPD pro vybrané botanické druhy byla 37,1 C a byl stanoven rovněž optimální počet 45 cyklů amplifikace. Hodnoty Diceho podobnostních koeficientů byly stanoveny pro jednotlivé druhy i skupiny rostlin. Pomocí programu Statistica 2007 byla statisticky vyhodnocena vnitrodruhová variabilita čtrnácti vybraných taxonů na území České republiky. 66

Poděkování. Výsledky práce byly částečně podpořeny grantovým projektem Molekulární charakteristika a in vitro kultivace rodů Thymus a Plantago (GA FAPPZ ČZU v Praze). LITERATURA ARNHOLDT-SCHMITT, B. (2000): RAPD analysis: a method to investigate aspects of the reproductive biology of Hypericum perforatum L. In: TAG, vol. 100, 2000, N. 6, pp. 906 911. BRIGGS, D. WALTERS, S.M. (2001): Proměnlivost a evoluce rostlin (Variability and evolution of plants). Olomouc: Vydavatelství Univerzity Olomouc, 2001, 531 p. ISBN 80-244-0186-X. DE HAAN, A.A. MATEMAN, A.C. VAN DIJK, P.J. VAN DAMME, J.M.M. (1997): New CMS types in Plantago lanceolata L. and their relatedness. In: TAG, vol. 94, 2000, N. 3 4, pp. 539 548. DUNNETT, N.P WILLIS, A.J. (2000): Dynamics of Chamerion angustifolium L. in grassland vegetation over a thirty-nine-year period. In: Plant Ecol., vol. 148, 2000, N. 1, pp. 43 50. FLEGR, J. (2005): Evoluční biologie (Evolutanionary biology). Praha: Academia Praha, 2005, 559 p. ISBN 80-200-1270-2. HÖLLDOBLER, B. WILSON, E. O. (1997): Cesta k mravencům (Approach to ants). Praha : Academia Praha, 1997, 198 p. ISBN 80-200-0612-5. CHLOUPEK, O. (2000): Genetická diverzita, šlechtění a semenářství (Genetic diversity, breeding and seed managment). Praha: Academia Praha, 2000, 310 p. ISBN 80-200-0779-2. JOHNSON, R.C. JOHNSTON, W.J. GOLOB, C.T. NELSON, M.C. SORENG, R.J. (2002): Characterization of the USDA Poa pratensis L. collection using RAPD Markers and agronomic descriptors. In: Genet. Resour. Crop Evol., vol. 49, 2002, N. 4, pp. 349 361. KEANE, B. PELIKAN, S. TOTH, G.P. SMITH, M.K. ROGSTAD, S.H. (1999): Genetic diversity of Typha latifolia L. (Typhaceae) and the impact of pollutants examined with tandem-repetitive DNA probes. In: Am. J. Bot., vol. 86, 1999, N. 9, pp. 1226. MARAIS, L.D. SMITH, A.R. BRITTON, M.D. PRYER, K.D. (2003): Phylogenetic relationships and evolution of extant horsetails, equisetum, based on chloroplast DNA sequence data (rbcl and trnl-f). In: Int. J. Plant Sci., vol. 164, 2003, N. 5, pp. 737 751. MARCUSSEN, T. (2006): Allozymic variation in the widespread and cultivated Viola odorata L. (Violaceae) in western Eurasia. In: Bot. J. Linn. Soc., vol. 151, 2006, N. 4, pp. 563 571. NING, T.T. ZHANG, Z.J. JIN, C.Z. ZHU, Y.G. (2005): Genetic polymorphism of bluegrass cultivars detected by RAPDs. In: Yi Chuan, vol. 27, 2005, N. 4, pp. 605 610. RAJASEKAR, S. FEI, S. CHRISTIANS, N.E. (2007): Analysis of genetic diversity in colonial bentgrass (Agrostis capillaris L.) using randomly amplified polymorphic DNA (RAPD). In: Genet. Resour. Crop Evol., vol. 54, 2007, N. 7, pp. 45 53. SAHIN, F.P. YAMASHITA, H. GUO, Y. TERA- SAKA, K. KONDO, T. YAMAMOTO, Y. SHI- MADA, H. FUJITA, M. KAWASAKI, T. SE- KAI, E. TANAKA, T. GODA, Y. MIZUKAMI, H. (2007): DNA Authentication of Plantago herb based on nucleotide sequences of 18S-28S rrna internal transcribed spacer region. In: Biol. Pharm. Bull., vol. 30, 2007, N. 7, pp. 1265 1270. SLAVÍK, B. (ed.) (1997): Květena České republiky 5. díl (Flora of the Czech Republic Vol. 5). Praha: Academia Praha, 1997, 568 p. ISBN 80-200-0590-0. SLAVÍK, B. (ed.) (2000): Květena České republiky 