Exprese a variabilita genů ovlivňující růst a vývoj svalové tkáně u prasat

Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav morfologie, fyziologie a genetiky zvířat Exprese a variabilita genů ovlivňující růst a vývoj svalové tkáně u prasat Disertační práce Vedoucí práce: prof. RNDr. Aleš Knoll, Ph.D. Vypracovala: Ing. Michaela Nesvadbová Brno 2012

PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem disertační práci na téma Exprese a variabilita genů ovlivňující růst a vývoj svalové tkáně u prasat vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Disertační práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně. dne podpis doktoranda

Je otázka, co je pro vědce významnější, zda znalost faktů či fantazie. Albert Einstein PODĚKOVÁNÍ Ráda bych touto cestou poděkovala svému vedoucímu disertační práce prof. RNDr. Aleši Knollovi, Ph.D. za cenné rady, odborné vedení a konstruktivní připomínky nezbytné pro vznik této práce. Zvláštní poděkování patří také Mgr. Kristíně Civáňové, Ph.D., Mgr. Zuzaně Vykoukalové, Ph.D., Ing. Janě Zrůstové, Ph.D a Ing. Karlu Bílkovi, Ph.D., kteří mi poskytli své zkušenosti a všestrannou pomoc. Mé poděkování patří i celému kolektivu ústavu za vytvořené pracovní prostředí, které je velmi cennou zkušeností do dalšího profesního života. V neposlední řadě bych chtěla také směrovat svá poděkování všem svým blízkým, za jejich trpělivost a podporu hmotnou i duševní po celou dobu studia.

ABSTRAKT Předložená disertační práce na téma Exprese a variabilita genů ovlivňující růst a vývoj svalové tkáně u prasat se v první části zabývá komparativní analýzou genových transkriptů v kosterní svalovině musculus longissimus dorsi a biceps femoris. Exprese genů byla studována mezi dvěma divergentními typy prasat, české bílé ušlechtilé plemeno a divoké prase, v období jejich intenzivního růstu. Pro tento účel byly použity komerčně dostupné čipy GeneChip Porcine Genome Array (Affymetrix), které umožňují kompletní analýzu transkriptomu prasete domácího. Tato studie umožnila nalézt 537 transkriptů mající nejméně trojnásobně rozdílnou expresi mezi zkoumanými druhy a konkrétní geny, které mohou ovlivňovat vznik, vývoj a růst kosterní svalové tkáně prasat. Pro následnou real-time PCR analýzu byly nejprve analyzovány referenční geny HPRT1, NACA, OAZ1, RPL32, RPS18, TAF4B a TBP a byla vyhodnocena jejich vhodnost pro normalizaci výsledků genové exprese. Jako nejstabilnější a nejvhodnější geny pro naši analýzu byly vybrány HPRT1, OAZ1 a RPS18. Na základě výsledků expresní microarray analýzy a pro validaci těchto výsledků byly následně vybrány geny ANKRD1, C1QTNF3, C5orf13, CNN3, ENHO, GDF8, POSTN, TNNT2, YWHAQ, MYH8, IGF2, MLC1SA a HLA-DRB4, jejichž genové exprese byla kvantifikována pomocí real-time PCR metody. Výsledky této analýzy potvrdily, že exprese sledovaných genů byla významně vyšší ve sledovaných tkáních českého bílého ušlechtilého prasete než u divokého prasete (P < 0,05). Důkladnější analýze byl podroben gen C5orf13 (chromosome 5 open reading frame 13). Byla studována sekvence mrna i DNA a nalezené polymorfizmy byly testovány ve vztahu k užitkovým vlastnostem masné produkce prasat. Provedené asociační studie mezi nalezenými polymorfizmy v genu C5orf13 ukázaly, že tento gen může významně ovlivňovat růst kosterní svalové tkáně prasat. Zjištěné výsledky byly publikovány ve vědeckých časopisech. Klíčová slova: prase, kosterní svalovina, gen, genová exprese, genový polymorfismus, genové transkripty.

ABSTRACT This PhD thesis with the theme "Expression and variability of genes affecting growth and development of muscle tissue in pigs"is, in the first part, concerned with the comparative analysis of gene transcripts in skeletal muscles musculus longissimus dorsi and biceps femoris. Gene expression was studied between two divergent types of pigs, Czech Large White Pig and wild boar, in the period of intensive growth. For this purpose, the commercially available GeneChip Porcine Genome Array (Affymetrix), which enables comprehensive coverage of the pig transcriptome, was used. This study allowed finding of 537 transcripts that have at least three-fold difference in expression between the investigated pig species and specific genes that may affect the formation, development and growth of skeletal muscle tissue of pigs. Reference genes HPRT1, NACA, OAZ1, RPL32, RPS18, TAF4B and TBP were subjected to subsequent real-time PCR analysis and their suitability for normalization of gene expression results was evaluated. Our results show that the most stable and the most suitable genes for further analysis were HPRT1, OAZ1 a RPS18. Subsequently, based on the results of microarray analysis and for validation of these results genes ANKRD1, C1QTNF3, C5orf13, CNN3, ENHO, GDF8, POSTN, TNNT2, YWHAQ, MYH8, IGF2, MLC1SA and HLA-DRB4 have been selected and their gene expression was quantified using real-time PCR method. The results of this analysis confirmed that the gene expression of studied genes was significantly higher in observed tissues of Czech Large White Pig (P < 0.05). C5orf13 gene (chromosome 5 open reading frame 13) has been subjected to genetic analysis. The mrna and DNA sequence was determined and we found the polymorphisms that were tested in relation to the properties of meat production of pigs. Performed association studies between polymorphisms in the C5orf13 gene revealed that this gene may significantly affect the growth of skeletal muscle tissue of pigs. The results were published in scientific journals. Key words: pig, skeletal muscle, gene, gene expression, gene polymorphisms; gene transcripts.

