Příprava materiálu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253 Část 7 Vlastnosti solventů (rozpouštědel) Přehled organických rozpouštědel Tabulka níže shrnuje velký počet solventů v pořadí stoupající polarity. Mnohé z nich nejsou vhodné jako mobilní fáze z důvodů uvedených dříve. Z tabulky je patrné, proč některá rozpouštědla nejsou vhodná, např. kvůli vysoké absorpce UV záření nebo třeba vysoké viskozitě. Některé solventy jsou užívány v malých množstvích jako aditiva mobilní fáze pro určité aplikace: přídavek aminů vede ke posunu ph do zásadité oblasti, naopak přídavek kyselin sníží ph do kyselé oblasti. Tabulka uvádí následující vlastnosti solventů: Eluční síla: ε 0 je parametr uvádející eluční schopnost solventu pokud je použit jako mobilní fáze v kombinaci se silikagelem jako stacionární fází. Představuje adsorpční energii elučního činidla vztaženou na jednotku plochy absorbentu. Tabulka solventů seřazená podle tohoto parametru se často nazývá elutropická řada. [Často tabulky shrnují ε 0 hodnoty na alumině jako adsorbentu a jsou vyšší než na silikagelu: ε 0 (Al 2 O 3 ) = 1.3 ε 0 (SiO 2 )]. Viskozita: ž je uváděna v mpa a při 20 C. Solventy s vyšší viskozitou naž voda ž = 1.0 jsou méně vhodné pro HPLC, protože jejich použití vede k vysokým tlakům na koloně. Index lomu: jak plyne ze zkratky, n 20 D, je uváděn při C.
UV hrana (cutoff): Je to vlnová délka, při které je absorbance solventu rovna 1.0 v 1 cm kyvetě a při aplikaci vzduchu jako referenční hodnotě (10% transmitance). Data prezentovaná v tabulce jsou platná jen pro velmi čistá rozpouštědla. Solventy horší čistoty mají hodnoty vyšší. Bod varu: Příliš nízký bod varu je nevýhodný. Dochází k tvorbě bublin v HPLC systému. Také může díky vysoké těkavosti dojít ke ztrátě solventu při jeho odplyňování zejména proudem helia. Dipólový charakter: π* je měřítkem schopnosti rozpouštědla interagovat s analytem dipólovými interakcemi a polarizačními silami. Kyselost: α je měřítkem schopnosti solventu chovat se jako donor vodíku k bazickým analytům (akceptorům). Zásaditost: β je měřítkem schopnosti solventu chovat se jako akceptor vodíkové vazby vůči kyselým analytům (donorům). Poznámka: π*, α a β jsou relativní čísla a jsou normalizovány tak, že jejich součet je roven 1.00. Tyto tzv. solvatochromní parametry jsou velmi užitečné při popisu a srovnání jednotlivých rozpouštědel. Solventy s nízkou polaritou, fluoroalkany tetrachlormetan, neinteragují s analyty dipólovými ani vodíkovými interakcemi a z toho důvodu u nich uvedené parametry nejsou definovány.
Selektivita solventů Nejúčinnější způsob ovlivnění separace je změna separační selektivity. Toho lze dosáhnout aplikací jiného separačního modu (např. normální vs reverzní fáze) použitím jiné stacionární fáze (např. oktadecyl- vs fenyl- silikagel) nebo využitím odlišné mobilní fáze. V tom druhém případě je nejvhodnější zvolit solvent maximálně odlišný od původního dle výše specifikované tabulky, a níže uvedeného diagramu, kde jsou graficky prezentovány solvatochromní vlastnosti rozpouštědel.
Trojúhelník v diagramu dole představuje ukazujíce vzájemné rozdíly jednotlivých solventů vzhledem k jejich parametrům π*, α a β. Často je selektivita solventů nastavena mícháním dvou čistých solventů A a B, je třeba připomenout, že tyto solventy musí být vzájemně mísitelné. Dále, pokud jde o ladění selektivity v normálním modu, nemá velký smysl zaměnit diethyl ether terc-butyl methyl etherem, protože oba solventy jsou prakticky na stejném místě v trojúhelníku. Podobně, není smysluplné snažit se zkoušet několik různých alifatických alkoholů v modu reverzní chromatografie. Benzen a jeho deriváty jsou jen výjimečně používány v roli mobilní fáze z toho důvodu, že neumožňují UV detekci. Mísitelnost solventů Obrázek níže poskytuje informace o mísitelnosti běžných HPLC solventů při laboratorní teplotě. Mísitelnost je závislá na teplotě. Navíc, mnoho rozpouštědel je vzájemně omezeně mísitelných, tedy jsou mísitelné jen v jistých poměrech. Tato skutečnost v obrázku znázorněna není, protože je lepší míchat solventy vzájemně neomezeně mísitelné.
