Laboratorní diagnostika Hereditární sférocytózy

Laboratorní diagnostika Hereditární sférocytózy Špačková I. 1, Kneiflová M. 2, Pospíšilová J. 3, Sítková R. 3 1 Laboratoř klinické imunologie a alergologie 2 Laboratoř klinické hematologie 3 Laboratoř molekulární biologie

Hereditární sférocytóza (HS) Neonkologické onemocnění Klinická závažnost autozomálně dominantního, vzácněji recesivního onemocnění může probíhat od bezpříznakových stavů až po výskyt těžké hemolýzy mutace některých z genů kódující tvorbu strukturálních proteinů membrány erytrocytů dochází k selektivnímu vychytávání krvinek ve slezině a k jejich urychlené destrukci Bolton-Maggs P.H.B., et al: Guidelines for the diagnosis and management of hereditary spherocytosis, British Journal of Haematology,2004; 126, 455-474

Hereditární sférocytóza - historie První popis sférocytů mikrocytů, spojených se splenomegalií a ikterem r. 1871 20. stol. Oskar Minkowski popis výskytu hemolytické anémie u více členů rodiny 20. stol. Anatol Chauffard prokázal charakteristický znak této choroby sníženou osmotickou rezistenci a zvýšený počet retikulocytů https://zdravi.euro.cz/clanek/postgradualni-medicina/hemolyticke-anemie-161359

Patofyziologie HS Mutace spektrinu / ankyrinu nebo band3 Narušení vertikálních interakcí (spektrin-ankyrin-band3) Opakovaná ztráta erytrocytární membrány ve formě mikrovezikul Vzniká malý denzní sférocyt (mikrosférocyt) MCHC deformabilita sférocytu destrukce sférocytů ve slezině osmotická fragilita = osmotická rezistence Chronická extravaskulární hemolytická anémie Klener P.: Hematologie, Anémie III, Polycytémie; Ústav Patol. Fyziologie 1.LF UK v Praze

Rencic J. et.al: Circling Back for the Diagnosis, N ENGL J MED 377;1778-84 November 2, 2017

Patofyziologie HS Průměrná doba, kterou stráví normální diskocyt ve slezině je cca 30-40 s. Sférocyt stráví ve slezině 10-100 min, a pokud není ve slezině zlikvidován, může být dále narušena jeho deformabilita (= splenic conditioning). Další roli v patofyziologii HS hraje patrně zvýšený únik draslíku extracelulárně, čímž dochází k dehydrataci sférocytu. dehydratace snižuje deformabilitu mikrosférocytu Klener P.: Hematologie, Anémie III, Polycytémie; Ústav Patol. Fyziologie 1.LF UK v Praze

Patofyziologie HS Splenic conditioning se projeví v testu osmotické fragility jako tzv. ocas hemolýzy (= tailed curve). Ocas hemolýzy mizí po splenektomii. (1) Test osmotické fragility erytrocytů (2) Typical - křivka zvýšené osmotické fragility, nejčastějčím nálezem. Tailed - křivka poukazuje na přítomnost velmi křehkých erytrocytů. Diagonální křivka je pozorována u pacientů s těžkým HS. 1. Klener P.: Hematologie, Anémie III, Polycytémie; Ústav Patol. Fyziologie 1.LF UK v Praze 2. Modified from Dacie J: Hereditary spherocytosis (HS). In The Haemolytic Anaemias, 3rd ed, vol 1. Edinburgh, Churchill Livingstone, 1985, p 134.)

Diagnostika a klinické příznaky HS Nejčastěji v dětství nebo pubertě prakticky ale v každém věku Anémie, ikterus, splenomegalie! Znalost zdravotního stavu rodiny! Klasifikace Lehká Mírná Střední Těžká Hemoglobin (g/dl) Normal 11-15 8-12 6-8 Počet retikulocytů (%) Normal (<3%) 3-6 >6 >10 Bilirubin (μmol/l) <17 17-34 >34 >51 Spectrin v Ery (% z normálních) 100 80-100 50-80 40-60 Splenektomie Není povinná Není nezbytná během dětství a adolescence Nezbytná - školní věk před pubertou Nezbytná optimálně do dosažení 6let věku Bolton-Maggs P.H.B., et al: Guidelines for the diagnosis and management of hereditary spherocytosis, British Journal of Haematology,2004; 126, 455-474