OBSAH 1 ÚVOD... 8 2 CÍL PRÁCE... 9 3 LITERÁRNÍ PŘEHLED... 10 3.1 CHARAKTERISTIKA, VÝVOJ A FUNKCE SVALOVÉ TKÁNĚ... 10 3.1.1 Maso... 10 3.1.2 Kosterní svalová tkáň... 11 3.1.3 Vznik a vývoj kosterní svaloviny... 13 3.1.3.1 Myogenní regulační faktory... 15 3.1.3.2 Molekulární regulace myogeneze v somitech... 16 3.1.3.3 Molekulární regulace vývoje svaloviny končetin... 17 3.1.3.4 Molekulární regulace vývoje svaloviny hlavy a krku... 18 3.1.3.5 Postnatální vývoj a regenerace svalové tkáně... 19 3.1.3.6 Růstové faktory ovlivňující růst a vývoj svalové tkáně... 21 3.1.3.7 Role microrna ve vzniku a vývoji kosterní svaloviny... 24 3.2 DIVOKÉ DRUHY PRASAT VERSUS MODERNÍ PLEMENA PRASAT... 26 3.2.1 Divoká prasata a jejich domestikace... 26 3.2.2 České bílé ušlechtilé plemeno prasat... 28 3.3 GENOVÁ EXPRESE A JEJÍ ANALÝZA... 30 3.3.1 Exprese genetické informace... 30 3.3.2 Genomika prasat... 31 3.3.3 Metody analýzy genové exprese... 32 3.3.3.1 Real-time PCR...33 3.3.3.2 Microarray technologie... 42 3.4 PŘEHLED STUDOVANÝCH GENŮ... 55 3.4.1 Referenční geny... 55 3.4.2 Analyzované geny... 57 4 MATERIÁL A METODIKA... 63 4.1 VÝBĚR VHODNÝCH REFERENČNÍCH GENŮ PRO STUDIUM GENOVÉ EXPRESE VE SVALOVÉ TKÁNI PRASETE POMOCÍ METODY REAL-TIME PCR... 63 4.1.1 Analyzované vzorky...63 4.1.2 Izolace RNA, reverzní transkripce... 63 4.1.3 Real-time PCR... 63 4.2 KOMPARATIVNÍ ANALÝZA GENOVÝCH TRANSKRIPTŮ V KOSTERNÍ SVALOVÉ TKÁNI PRASETE DOMÁCÍHO A DIVOKÉHO... 66 4.2.1 Analyzované vzorky... 66 4.2.2 Izolace RNA... 66 4.2.3 Microarray analýza... 67 4.2.4 Reverzní transkripce a kvantitativní real-time PCR... 68

4.3 ANALÝZA GENU C5ORF13... 71 4.3.1 Analyzované vzorky...71 4.3.2 PCR reakce... 71 4.3.3 Sekvenování... 72 4.3.4 Testování nalezených polymorfizmů a asociační analýza... 72 5 VÝSLEDKY A DISKUZE... 74 5.1 VÝBĚR VHODNÝCH REFERENČNÍCH GENŮ PRO STUDIUM GENOVÉ EXPRESE VE SVALOVÉ TKÁNI PRASETE POMOCÍ METODY REAL-TIME PCR... 74 5.1.1 Kandidátní referenční geny a jejich real-time PCR analýza... 74 5.1.2 Výběr nejstabilnějších referenčních genů... 76 5.2 KOMPARATIVNÍ ANALÝZA GENOVÝCH TRANSKRIPTŮ V KOSTERNÍ SVALOVÉ TKÁNI PRASETE DOMÁCÍHO A DIVOKÉHO... 79 5.2.1. Microarray analýza... 79 5.2.2.1 Identifikace diferenciálně exprimovaných genů... 79 5.2.2.2 Genová ontologie a anotace diferenciálně exprimovaných genů... 80 5.2.2.3 Geny souvisejících s vývojem, růstem a regenerací kosterní svalové tkáně... 83 5.2.2.4 Signální dráhy genů... 83 5.2.2. Validace výsledků microarray analýzy pomocí metody real-time PCR... 93 5.3 ANALÝZA GENU C5ORF13... 100 5.3.1. Analýza exprese genu v kosterní svalové tkáni prasat... 100 5.3.2. Identifikace polymorfizmů a asociační analýza... 102 6 ZÁVĚR... 109 7 PŘEHLED POUŽITÉ LITERATURY... 112 8 SEZNAM OBRÁZKŮ... 136 9 SEZNAM TABULEK... 138 PŘÍLOHY... 140 SEZNAM PŘÍLOH...141

1 ÚVOD Hlavním cílem chovu hospodářských zvířat je produkce potravin pro lidskou spotřebu. Proto je i výzkum a vývoj v této oblasti zemědělství zaměřen především na porozumění biologických mechanizmů souvisejících s produkčními vlastnostmi hospodářských zvířat. Pro udržení konkurenceschopnosti chovatelů je důležité minimalizovat výrobní náklady a současně zvyšovat efektivitu produkce bez zhoršení kvality produktů. Prase domácí (Sus scrofa f. domestica) patří mezi nejdůležitější hospodářská zvířata chované zejména pro jejich maso, tuk a kůži. Mimo to, díky své fyziologické podobnosti s člověkem, je prase také důležitý modelový organismus, který nachází využití především v humánní medicíně. Genetika masné užitkovosti prasat je předmětem zájmu výzkumníků na celém světě. Selekci a hybridizaci prasat, vedoucí ke zlepšení ekonomiky produkce, však limituje nedostatek znalostí o genech a jejich vzájemných interakcích. Molekulární biologie a genetika dokáže překonat tyto limity. Množství informací, které jsou aktuálně dostupné o genomu mnoha druhů hospodářských zvířat, včetně prasete, se v posledních letech dramaticky zvyšuje. Velkou měrou tomu napomáhá i současný rychlý vývoj genomických metod, které nám umožňují nalézt odpovědi na otázku jaká je funkce a regulace genů a součástí jaké genetické sítě tyto geny jsou. Předložená práce se zabývá analýzou exprese genů pomocí microarray a kvantitativní real-time PCR metody. Využití čipových technologií umožňuje analyzovat několik tisíců genů současně v jediném experimentu. Počet identifikovaných genů se tak rapidně zvyšuje a v současné době je studium regulační funkce genů předmětem výzkumu v celosvětovém měřítku. V druhé fázi byl výzkum zaměřen na vybraný gen C5orf13 (chromosome 5 open reading frame 13), který byl podroben detailnější analýze včetně nalezení polymorfních míst a asociační analýzy. Jelikož výzkum v oblasti užitkových vlastností hospodářských zvířat je v této době nasměrován na studium kandidátních genů a následné využití získaných poznatků v selekci zvířat, i tato práce se snaží přispět k poznání genů majících vliv na masnou užitkovost prasat a její výsledky mohou být využity pro efektivnější produkci vepřového masa. 8

2 CÍL PRÁCE Hlavním cílem této disertační práce je rozšířit naše poznatky o růstu kosterní svalové tkáně a masné užitkovosti prasat z pohledu molekulární biologie a genetiky. Tohoto cíle bude dosaženo pomocí analýzy exprese genů v kosterní svalové tkáni bílého ušlechtilého a divokého prasete v období jejich intenzivního růstu a následné identifikace genů ovlivňujících růst svalové tkáně a masnou užitkovost prasat. Vybrané diferenciálně exprimované geny, které mají nebo mohou mít vztah ke sledovaným vlastnostem, budou identifikovány na základě metody expresních microarray. Exprese sledovaných genů bude ověřena metodou kvantitativní real-time PCR, čemuž bude předcházet nalezení vhodných referenčních genů pro sledovanou tkáň a dané laboratorní podmínky. Na základě výsledků expresní analýzy bude vybrán konkrétní gen, který bude dále podroben další detailnější analýze. Cílem bude studium sekvence RNA i DNA, analýza transkriptů, nalezení polymorfních míst, vyhodnocení potenciálního vlivu na znaky masné užitkovosti plemene české bílé ušlechtilé prostřednictvím asociační analýzy a optimalizace laboratorní metodiky pro testování. 9