Solventy plně mísitelné se všemi ostatními rozpouštědly (od hexanu po vodu) jsou aceton, ledová kyselina octová, absolutní ethanol, isopropanol a tetrahydrofuran. Pufry Pufry jsou užívány např. v modu iontově-výměnné chromatografie a často také v chromatografii na reverzní (obrácené) fázi. Pokud mají být děleny iontové nebo ionizovatelné látky, je velmi často, i když ne vždy, třeba provádět chromatografii při dané hodnotě ph, která je nastavena pufrem. Tímto způsoben může být také řízen stav analytu, tedy zajištěno v jaké formě je analyt chromatografován, tedy zda v nedisociované nebo disociované. Vybrané ph musí být alespoň o 2 jednotky ph odlišné, než je hodnota pk a analytu, jedině pak je velká většina látky jen v jedné formě.
Kyselé analyty: Pufry mající hodnotu ph o dvě jednotky nižší než pk a analytu zajistí kompletní potlačení disociace kyselého solutu. Pufry s hodnotou ph o dvě jednotky vyšší naopak úplnou disociaci kyselého analytu. Zásadité analyty: Pufry s ph o dvě jednotky vyšší hodnotou než pk a zásaditého analytu zabezpečí kompletní potlačení protonizace analytu, pufry s hodnotou ph o dvě jednotky nižší než pk a analytu zabezpečí kompletní protonizaci analytu. Pokud se jedná o iontovou sílu pufru je vhodné začít s asi 25 mmol -1 roztoky. Příliš nízká koncentrace pufru vede k nedostatečné schopnosti pufru udržovat stálou hodnotu ph mobilní fáze. Vysoká iontová síla (např. 100 m mol -1 ) může vést k potížím s rozpustností v organických solventech. Je vhodné si předem zkontrolovat mísitelnost pufru s organickým rozpouštědlem v plném rozsahu předpokládaných poměrů. Roztoky pufrů musí být před užitím jako mobilní fáze pro HPLC filtrovány! Pufry jsou náchylné k bakteriálnímu růstu, proto může být vhodné preventivně přidat 0.1% azid sodný. Pufr nesmí zůstat v HPLC instrumentu a v koloně v době, kdy neprobíhá dělení. Musí být nahrazen nejprve vodou a pak, pokud jde o chromatografii v reverzním modu, 100% organickým rozpouštědlem. Pokud je tento postup nepohodlný, bylo by to zdlouhavé provádět každý den, je třeba čerpadlo nevypínat a v době, kdy se neměří jen snížit průtok. Pufry plní svou funkci, tj. udržují stabilní ph, jen v blízkém okolí, asi ± 1, jejich hodnoty pk a. Table níže shrnuje některé běžné pufry včetně jejich pk a hodnot. Hodnota ph je jednoznačně definována ve vodném prostředí a může být počítána na základě znalosti složení soli a kyselin, respektive báze. Pokud je přidáno také organické rozpouštědlo, je situace obecně složitější. Potíže s definováním a měřením ph v těchto směsných prostředí může být často obejita tak, že je ph změřeno ve vodném prostředí před přídavkem organického aditiva a následně po jeho přídavku již měřeno není. Je třeba zde zdůraznit, že problematika definování ph ve směsných organicko-vodných mobilních fázích je poměrně složitá a nesmí být obecně přehlížena nebo podceňována.
Pufry bývají připravovány také z komerčních koncentrátů, kdy správným ředěním je dosažena uvedená hodnota ph. Pokud není možno koncentrát pufru koupit nebo to z nějakého důvodu není vhodné, je nejlepší postup přípravy pufru založen na vážení příslušných chemikálií, kdy jsou potřebná množství nalezena v tabulkách nebo jsou vypočítána a následně je přidána voda a nastaven objem. Pro kombinaci s optickým rozptylovým detektorem, pro LC-MS a pro preparativní separace je vhodné volit těkavé pufry, ty jsou prezentovány v tabulce níže. Těkavost kyselin, zásad a solí byla studována Petritisem a kol. 1 Pufry vhodné pro ESI-MS publikoval García. 2 1 K. Petritis et al., LC GC Eur., 15, 98 (2002). 2 M/C. García, J. Chromatogr. B, 825, 111 (2005).
Trvanlivost pufrů Je dobré připravit si jen tolik pufru, kolik bude spotřebováno v krátké době. Trvanlivost vodných pufrů bez organických aditiv je velmi krátká. Voda z přístroje na ultračistou vodu 3 dny Vodné roztoky (nepufrované) 3 dny Pufry 3 dny Vodné roztoky s méně než 15% organického rozpouštědla 1 měsíc Vodné roztoky s více než 15% organického rozpouštědla 3 měsíce Organická rozpouštědla 3 měsíce Je třeba si dále uvědomit, že při míchání vodných roztoků s organickými solventy často dochází k objemové kontrakci, proto není možné připravovat směsné roztoky tak, že by jeden roztok byl odměřena a druhý byl k němu přilit a objem nastaven doplněním po rysku.