Diagnostické parametry HS Parametry Klinické vlastnosti Laboratorní vyšetření erytrocytů Hodnocení krevního nátěru Přímý antiglobulinový test Přítomnost hemolýzy Vlastnosti Splenomegalie téměř vždy Hb, MCV, MCHC, % hyperdenzní buňky, RDW, počet retikulocytů Abnormální morfologie - sférocyty negativní Zvýšený bilirubin, retikulocytóza Vzestup měřených parametrů Ery v predikci HS a její závažnosti: Parametry Závažnost u HS Kombinace MCHC a RDW (nebo HDW) Významně zvýšený u HS Kombinace % hyperdenzních buněk a RDW Významný diagnostický ukazatel těžké HS % mikrocytů Nejlepší indikátor závažnosti HS Kombinace MCHC a % hyperdenzních buněk Rozlišující znak fenotypu pro HS Bolton-Maggs P.H.B., et al: Guidelines for the diagnosis and management of hereditary spherocytosis, British Journal of Haematology,2004; 126, 455-474

Využití průtokové cytometrie Disponuje vysokou senzitivitou a specifitou Patří mezi doporučená screeningová vyšetření k testování vad erytrocytárních membrán využívá kyselinu eosin-5-maleimid (EMA) kovalentně se váže s Lys-430 proteinu band 3 Bolton-Maggs P.H.B., et al: Guidelines for the diagnosis and management of hereditary spherocytosis, British Journal of Haematology,2004; 126, 455-474 obr.: https://www.synchem.de/product/eosin-5-maleimide/

Detekce pomocí průtokové cytometrie u přítomnosti defektu membrány dochází ke snížení fluorescence signálu na kanálu FL1 (525 nm), oproti normální (kontrolní) skupině pacientů King M-J., et.al: Rapid flow cytometric test for the diagnosis of membrane cytoskeleton-associated haemolytic anaemia, British Journal of Haematology, 2000; 111, 924-933

Molekulární genetika HS Protein Mr (kd) Gen Lokalizace na chromozomu α Spektrin 240 SPTA1 1q22-q23 52 β Spektrin 220 SPTB 14q23-q24.1 32 Ankyrin 210 ANK1 8p11.2 42 Band 3 (AE1) 90-100 AE1 (SLC4A1) 17q21-q22 20 Protein 4.1 80 EPB41 1p36.2-p34 22 Protein 4.2 72 EPB42 15q15-q21 13 Glycophorin C 32 GYPC 2q14-q21 4 Počet exonů https://www.sciencemag.org/news/2018/08/scientists-tweak-dna-viable-human-embryos Bolton-Maggs P.H.B., et al: Guidelines for the diagnosis and management of hereditary spherocytosis, British Journal of Haematology,2004; 126, 455-474

Defekty membránových proteinů Nedostatek proteinu (SDS-PAGE) Částečně spektrin a protein 4.2 Částečně ankyrin a spektrin Částečný nedostatek spectrinu výrazný nedostatek spectrinu (rodiče jsou normální) Částečný nedostatek band 3 Částečný nedostatek proteinu 4.2 Primární defekt v proteinu nebo genu Chybí jeden haploidní set k ANK1 Genová mutace ankyrinu Různé molekulární defekty Těžká ndhs způsobená nízkou expresí alely zděděné trans na druhou Sp alelu Band 3 mrna nestabilita Band 3 genetická mutace vedoucí ke ztrátě vazebného místa pro protein 4.2 znalost genové mutace neovlivňuje klinickou léčbu pacienta Bolton-Maggs P.H.B., et al: Guidelines for the diagnosis and management of hereditary spherocytosis, British Journal of Haematology,2004; 126, 455-474

Analýza mutantních genů Identifikace defektu primárních genů; rodinné studie poskytují informace o tom, zda je abnormální protein v probandu kódován mutantním kandidátským genem nebo v důsledku sekundární události způsobené mutací v jiném genovém proteinu Potvrzení recesivní nebo non-dominantní dědičnosti, v případě obou zdravých rodičů Bolton-Maggs P.H.B., et al: Guidelines for the diagnosis and management of hereditary spherocytosis, British Journal of Haematology,2004; 126, 455-474

Přidružené komplikace 1. Bilirubinové žlučníkové kameny (až u 50% pacientů) 2. Hemolytická krize (relativně vzácně, zejm. v souvislosti s infekcemi - zhoršení anémie v průběhu infekce) 3. Megaloblastová krize 4. Aplastická krize 5. Infekční komplikace po splenektomii 6. Dna 7. Ulcerace dolních končetin z poruch mikrocirkulace Klener P.: Hematologie, Anémie III, Polycytémie; Ústav Patol. Fyziologie 1.LF UK v Praze