3 LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Charakteristika, vývoj a funkce svalové tkáně 3.1.1 Maso Maso je oblíbená složka lidské potravy představující hlavní zdroj kvalitních bílkovin, bohatý zdroj nenasycených mastných kyselin, vitamínů, minerálů a železa. Pod pojmem maso rozumíme všechny části těl živočichů, které se hodí k výživě lidí. V užším slova smyslu je to kosterní svalovina zvířat, a to buď samotná svalová tkáň nebo svalová tkáň a s ní související tkáně (vmezeřený tuk, cévy, nervy, vazivové a jiné části). Hlavní složkou masa je příčně pruhovaná svalovina, tuková tkáň a vazivo. Svalovina hospodářských zvířat obsahuje přibližně 70 75 % vody, 18 22 % bílkovin, 1 3 % tuku a 1 1,5 % minerálních látek (Kadlec, 2002).Složení některých částí vepřového masa je uvedeno v Tab. 1. Tab. 1: Složení vepřového masa (přepracováno dle Steinhauser, 1995). Voda % Bílkoviny % Tuky % Minerálie % Federovo číslo* Podíl tuku a bílkovin Bůček 34 7,1 56 0,5 4,8 7,09 Kýta 53 15,2 31 0,8 3,5 2,04 Pečeně 58 16,4 25 0,9 3,5 1,52 Plec 49 13,5 37 0,7 3,6 2,74 *Federovo číslo je poměr obsahu vody a bílkovin. Spotřeba vepřového masa v Evropské unii v posledních letech stagnuje, ale i přesto tento druh masa patří mezi spotřebiteli k velmi oblíbeným. Ve srovnání s ostatními státy Evropské unie jsou Češi průměrní spotřebitelé masa. Roční spotřeba masa se u nás pohybuje okolo 80 kilogramů na osobu a z toho množství připadá celá polovina na maso vepřové (Sekaninová, 2011). Současný trh vyžaduje zejména prasata masného typu s vysokým podílem libové svaloviny. Šlechtění a chov prasat je proto zaměřen na produkci zvířat s maximálním podílem svaloviny a s minimálním podílem tukové tkáně s ohledem na znaky kvality masa. Ve šlechtitelských programech se tedy u otcovských linií prasat sleduje především přírůstek, zmasilost, výška hřbetního tuku, příjem krmiva a jeho konverze, utváře- 10

ní jatečního těla (kýta, kotleta), výtěžnost masitých částí těla, kvalita masa (ph, odkap, barva, obsah intramuskulárního tuku), utváření končetin a tělesný rámec (Rytina, 2010). 3.1.2 Kosterní svalová tkáň U savců rozlišujeme z funkčního a morfologického hlediska tři typy svalové tkáně: hladkou, srdeční a kosterní. Hladká svalová tkáň (orgánová) tvoří nejčastěji stěny dutých orgánů nebo cév. Svalovina srdeční je, jak je z jejího názvu patrné, příčně pruhovaná svalovina srdeční stěny. Z hlediska lidské výživy a zpracování masa je nejvýznamnější kosterní svalovina (příčně pruhovaná). Základní morfologickou a funkční jednotkou kosterní svaloviny (Obr. 1) je svalové vlákno vznikající splynutím velkého počtu buněk. Povrch svalového vlákna tvoří buněčná membrána, sarkolema, pod níž jsou uložena oválná buněčná jádra. Jednotlivé organely svalové buňky se nachází v cytoplaz-mě svalového vlákna (sarkoplasmě). Sarkoplasma mimo to obsahuje podélně uložená vlákna (myofibrily), kterých může být v jediném svalovém vlákně až tisíc. Myofibrily jsou složeny z vlákének, které označujeme jako myofilamenta, na jejichž stavbě se podílejí molekuly aktinu, myosinu, tropomyosinu a troponinu rozdělující myofibrilu a umožňující její kontrakci Obr. 1: Struktura kosterního svalu (přepracováno dle Willmer et al., (Steinhauser, 1995). 2005). 11

Přestože svalová vlákna mají řadu společných znaků umožňujících jejich obecný popis, sval je heterogenní soubor vláken, které se liší v mikroskopických, histochemických a fyziologických vlastnostech. Obecně rozlišujeme čtyři typy vláken kosterního svalu: pomalá červená vlákna (typ I, SO slow oxidative), rychlá bílá vlákna (typ IIa, FOG fast oxidative glycolytic), rychlá červená vlákna (typ IIb, FG fast glycolytic) a vlákna přechodná (typ III). Pomalá červená vlákna jsou tenká vlákna, která obsahují méně myofibril, ale mají vysoký obsah mitochondrií, krevních kapilár a myoglobinu, který jim dodává červenou barvu. Tyto vlákna jsou vhodná pro stavbu svalů zajišťujících spíše statické a polohové funkce a pomalý pohyb. Málo se unaví a jsou důležitá pro vytrvalostní činnost svalů. Rychlá bílá vlákna jsou silnější vlákna obsahující více myofibril, méně mitochondrií a střední množství kapilár. Vlákna tohoto typu jsou velmi odolná proti únavě a zajišťují rychlý pohyb, který je prováděn velkou silou. Velký objem, málo kapilár, nízký obsah myoglobinu a vysoký obsah glykogenu mají rychlá červená vlákna. Tyto vlákna jsou málo odolná proti únavě, ale jejich předností je rychlý stah prováděný maximální silou. Posledním typem jsou vlákna přechodná, představující vývojově nediferencovanou skupinu vláken, která je pravděpodobně zdrojem předchozích tří typů vláken (Dylevský, 2007). Charakteristika typu vláken kosterního svalu se provádí na základě stanovení aktivity svalových enzymů, a to myozinové ATPázy (aktivita enzymu je přímo úměrná rychlosti svalové kontrakce specifických vláken), sukcinyldehydrogenázy (SDH) (enzym indikující vysoké úrovně oxidativního metabolismu) a α-glycerolfosfát dehydrogenázy (αgpdh) (charakterizuje glykolytický nebo anaerobní metabolismus buňky). Svalová vlákna lze rozlišit také dle zastoupení různých izoforem kontraktilních proteinů, konkrétně tzv. těžkých myozinových řetězců (MHC myosin heavy chains). Takto lze rozlišit čtyři typy svalových vláken: typ 1, 2A, 2B a 2X (Hossner, 2005). Souhrnnou charakteristiku a rozdělení typů vláken kosterní svaloviny udává Tab. 2. Velikost a počet svalových vláken jsou důležité faktory ovlivňující růstový potenciál, masnou užitkovost zvířat a kvalitu masa po porážce. Prase, ačkoliv není největší savec, má svalová vlákna největší (Rehfeldt et al., 2004). Přestože svalová vlákna lze obecně rozdělit podle jejich kontraktilních a metabolických charakteristik, ve skutečnosti se ve většině svalů nacházejí všechny typy svalových vláken (viz review Lee 12