6. díl (Flora of the Czech Republic Vol. 6). Praha: Academia Praha, 2000, 770 p. ISBN 80-200-0306-1. SLAVÍK, B. (ed.) (2004): Květena České republiky 7. díl (Flora of the Czech Republic Vol. 7). Praha: Academia Praha, 2004, 767 p. ISBN 80-200-1161-1. SLAVÍK, B. HEJNÝ, S. (eds.) (1990): Květena České republiky 2. díl (Flora of the Czech Republic Vol. 2). Praha: Academia Praha, 1990, 540 p. ISBN 80-200- 1089-0. SLAVÍKOVÁ, J. (1986): Ekologie rostlin (Plant Ecology). Praha: Státní pedagogické nakladatelství Praha, 1986, 366 p. ISBN 14 446 86. STECK, N. MESSMER, M. SCHAFFNER, W. BUETER, K. B. (2001): Molecular markers as a tool to verify sexual and apomictic off-spring of intraspecific crosses in Hypericum perforatum L. In: Planta Med., vol. 67, 2001, N. 4, pp. 384 385. STELLMAN, P. (1978): The possible role of insect visits in pollination of reputedly anemophilous plants, exemplified by Plantago lanceolata L. and syrphid flies. In: BRIGGS, D. WALTERS S. M. (2001): Proměnlivost a evoluce rostlin (Variability and evolution of plants). Olomouc: Vydavatelství Univerzity Olomouc, 2001, 531 p. ISBN 80-244-0186-X. VEJL, P. SKUPINOVÁ, S. SEDLÁK, P. BARDOVÁ, M. (2002): Analýzy rostlinného genomu (Plant Genom Analysis). Praha: ČZU v Praze, 2002, 238 p. ISBN 80-213-0903-2. WALLNER, E. WEISING, K. ROMPF, R. KAHL, G. KOPP, B. (1996): Oligonucleotide fingerprinting and RAPD analysis of Achillea species: Characterization and longterm monitoring of micropropagated clone. In: Plant Cell Rep., vol. 15, 1996, N. 8, pp. 647 652. WHEELER, E. J. EDWARD, R. L. ALLEN, G. A. (2005): Morphological and molecular evidence concerning the relationship of Lupinus polyphyllus Lindl. and L. wyethii (Fabaceae). In: BioOne, vol. 52, 2005, N. 2, pp. 107 113. ZHAO, H. BUGHRARA, S.S. OLIVIERA, J.A. (2006): Genetic diversity in colonial bentgrass (Agrostis capillaris. L.) revealed by EcoRI-MseI and PstI-MseI AFLP markers. In: Geonome, vol. 49, 2006, N. 4, pp. 328 335. ZLATNÍK, A. (1973): Základy ekologie (Basic Ecology). Praha: Státní zemědělské nakladatelství Praha, 1973, 280 p. ISBN 80-85368-22-6. 67

SOUHRN Metodou RAPD byla hodnocena genetická variabilita přirozených populací čtrnácti druhů rostlin z lokality Sorgen u Františkových Lázní. Rostliny byly zařazeny do skupin dle způsobu rozmnožování a šíření. Byla stanovena vnitrodruhová i mezidruhová variabilita pomocí čtyř RAPD primerů. RAPD profily byly statisticky porovnány v rámci každého druhu i každé skupiny pomocí Diceho podobnostních koeficientů. Bylo dosaženo následujících hodnot průměrných Diceho podobnostních koeficientů: u rostlin autogamních Epilobium palustre L. 62,44 %, Erophila verna (L.) DC. 71,93 %, Viola odorata L. 85,81 %, u alogamních rostlin Agrostis capillaris L. 58,69 %, Alopecurus pratensis L. 59,38 %, Achillea millefolium L. 66,45 %, Achillea ptarmica L. 62,07 %, Lupinus polyphyllus Lindl. 63,63 % a Plantago lanceolata L. 59,29 %. Nepohlavně množené apomiktické taxony zastupovaly druhy Hypericum perforatum L. s koeficientem 71,45 % a Poa pratensis L. 68,16 %. Skupina nepohlavně rozmnožovaných rostlin s převládajícím vegetativním množením byla reprezentována druhy Equisetum arvense L. s koeficientem 88,60 %, Chamerion angustifolium L. 72,46 % a Typha latifolia L. 86,00 %. Byla potvrzena hypotéza, že jedinci vegetativně množených druhů si jsou podobnější než zástupci druhů autogamních, apomiktických a alogamních. Klíčová slova: DNA, RAPD, genetická variabilita, Diceho koeficient, způsoby rozmnožování rostlin 68