Terapie Metodou volby je splenektomie Klener P.: Hematologie, Anémie III, Polycytémie; Ústav Patol. Fyziologie 1.LF UK v Praze Obr.: https://adventrum.ch/operationen/milzentfernung/

Kazuistika žena, 29 let Periferní krev genetické vyšetření se souhlasem Metoda: NGS, Sanger sekvenování Referenční sekvence: ANK1(NM_000037.3), EPB42 (NM_000119.2), SPTA1 (NM_003126.2), SPTB (NM_000347.5) Výsledek: v genu ANK1 nalezena patogenní varianta v heterozygotním stavu c.2559-3_2562del. Obr.: http://www.astrochem.org/sci/nucleobases.php

Kazuistika žena, 29 let Hematologické laboratorní výsledky: Hb: 124 g/l (120-160 g/l) MCV: 84,6 fl (82-98 fl) MCHC: 338 g/l (320-360 g/l) RDW-SD: 42,4 fl RDW-CV: 13,8% (10-15,2%)

Nátěr PK Nátěr PK s imerzí

Výsledky z FC žena, 29let Snížení fluorescence signálu po vazbě s EMA na membránu erytrocytů Průkaz hereditární sférocytózy kontrola pacient

Dědičnost HS Syn probandky r. nar. 2017 Periferní krev genetické vyšetření se souhlasem Metoda: NGS, Sanger sekvenování Referenční sekvence: NM_000037.3, NM_001142446.1; hg38 Výsledek: v genu ANK1 nalezena patogenní varianta v heterozygotním stavu c.2559-3_2562del.

Syn probandky Hematologické laboratorní výsledky: Hb: 95 g/l (115-135 g/l) MCV: 78,6 fl (70-86 fl) MCHC: 341 g/l (300-360 g/l) RDW-SD: 56,6 fl RDW-CV: 20,1% (11,5-14,5%)

Nátěr PK Nátěr PK s imerzí

Výsledky z FC syn probandky Snížení fluorescence signálu po vazbě s EMA na membránu erytrocytů Průkaz hereditární sférocytózy kontrola pacient

Dědičnost HS Matka probandky r. nar. 1966 Ve 14 letech podstoupila splenektomii sledování hematologem poté není uvedeno Od r. 2013 sledována po Ca prsu

Dědičnost HS Periferní krev genetické vyšetření se souhlasem Metoda: NGS, Sanger sekvenování Referenční sekvence: NM_000037.3, NM_001142446.1; hg38 Výsledek: v genu ANK1 nalezena patogenní varianta v heterozygotním stavu c.2559-3_2562del.

Matka probandky Hematologické laboratorní výsledky: Hb: 160 g/l (120-160 g/l) MCV: 88,2 fl (82-98 fl) MCHC: 346 g/l (320-360 g/l) RDW-SD: 43,7 fl RDW-CV: 13,6% (10-15,2%)

Nátěr PK Nátěr PK s imerzí

Výsledky z FC matka probandky Snížení fluorescence signálu po vazbě s EMA na membránu erytrocytů Průkaz hereditární sférocytózy kontrola pacient

Kazuistika II. hledání správné diagnózy Muž, 28 let Pohotovost: bolest břicha, nevolnost, zvracení bolest břicha až 6 týdnů, zhoršení po požití potravy, kdy následoval nekrvavý průjem a zvracení zmírnění bolesti jen po požití antacid bez zvýšené teploty, bez zimnice Nekuřák, alkohol jen příležitostně Obezita I. stupně: BMI 33 Rencic J. et.al: Circling Back for the Diagnosis, N ENGL J MED 377;1778-84 November 2, 2017

Kazuistika II. - pohotovost Vyšetření - příjem: TK 145/90 mm Hg; TT 37,1 C; přítomen sklerální ikterus; citlivost v pravém dolním kvadrantu břicha; plicní vyšetření normální počet bílých krvinek 19 800 bb/μl krve (86% Neu, 5% Lymfo, 8% Mono) Hb 16 g/dl (13,6-17,7 g/dl); bilirubin 115 μmol/l (3-19 μmol/l); ALT 185 U/l (<54); AST 157 U/l (10-42); ALP 101 U/l (40-130) Rencic J. et.al: Circling Back for the Diagnosis, N ENGL J MED 377;1778-84 November 2, 2017 https://www.emedicinehealth.com/hemoglobin_levels/article_em.htm#what_does_low_hemoglobin_mean