et al., 2010). Svalovina prasat obsahuje vlákna různých typů typického vzoru. Ostrůvky pomalých vláken jsou obklopeny rychlými vlákny typu 2A a 2X a na okrajích rychlými vlákny 2B (Lefaucheur et al., 2002). Vysoký poměr vláken typu 2B ve svalové tkáni prasat může snižovat masnou kvalitu, jelikož koreluje s přítomností recesivní alely genu pro halotan a s nižšími hodnotami ph masa postmortem (Depreux et al., 2002). Tab. 2: Typy vláken kosterního svalu (přepracováno dle Hossner, 2005). Svalové vlákno MHC typ ATPáza SDH GPDH Typ I (SO) 1 + + + + + + Typ IIa ( FOG) 2A + + + + + + + + + + + + Typ IIb (FG) 2B + + + + + + + + + Typ III (FG) 2X + + + + + + + + + Zvířata s vyšším množstvím svalových vláken střední velikosti produkují maso vyšší kvality i kvantity. O tom, kolik svalových vláken bude v těle vytvořeno, je rozhodnuto většinou během myogeneze. Z toho vyplývá, že počet svalových vláken je determinován především genetickými faktory a faktory prostředí, které jsou schopné ovlivnit prenatální myogenezi. Dosažení optimální rovnováhy v dostatečném množství a velikosti svalových vláken a eliminace vláken abnormální struktury je důležitý krok v produkci masa vysoké kvality a kvantity. Poznání environmentálních a genetických vlivů ovlivňujících prenatální a postnatální růst kosterního svalu je důležité pro vývoj strategií a praktických přístupů v živočišné výrobě, které jsou založeny na selekci nebo environmentální modulaci prenatální myogeneze a postnatálního svalového růstu (Rehfeldt et al., 2004). 3.1.3 Vznik a vývoj kosterní svaloviny Proces, při němž se z embryonálních základů diferencuje svalová tkáň se nazývá myogeneze (Obr. 2). Tento proces je regulován dostupností živin a je pod kontrolou různých genů, růstových faktorů, hormonů a dalších proteinů, které mohou ovlivnit myogenezi na úrovni transkripce a translace (Rehfeldt et al., 2010). Svalová tkáň vzniká ze středního zárodečného listu mezodermu, který se diferencuje v raném embryonálním období. Základem většiny kosterních svalů obratlovců jsou somity (prvosegmenty) vznikající z paraxiálního mezodermu nacházejícího se kolem 13

hřbetní struny (notochord) a neurální trubice. Během embryonálního vývoje se somity diferencují na dva úseky, dorzální dermomyotom tvořící základ škáry kůže a svalových progenitorových buněk a ventrální sklerotom, který je základem osové kostry. Dermomyotom je dále rozdělen na epaxiální a hypaxiální část, která se dále diferencuje na myotomy. Epaxiální myotom tvoří základ pro vznik svaloviny trupu, hypaxiální myotom je nezbytný pro tvorbu svalů končetin, bránice a stěny tělní (viz review Yokoyama & Asahara, 2011). Obr. 2: Schematické znázornění vzniku kosterní svaloviny (přepracováno dle Kollias & McDermott, 2008). V první fázi myogeneze se z myotomů diferencují myoblasty, které se řadí za sebou do sloupců. V místě dotyku myoblastů dochází k zániku jejich buněčných membrán a vznikají syncyciálně uspřádané myotuby, které se během vývoje a diferenciace svalu prodlužují. Některé buňky myotomů však zůstávají nediferencované až do dospělosti (tzv. satelitní buňky). Satelitní buňky jsou uloženy na povrchu myotuby a společně jsou kryty buněčnou membránou. Tyto buňky si zachovávají schopnost buněčného dělení a diferenciace a slouží například jako rezervní materiál při regeneraci svalového vlákna nebo se účastní procesu růstu svalových vláken během postnatálního vývoje. V další fázi vývoje svalů dochází k diferenciaci jednotlivých typů myofibril, další diferenciaci myoblastů a ke vzniku příčně pruhovaného svalového vlákna (Černý, 2005). U plodu prasete je utváření primárních svalových vláken ukončeno mezi 35. a 65. dnem, sekundárních vláken mezi 54. a 90. dnem březosti (Lefaucheur et al.,1995). 14

3.1.3.1 Myogenní regulační faktory Díky rozsáhlým výzkumům v posledních desetiletích, které využívají především modelových organismů molekulární biologie jako je myš (mus musculus), kur domácí (gallus gallus) nebo zebřička (danio renio), byla identifikována řada genů a regulačních drah, které kontrolují a jsou zapojeny v procesu vzniku a vývoje svalové tkáně obratlovců. Aktivace buněk embrya podílejících se na myogenezi je řízena sériemi komplexních transkripčních regulačních drah, jejichž výsledkem je exprese skupiny tzv. myogenních regulačních faktorů (MRF) zahrnující myogenní faktor 5 (MYF5), myoblastický diferenciační faktor (MYOD, MYODI), herkulin (MYF6, MRF4) a myogenin (MYOG) (viz review Bryson-Richardson & Currie, 2008). Výsledkem působení MRF je aktivace signální dráhy navozující diferenciaci buněk a vznik svalové tkáně. MYF5 a MYOD hrají klíčovou roli především v raném stupni diferenciace svalových buněk, MRF4 a MYOG v utváření svalových vláken a pozdějších stádiích diferenciace (Obr. 3) (Brameld et al., 2010). Obr. 3: Úloha myogenních regulačních faktorů (MRF) v myogenezi (přepracováno dle Hettmer & Wagers, 2010). Gen MYF5 je nejprve přechodně exprimován v paraxiálním mezodermu před zahájením procesu myogeneze, poté v okrajích dermomyotomu, kde inicializuje migraci a diferenciaci buněk. Správná činnost genu je důležitá pro vývoj svaloviny trupu., jelikož výsledkem knockoutu genu je výrazně opožděný vývoj této svalové tkáně, přičemž vývoj svalové tkáně končetin je nedotčen. Expresi genu MYF5 následuje exprese genu MRF4. Tento gen hraje klíčovou roli v primární fázi myogeneze a vzniku myotub, a přestože není nezbytně nutný pro diferenciaci svaloviny a jeho inaktivace nezpůsobuje svalové defekty, funguje jako determinant a diferenciační faktor. Při inaktivaci genů 15

MYF5 a MYOD může MRF4 samostatně řídit svalový vývoj. Avšak genový knockout MYF4 a MYF5 způsobuje opožděné utváření myotomů a expresi genu MYOD. MYOD současně s genem MEF2 (myocyte enhancer factor 2) řídí transkripci genů souvisejících s myogenezí svalové tkáně. Exprese genu je pod kontrolou genů PAX3 (paired box 3), MRF4, MYF5, SIX1 (SIX homeobox 1) a SIX4 (SIX homeobox 4). Jeho inaktivace je kritická v období dospělosti v procesu regenerace svalu, ale i v období embryonálním. Embrya vykazují normální vývoj epaxiální svaloviny, na druhou stranu vývoj svalů končetin je zastaven. Gen MYOD zahajuje diferenciaci myoblastů aktivací exprese genu MYOG, který je nepostradatelný pro fúzi myoblastů a jejich formování v myotuby. Inaktivace MYOG vede k úmrtí narozeného jedince, oblast svaloviny končetin obsahuje jen jednojaderné buňky a pouze výjimečně myofibrily (viz review Bismuth & Relaix, 2010). 3.1.3.2 Molekulární regulace myogeneze v somitech Signální dráhy exprese specifických transkripčních faktorů v epaxiálních a hypaxiálních somitech, končetinách, hlavě, krku nebo dospělém jedinci mají několik odlišných rysů (Obr. 4). Obr. 4: Regulačních dráhy kontrolující vznik a vývoje specifické svalové tkáně obratlovců. V šedém rámečku jsou znázorněny klíčové MRF nepostradatelné pro aktivaci myogeneze dané tkáně. Pozitivní regulátory jsou označeny červeně, inhibitory modře, černé šipky zobrazují vzájemné genetické interakce (přepracováno dle Mok & Sweetman, 2011). Vznik epaxiálního myotomu, tvořící základ svaloviny trupu, kontroluje gen Sonic hedgehog (SHH). Proteiny Sonic Hedgehog, které produkuje chorda a ploténka neurální trubice, ovlivňují buňky dorsomediálního okraje dermomyotomu, podporují v těchto 16

buňkách genovou expresi a iniciují aktivaci signálních drah navozujících myogenezi (viz review Bryson-Richardson & Currie, 2008). Na rozdíl od toho, hypaxiální dermomyotom, který je základem pro svalovou tkáň končetin, bránice a stěny tělní, je pod vlivem signálů z dorzálního ektodermu (WNT dráha) a laterální ploténky mezodermu (BMP4 dráha) (viz review Yokoyama & Asahara, 2011). Také funkce genu PAX3, jehož expresi zajišťují svalové progenitorové buňky, je v epaxiální a hypaxiální somitech odlišná. Spontánní mutace genu Pax3 u myší (tzv. Splotch myši) je příčinou nevytvoření hypaxiální somitové domény a následkem toho i svaloviny končetin a některých svalů těla, zatímco svaly odvozené z epaxiální části jsou méně ovlivněné. Progenitorové svalové buňky exprimují mimo genu PAX3 také gen PAX7 (paired box 7). Tento gen však není tak důležitý pro svalový vývoj v embryonálním období, jako v období postnatálním. Přesto inaktivace PAX3 i PAX7 má za následek neschopnost svalových progenitorových buněk vstoupit do procesu myogeneze a proto je kritická pro vznik svalové tkáně. Kromě toho tyto geny také kontrolují expresi MRF jako je MYF5 a MYOD a zároveň přispívají k proliferaci a přežití myoblastů před jejich diferenciací (viz review Mok & Sweetman, 2011). Nejvýznamnější regulátor exprese PAX3 v dermomyotomu je genetická síť SIX-EYA- DACH. Geny SIX1 a SIX4 kontrolují hypaxiální expresi PAX3 a nepřítomnost jejich proteinů způsobuje absenci svalů končetin, které vznikají z migrujících hypaxiálních buněk. Potlačení exprese SIX1 a EYA2 (eyes absent homolog 2) je dostatečná k tomu, aby byla zahájena exprese MRF v somitech. SIX geny také kontrolují expresi MRF v myotomech (viz review Bismuth & Relaix, 2010). SIX1 a SIX4 regulují expresi genu MRF4 a inaktivace těchto genů způsobuje u embryí také opožděnou a nižší hladinu exprese genů MYOD a MYOG, zatímco exprese genu MYF5 zůstává beze změny (viz review Bryson-Richardson & Currie, 2008). 3.1.3.3 Molekulární regulace vývoje svaloviny končetin Přestože svaly končetin se vyvíjí ze somitů stejně jako svaly trupu, jsou vývojové stezky v několika rysech odlišné (Obr. 4). Svaly končetin vznikají z myogenních prekurzorových buněk hypaxiálního dermomyotomu, které migrují ze somitů ke končetinovým pupenům. Klíčovou roli v migraci buněk z dermomyotomu a vzniku svaloviny 17

končetin hraje HGF (hepatocyte growth factor) a jeho receptor c-met (hepatocyte growth factor receptor) (viz review Mok & Sweetman, 2011). V migrujících buňkách je exprimován gen PAX3, který zajišťuje proliferující stav migrujících buněk, udržuje aktivní expresi receptoru c-met, brání apoptóze buněk hypaxiálního somitu a expresi MRF. S genem PAX3 je současně exprimován také gen LBX1 (ladybird homeobox 1) kontrolující nalezení správné cesty a vstup migrujících buněk do končetinového pupenu. Jeho inaktivace způsobuje absenci dorzální svaloviny předních končetin a veškerých svalů končetiny zadní. Jak již bylo řečeno, pro specifikaci hypaxiální svaloviny a migraci myogenních prekurzorových buněk somitů ke končetinám jsou nezbytné také geny SIX1, SIX4, EYA1 a EYA2. Další z genů, který je exprimován migrujícími svalovými buňkami je CXCR4 (chemokine (C-X-C motif) receptor 4) podílející se na řízení migrace buněk, dosažení jejich cíle a zabezpečující jejich přežití. Ligand tohoto genu SDF1 (chemokine (C-X-C motif) ligand 12) je exprimován v mezenchymu končetinového pupenu, který slouží jako cílové místo těchto migrujících buněk (viz review Yokoyama & Asahara, 2011). Za účasti transkripčních faktorů MEOX2 (mesenchyme homeobox 2) a PITX2 (paired-like homeodomain 2) migrující buňky tvoří dva úseky tkáně, dorzální a ventrální, které se po dosažení svého cílového místa následně diferencují ve svalovou tkáň přední a zadní končetiny a exprimují svalově specifické geny (jako první je exprimován MYF5, po několika hodinách také MYOD a MYOG). Mutace v genu MOEX2 vede ke ztrátě specifického souboru svalů končetin. Také role MRF v svalovině končetin a trupu jsou odlišné, jak již bylo uvedeno výše (viz review Bismuth & Relaix, 2010). 3.1.3.4 Molekulární regulace vývoje svaloviny hlavy a krku Genetické regulační sítě vývoje svaloviny hlavy a krku (Obr. 4) jsou odlišné nejen od sítí, které řídí vznik svaloviny těla, ale také mezi různými skupinami těchto svalů. Svaly jazyka jsou odvozeny ze somitů (okcipitální somity), zatímco svaly čelisti a oka vznikají z mezodermu, který somity nevytváří (nesegmentovaný paraxiální mezoderm). Pro svaly pocházející z mezodermu nevytvářejícího somity je typická nepřítomnost produktů genů PAX3 a PAX7. Namísto toho jsou exprimovány transkripční faktory jako je PITX2, TBX1 (T-box 1) (viz review Mok & Sweetman, 2011), MYOR (musculin) 18