Kazuistika II. - pohotovost CT břicha: normální játra s mírnou steatózou a splenomegalií; žádné žlučové kameny nebo průkaz cholecystitidy o 2 roky dříve dostal dg. Gilbertův syndrom, když jeho lékař u něj zaznamenal nepřímou hyperbilirubinémii Hospitalizace v nemocnici Léčba: meropenem Rencic J. et.al: Circling Back for the Diagnosis, N ENGL J MED 377;1778-84 November 2, 2017

Kazuistika II. hospitalizace Vyšetření 2.den: abdominální bolest ustoupila Snížení počtu bílých krvinek: 14 200 bb/μl Zvýšení biochemických testů: bilirubin 334 μmol/l; ALT 519 U/l; AST 188 U/l; ALP 171 U/l anti-hbs: pozitivní; HBsAg: negativní anti-hav IgM: negativní anti-hcv: negativní ANA, AMA: negativní Rencic J. et.al: Circling Back for the Diagnosis, N ENGL J MED 377;1778-84 November 2, 2017

A: USG břicha - žlučník naplněný kalem se zhuštěním stěny a pericholecystickou tekutinou Nález odpovídá akutní choledocholitiáze. B: MR břicha nález potvrdila. - infiltrace jater a splenomegalie Rencic J. et.al: Circling Back for the Diagnosis, N ENGL J MED 377;1778-84 November 2, 2017

Kazuistika II. propuštění & co dál? Vyšetření 3.den: afebrilní Bilirubin 97 μmol/l; ALT 292 U/l; AST 89 U/l; ALP 174 U/l; ALP 174 U/l Vysazen meropenem Propuštění z nemocnice (naplánovaná operace) 4. den: schůzka na klinice všeobecného lékařství Lékař: prošel výsledky testů provedeny před 2-ma roky Rencic J. et.al: Circling Back for the Diagnosis, N ENGL J MED 377;1778-84 November 2, 2017

Kazuistika II. výsledky testů před 2 roky Bilirubin 32 μmol/l; LD 320 U/l (120-220) ALT & AST & ALP v normě Hb 15,0 g/dl MCV 83,6 fl MCHC 37g/dl RDW-CV 15,7 % UZ vyšetření: hepatomegalie, splenomegalie, žádné žlučové kameny Rencic J. et.al: Circling Back for the Diagnosis, N ENGL J MED 377;1778-84 November 2, 2017

Kazuistika II. výsledky po propuštění Zvýšený počet retikulocytů 172 100 bb/μl Periferní nátěr: v bb. přítomnost Pappenheimerova tělíska, ale žádné akantocyty, schistocyty nebo sférocyty Info od matky: pacientův otec ve 27 letech podstoupil cholecystektomii pro žlučové kameny Rencic J. et.al: Circling Back for the Diagnosis, N ENGL J MED 377;1778-84 November 2, 2017

Kazuistika II. - operace O 4 týdny později laparoskopická cholecystektomie (více pigmentových žlučových kamenů) Perioperační krevní nátěr malá přítomnost sférocytů Rencic J. et.al: Circling Back for the Diagnosis, N ENGL J MED 377;1778-84 November 2, 2017

Kazuistika II. - diagnóza Měsíc po cholecystektomii návštěva u hematologa Laboratorní hodnoty: normalizace ALT, AST, bilirubinu Test osmotické fragility: zvýšená křehkost erytrocytů Přímý antiglobulinový test nebyl proveden Rencic J. et.al: Circling Back for the Diagnosis, N ENGL J MED 377;1778-84 November 2, 2017

Kazuistika II. - diagnóza Stanovení průtokovou cytometrií pomocí eosin- 5-maleimid: průkaz snížené fluorescence Potvrzení diagnózy dědičné sférocytózy Periferní nátěr získán o 7 měsíců později vykazoval více sférocytů. Rencic J. et.al: Circling Back for the Diagnosis, N ENGL J MED 377;1778-84 November 2, 2017

Kazuistika III. známá dg., ale Dívka 6 let sledována pro dědičnou sférocytózu Matka i dědeček se stejným postižením, oba po splenektomii Klinické projevy dosud minimální Nutná návštěva lékaře pro bolesti břicha (objevily se předešlý den), mírné bolesti hlavy a zvracení teplota v normě, močí bez potíží, stolice normální konzistence vyloučení dietní chyby obj.: bledší, unavená, kardiopulmonárně norm., břicho klidné Virový primoinfekt? Trubačík J.: Bolesti břicha aneb všichni to věděli, všichni to viděli, Pediatr. pro Praxi, 2006; 1: 54-55

Kazuistika III. různorodá symptomatologie Potíže přetrvávaly s rodiči další den příchod do nemocnice Pediatrická amb.: unavená, apatická, dehydrovaná, subikterus, hrdlo klidné, kardiopulm. norm., břicho měkké, prohmatné doporučeno chirurgické vyšetření Chirurgická amb.: nezvrací, břicho měkké, nebolestivé, bez rezistence či peritoneálního dráždění, bledá, dehydrovaná jako NPB se t.č. nejeví, kontrolní vyšetření odpo téhož dne Trubačík J.: Bolesti břicha aneb všichni to věděli, všichni to viděli, Pediatr. pro Praxi, 2006; 1: 54-55

Kazuistika III. hospitalizace Chirurg. amb.: pobledlá, nažloutlý kolorit?, skléry bílé, jazyk povleklý, břicho měkké, lehce dif. citlivé, bez perif. dráždění res.: sledována pro sférocytózu, susp. viróza doporučení: hospitalizace, infuzní terapie, krevní odběry JIP: obj. výrazně bledá, subikterus sklér i kůže, axilární teplota 37,1 C, TK 85/50, počet pulzů 120/min., počet dechů 22/min., zřejmý systolický šelest 2/6 v celém perikordu Trubačík J.: Bolesti břicha aneb všichni to věděli, všichni to viděli, Pediatr. pro Praxi, 2006; 1: 54-55

Kazuistika III. vyšetření KO JIP: břicho měkké s mírnou palpační citlivostí, játra nezvětšena, slezina +2cm KO: Hb 44 g/l; RBC 1,55*10 12 /l; WBC 4,3*10 9 /l; MCV 73,2 fl; MCHC 38,9 g/dl bilirubin 50,7 μmol/l; ALT 0,30 μkat/l; AST 0,38 μkat/l; GGT 0,14 μkat/l; ALP 3,24 μkat/l; CRP 1,5 mg/l; Na 138 mmol/l; K 4,47 mmo/l; Cl - 103 mmo/l dodatečně nalezena PV infekce (často, jako vyvolavatel potíží) Trubačík J.: Bolesti břicha aneb všichni to věděli, všichni to viděli, Pediatr. pro Praxi, 2006; 1: 54-55

Kazuistika III. diagnóza: HS Transfuze erytrocytového koncentrátu Optimalizace parametrů červené krevní řady Uspokojivá kontrola krevního obrazu MUDr. Jan Trubačík: Případ spadá do skupiny příhod, kdy se účastníci nechali svést na falešnou stopu, protože byli limitováni úzkým úhlem pohledu. Z anamnézy bylo všem známo, že pacientka byla sledována kvůli dědičné sférocytóze, každý si všiml některého ze základních symptomů, ale ani jeden nedokázal příhodu správně vyhodnotit. Trubačík J.: Bolesti břicha aneb všichni to věděli, všichni to viděli, Pediatr. pro Praxi, 2006; 1: 54-55

DĚKUJI ZA POZORNOST

Reference Bolton-Maggs P.H.B., Stevens R.F., Dodd N.J., Lamont G., Tittensor P., King M.-J.: Guidelines for the diagnosis and management of hereditary spherocytosis, British Journal of Haematology, 2004; 126, 455-474 https://zdravi.euro.cz/clanek/postgradualni-medicina/hemolyticke-anemie-161359 Klener P.: Hematologie, Anémie III, Polycytémie; Ústav Patol. Fyziologie 1.LF UK v Praze Modified from Dacie J: Hereditary spherocytosis (HS). In The Haemolytic Anaemias, 3rd ed, vol 1. Edinburgh, Churchill Livingstone, 1985, p 134.) Rencic J., Zhou M., Hsu G., Dhaliwal G.: Circling Back for the Diagnosis, N ENGL J MED 377;1778-84 November 2, 2017 https://www.emedicinehealth.com/hemoglobin_levels/article_em.htm#what_doe s_low_hemoglobin_mean https://www.synchem.de/product/eosin-5-maleimide/ https://adventrum.ch/operationen/milzentfernung/ Trubačík J.: Bolesti břicha aneb všichni to věděli, všichni to viděli, Pediatr. pro Praxi, 2006; 1: 54-55