a TCF21 (capsulin). Exprese genu PITX2 a TBX1 předchází expresi MRF. Následkem inaktivace genu PITX2 nedochází k vývoji svalů vznikajících z prvního žaberního oblouku včetně periokulárních svalů a svalů čelisti. Transkripční faktor TBX1 je rovnocenný ekvivalent genu PAX3 a je zodpovědný za zahájení myogeneze svalů hlavy a krku. Disfunkce tohoto genu způsobuje smrt jedince po narození, defekty v kraniofaciálních a kardiovaskulárních strukturách a poškození svaloviny hlavy a krku. Geny MYOR a TCF21 mají významnou funkci ve specifikaci budoucích žvýkacích svalů. Následkem jejich inaktivace nedochází v prvním žaberním oblouku k expresi MRF a k vývoji svalů, jelikož myogenní buňky podléhají apoptóze (viz review Bismuth & Relaix, 2010). 3.1.3.5 Postnatální vývoj a regenerace svalové tkáně Postnatální období je spojeno s růstem délky a objemu svalových vláken. Kapacitu postnatálního svalového růstu určuje počet svalových vláken, které jsou vytvořeny v průběhu prenatální myogeneze. Tempo růstu je limitováno fyziologickými a genetickými faktory. Platí, že čím je větší počet svalových vláken, tím je pomalejší postnatální tempo růstu svalového vlákna a menší objem vlákna na konci intenzivní doby růstu a naopak. Důvodem toho je rovnoměrná distribuce energie z výživy, která je rozdělena mezi všechna vlákna. Nicméně toto pravidlo není obecně platné vždy, protože některá zvířata rostou rychle, přestože mají vysoký počet svalových vláken (Rehfeldt et al., 2004). Postnatálního růstu svalových vláken se účastní satelitní buňky, které jsou zdrojem nových jader začleňujících se do již vytvořeného svalového vlákna. K připojování buněk dochází na koncích svalového vlákna, a tak dochází k jeho prodlužování. Tento proces je závislí především na faktorech jako je inervace, kontraktilní aktivita, růstové faktory, hormony a výživa. Počet svalových vláken savců a ptáků zůstává po narození většinou nezměněný. Přesto dochází u prasat krátce po narození k vytvoření svalových vláken velmi malého průměru, které vysvětluje navýšení celkového počtu svalových vláken v období od narození do věku 5 týdnů (Rehfeldt et al., 2000). V průběhu rané postnatální růstové fáze svalové tkáně může její množství zdvojnásobit během několika málo dnů. U myši, prasete nebo kapra se první měsíc po narození zdvojnásobí množství svalové tkáně každých 4 až 5 dnů (Goldspink, 2004). 19

Obr. 5: Schematické znázornění molekulární regulace satelitních buněk v průběhu regenerace kosterní svalové tkáně. Při poškození vlákna (A) doposud mitoticky klidné satelitní buňky vstoupí do buněčného cyklu a vznikají tak proliferující myogenní buňky (B). Následně dochází k diferenciaci (C) a fúzi myoblastů s poškozenými myobifrilami (D), které se podobají původnímu svalovému vláknu (E). Některé satelitní buňky se stávají opět klidné a jsou připraveny pro další regeneraci svalového vlákna (F). Procesu se účastní řada růstových faktorů, které fungují jako pozitivní (zeleně označené) nebo negativní (červeně označené)regulátory (Chargé & Rudnicki, 2004). Geny odpovědné za vznik a vývoj svaloviny v embryonálním období hrají také svou roli v dospělosti, kdy se podílí na řízení a aktivaci satelitních buněk během postnatálního růstu nebo zranění (Obr. 5). Vzájemná souhra genů PAX3 a PAX7 je důležitá především během raného postnatálního růstu a má vliv na regenerační schopnosti svalové tkáně (viz review Yokoyama & Asahara, 2011). V dospělém těle jsou satelitní buňky mitoticky klidné. Tyto buňky exprimují produkty genů PAX7 a c-met, jehož ligand HGF aktivuje činnost satelitních buněk. Při poškození svalové tkáně migrují satelitní buňky do oblasti zranění, fúzují mezi sebou a nahrazují poškozená svalová vlákna Mutace genu PAX7 u dospělých jedinců je zodpovědná za výrazné snížení počtu satelitních buněk nebo jejich apoptózu krátce po narození jedince (viz review Bryson-Richardson & Currie, 2008). Také gen MYF5 hraje důležitou roli v regeneraci svalové tkáně, absence produktů toho genu způsobuje zvýšené množství hypertrofických vláken, zpoždění diferenciace a zhoršenou schopnost svalové regenerace. Neméně důležitý je pro regeneraci a diferenciaci satelitních buněk, růst myoblastů, ale i růst jedince i gen MYOD (viz review Yokoyama & Asahara, 2011). 20

3.1.3.6 Růstové faktory ovlivňující růst a vývoj svalové tkáně Inzulinu podobné růstové faktory (IGF) Inzulinu podobné růstové faktory (IGF) hrají klíčovou roli ve vývoji, diferenciaci a přežití buněk kosterní svaloviny. Jsou produkovány různými buňkami včetně myoblastů, satelitních buněk, myofibrilami a fibroblasty. V kosterní svalovině IGF stimulují absorpci glukózy, aminokyselin, syntézu bílkovin a potlačují proteolýzu. Navíc ovlivňují svalové prekurzorové buňky a jsou to jediné extracelulární růstové faktory, které jsou schopny indukovat konečnou diferenciaci myoblastů a satelitních buněk. U embryí prasat se exprese genů IGF1 a IGF2 zvyšuje v průběhu pozdější fáze utváření primárních svalových vláken (44. až 59. den březosti). V průběhu utváření sekundárních myofibril (od 75. dne březosti) je exprese IGF1 stále vysoká, zatímco se exprese IGF2 snižuje. IGF tedy mají důležité regulační úlohy ve všech fázích myogeneze a jejich efekty na myogenezi závisí na stupni vývoje myoblastů. V brzké fázi vývoje, IGF stimulují proliferaci. Trvalá stimulace buněk vede k buněčné diferenciaci, která je charakteristická aktivací exprese MYOG, MYF5 a MYOD. Navíc efekt IGF je závislý na jejich koncentracích. Nízké koncentrace stimulují diferenciaci, zatímco vyšší koncentrace inhibují diferenciaci myoblastů. Inzulinu podobné růstové faktory hrají také důležitou roli v období růstu zralého kosterního svalu, kde indukují proliferaci satelitních buněk, diferenciaci a fúzi myotub. Aplikace IGF pokusným zvířatům indukuje růst svalové hmoty, na druhou stranu knockout genu IGF1 u myší způsobuje podobný fenotyp jako při knockoutu myogeninu, kdy dochází k celkové poruše vývoje kosterní svaloviny (Hossner, 2005). Myostatin (MSTN, GDF 8) Myostatin je růstový faktor, který je členem rodiny TGF-β. Tento gen je exprimován nejen v buňkách kosterní svaloviny v průběhu embryonálního vývoje, ale i u dospělého jedince. MSTN je negativní regulátor svalového růstu (McPherron et al., 1997). Tento gen funguje jako supresor prekurzorů proliferace svalových buněk (MYOD a MYOG) v průběhu embryonálního vývoje a následkem toho dochází k vytvoření omezeného množství myoblastů tvořících svalová vlákna (Lee, 2004). Knockout genu způsobuje stimulaci buněčného dělení satelitních buněk, hypertrofii kosterní svaloviny a až třínásobné zvětšení svalové hmoty (McPherron et al., 1997, McCroskery et al., 2003). Mutace v genu MSTN způsobující nárůst svalové hmoty se vyskytuje u řady zvířat, ale 21

i člověka. Fibroblastové růstové faktory (FGF) Rodina fibroblastových růstových faktorů zahrnuje více než 20 proteinů, které regulují široký okruh vývojových procesů včetně diferenciace a dorsalisace mezodermu, buněčný růst a migrace, utváření orgánů a růst kostí (Eswarakumar et al., 2005). Fibroblastové růstové faktory hrají významnou roli v průběhu primární myogeneze stimulují proliferaci a inhibují diferenciaci buněk kosterní svaloviny a primárních myoblastů (Olwin et al., 2002). V proliferujících myogenních buňkách FGF potlačuje expresi MYOD, MYOG i IGF2. Pokud je efekt FGF blokován mutací v myoblastových receptorech, myoblasty se diferencují předčasně do myofibril, dochází k 30% úbytku hmotnosti svalové hmoty končetin a 50% redukci počtu svalových vláken. FGF je tedy nepostradatelný v myogenezi svalových vláken, inhibuje diferenciaci svalové tkáně a umožňuje tak vznik adekvátního množství myoblastů pro tvorbu normální svaloviny (Hossner, 2005). Obr. 6: Regulace myogeneze kosterní svaloviny růstovými faktory (přepracováno dle Hossner, 2005). 22

Transformační růstový faktor beta (TGF-β) Transformační růstový faktor beta funguje jako regulátor proliferace, migrace, přežití, diferenciace a extracelulární syntézy matrixu v endoteliálních buňkách a hladkosvalových buňkách cév, stejně jako v zachování cévní homeostáze. TGF-β navozuje angiogenezi a zabezpečuje tak cévní zásobení potřebné pro růst a vývoj svalové tkáně (Bertolino et al., 2005). Mimo to je tento gen, stejně jako FGF, výrazný inhibitor svalové diferenciace. Je produkován řadou buněk včetně myoblastů a regenerující se svalovou tkání. Gen TGF-β je exprimován ve velkém množství v končetinovém pupenu, kde je produkován v ektodermu a ovlivňuje okolní mezenchymální buňky. Tento gen inhibuje diferenciaci fetálních, ale ne embryonálních myoblastů (Yanagisawa et al., 2001), expresi MYOD a MYOG v myogenních buňkách (Brennan et al., 1991), předchází předčasné diferenciaci migrujících myoblastů a umožňuje tak řádný vývoj budoucí svalové tkáně ve vyvíjející se končetině embrya (Olson et al., 1986). Kostní morfogenetické proteiny (BMP) Kostní morfogenetické proteiny jsou členy genové rodiny TGF-β a mají výrazné efekty v průběhu diferenciace kosterní svaloviny. Tyto proteiny produkují buňky ektodermu, laterální ploténky mezodermu a neurální trubice embrya, inhibují diferenciaci buněk dermomyotomu ve sval a předchází tak předčasné diferenciaci myoblastů v somitech (Reshef et al., 1998). Pro diferenciaci svalových progenitorových buněk je velmi důležitá sekrece BMP inhibitorů jako je Noggin a Gremlin (Tzahor et al., 2003). Nedávná studia také ukázala, že BMP4 zvyšuje počet fetálních svalových progenitorových buněk a svalových vláken v končetinách a reguluje počet prekurzorových buněk ve fetálním svalu. Ve svalovině dospělých jedinců se BMP podílí na regeneraci svalových vláken (Wang et al., 2010). Růstový faktor hepatocytů (HGF) Růstový faktor hepatocytů (HGF) indukuje počáteční přeměnu epiteliálních buněk v somitech na buňky mezenchymální a ovlivňuje tak počátky myogeneze. Společně s transkripčními faktory LBX1 a PAX3 řídí delaminaci myoblastů z dermomyotomu a jejich migraci k místům utváření svaloviny. Inaktivace genu HGF nebo jeho receptoru (c-met) způsobuje selhání migrace hypaxiálních myoblastů a následně nedochází k vytvoření kosterní svaloviny končetin a bránice při současném neovlivnění svaloviny 23

epaxiální. Mimo to je HGF také zapojen v hypertrofii a regeneraci svalové tkáně dospělých jedinců (Hossner, 2005). Ovlivnění jednotlivých fází myogeneze růstovými faktory znázorňuje Obr. 6. 3.1.3.7 Role microrna ve vzniku a vývoji kosterní svaloviny V posledních letech se stále více do popředí dostává studium tzv. mikrorna (mirna), která má významnou roli také v biologii kosterní svaloviny. Přestože je studium a analýza jednotlivých mirna započato nedávno, má významný dopad na pochopení řady biologických procesů včetně myogeneze. V současnosti se zvyšuje také počet studií, které se věnují analýze a identifikaci mirna u prasat. Molekuly mirna jsou negativní regulátory genové exprese, které jsou komplementární k cílové mrna (obvykle k regionu 3' UTR). Cílová mrna je následně degradována nebo je inhibována translace této mrna v protein (Obr.7). Molekuly mirna ovlivňují proces buněčné diferenciace svalové tkáně, vývoj embryonální svaloviny, regeneraci svalů a také některá svalová onemocnění (Mok & Sweetman, 2011). V průběhu vzniku a vývoje somitů jsou exprimovány minimálně tři mirna (mir-1, mir-206 and mir-133), jejichž expresi indukují MRF (Carvajal & Rigby, 2010). Molekuly mir-1 a mir-206 negativně regulují produkci proteinu folistatinu a utropinu, které udržují myoblasty v nediferencovaném stavu, zatímco mir-133 pravděpodobně řídí proliferaci myoblastů. Také satelitní buňky exprimují mir-1 a mir-206 a tímto způsobem regulují proliferaci a diferenciaci buněk, které kontrolují geny PAX3 a PAX7 (Mok & Sweetman, 2011). Expresi genu PAX3 reguluje mir-27 a udržuje tak rovnováhu mezi proliferací a diferenciací satelitních buněk a podílí se na regeneraci zraněného svalu. I mechanizmus svalového stahu je ovlivněn složitou sítí, kterou významně ovlivňuje mirna. Geny MYH6, MYH7 a MYH7b kódují mirna, které řídí expresi myozinu, ovlivňují typ svalového vlákna a výkon svalu (Carvajal & Rigby, 2010). Za zmínku stojí i další mirna, které regulují vývoj svalové tkáně, jako je například mir-24 ovlivňující gen TGF-β, mir-181 regulující HOXA11 (homeobox A11), mir-214 řídící epigenetický stav svalových buněk a mir-221 společně s mir-222 kontrolující regulátory diferenciace kosterní svaloviny (Mok & Sweetman, 2011). 24

Obr 7: Biogeneze a funkce mirna. Primární transkript mirna (pri-mirna) vznikající z jaderné DNA je štěpen enzymem Drosha a je exportován ven z jádra. V cytoplazmě je dále upraven enzymem Dicer za vzniku zralé molekuly mirna, která ve vazbě s multiproteinovým komplexem RISC inhibuje translaci cílové mrna nebo navodí degradaci této mrna (přepracováno dle Cuellar & McManus, 2005). 25

3.2 Divoké druhy prasat versus moderní plemena prasat 3.2.1 Divoká prasata a jejich domestikace Prase domácí (Sus scrofa f. domestica) je jedno z prvních domestikovaných zvířat. Domestikace prasete byla zahájena přibližně před 9000 lety. Studium mitochondriální a genomové DNA odhalilo, že domestikace evropských a čínských plemen z divokých druhů prasat probíhala nezávisle na sobě (Giuffra et al., 2000). Na základě morfologických a genetických analýz se předpokládalo, že ke zdomácnění prvních divokých prasat došlo především v oblastech Blízkého a Dálného východu. Genetická analýza mitochondriální DNA divokých a domestikovaných druhů prasat však naznačuje, že existuje více domestikačních center (nejméně sedm) a že předchůdcem evropských domestikovaných plemen prasat, spíše než divoké prase Obr. 8: Prase divoké (Mikulka, 2007). blízkého východu, je evropské prase divoké (Larson et al., 2005). Avšak nedávné studium původu prasat založené na kombinované analýze polymorfizmů mitochondriální DNA, mikrosatelitů a Y chromozomu ukázalo, že divoká prasata z oblasti Blízkého východu a Evropy jsou si geneticky blízká, a proto je velmi obtížné říci, jakou měrou přispěly tyto druhy ke vzniku moderních evropských plemen prasat (Ramírez et al., 2009). Počet chromozómů je u všech druhů prasat diploidní, ale současně i velmi různorodý. Většina divokých prasat Střední Evropy a Asie, stejně jako domestikovaná plemena prasat, má 38 chromozomů. Divoká prasata západní Evropy mají chromozomů 36. Tato redukce je způsobena fúzí centromer chromozomů 15 a 17 (tzv. Robertsonská translokace) (Fang et al., 2006). Kříženci prasete domácího (2n = 38) a divokého (2n = 36) jsou morfologicky podobní divokému praseti a mají 37 chromozomů (Grossi et al., 2006). Fúze chromozomů 13 a 16 a chromozomů 15 a 17 je typická pro karyotyp štětkouna afrického, který obsahuje 34 chromozomů (Melander & Hansen-Melander, 1980; Musilova et al., 2010). Stejný počet chromozomů, tedy 34, má také prase bradavičnaté, 26

na rozdíl od karyotypu prasete pralesního, který obsahuje 32 chromozomů (Melander & Hansen-Melander, 1980). Obr. 9: Diverzita a fylogenetické vztahy mezi druhy prasat (Chen et al., 2007). Domestikované druhy zvířat se díky šlechtění a selekci samozřejmě liší od svých původních předků v řadě vlastností, včetně vlastností užitkových. U divoce žijících druhů je důležité, aby jejich stavba těla umožnila únik před predátorem nebo lov kořisti (Goldspink, 2004). Se zvyšující se úrovní domestikace a selekce prasat ze zvyšuje tempo růstu, obsah libové svaloviny, objem svalových vláken a podíl bílých svalových vláken. Současně se snižuje podíl svalových vláken červených (Lefaucheur, 2010). Vlákna svalu longissimu dorsi prasete domácího jsou složena především z vláken typu 2B, na rozdíl od svalů divokých prasat, která obsahují především vlákna typu 1 a 2A. Nejobjemnější svalová vlákna u divokých prasat byla typu 1, zatímco u domestikovaných plemen jsou tato vlákna nejmenší (Weiler, 1995). 27

3.2.2 České bílé ušlechtilé plemeno prasat Plemeno bílé ušlechtilé (Obr.10) je hlavní a nejrozšířenější plemeno chované v České republice. Vzniklo pomocí převodného křížení domácích prasat především s plemeny velké bílé anglické (Large White) a německé bílé ušlechtilé. Zušlechťování plemene se provádí pomocí selekce, ale i imigrací genů plemene velkého bílého anglického a bílého ušlechtilého plemene z Holandska, Německa, Francie a Švédska (Čechová et al., 2006). Obr. 10: České bílé ušlechtilé plemeno prasat (Sambraus, 2006). České bílé ušlechtilé plemeno se vyznačuje bílým zbarvením, hlava je v profilu mírně prohnutá, uši jsou kratší a vzpřímené. Tělesný rámec je střední až větší, kostra kompaktní, stavba těla harmonická. Hmotnost samců v dospělosti dosahuje 300 320 kg, prasnic 220 250 kg. Toto plemeno je masného užitkového typu a vyznačuje se vynikající plodností a mléčností, nadprůměrnou výkrmností a průměrnou jatečnou hodnotou. Plemeno dále vyniká svou konstituční pevností, adaptací na podmínky velkovýrobních technologií a odolnosti vůči stresovým faktorům (Čechová et al., 2006). Mateřská linie bílých ušlechtilých prasat se vyznačuje velmi dobrými reprodukčním vlastnostmi, vynikající růstovou schopností, konverzí živin, masnou užitkovostí a dobrou kvalitou masa. Tyto prasata mají větší až velký tělesný rámec, lehčí hlavu, vzpřímené ucho, pevnou kostru a konstituci s vysokým stupněm odolnosti vůči stresům. Zbarvení kůže i štětin je bílé. Otcovská linie bílého ušlechtilého prasete se příliš neliší od mateřské linie, u této linie je však vyžadováno vyjádření masného užitkového typu s mediální rýhou na hřbetě 28

a kýtě. Tělesný rámec je střední až větší a kostra je o něco mohutnější než u linie mateřské. Otcovská linie se vyznačuje také výbornou růstovou schopností a konverzí živin (Pražák & Stibal, 2010). Tab. 3: Vlastní užitkovost českého bílého ušlechtilého plemene prasat v roce 2009 polní test (přepracováno dle Stibal & Jelínková, 2010). Kanečci Prasničky Testováno (ks) 2365 8187 Průměrný denní přírůstek od narození do konce testu (g) 670 642 Podíl libového masa (%) 63,7 62,7 Průměrná výška špeku (cm) 0,73 0,74 Průměrný denní přírůstek v unifikovaném testu (g) 1057 1021 Průměrný denní přírůstek od narození do začátku testu (g) 386 383 29

3.3 Genová exprese a její analýza 3.3.1 Exprese genetické informace Podobu, strukturu a vývoj živých organismů řídí informace a nástroje, které jsou zodpovědné za veškeré biologické procesy uskutečňující se v organismu. Nositelkou této genetické informace všech organismů, s výjimkou některých nebuněčných, je deoxyribonukleová kyselina (DNA), která je součástí somatických buněk a je ve všech buňkách prakticky totožná. Rozdíl mezi jednotlivými typy buněk, jako jsou např. buňky svalu, mozku, nervů nebo jater, udává určitý soubor genů, které jsou v buňkách exprimovány. Stejně tak schopnost organismu odpovídat na podměty prostředí a přizpůsobit se jeho změnám, závisí na schopnosti regulace exprimovaných genů (pozitivní nebo negativní). Tato regulace, vytvářející rozdíly v genové expresi, je základem anatomické a fyziologické komplexity eukaryotických organismů. Genová exprese je tedy komplexní a regulovaný proces, kterým je genetická informace uložená ve formě DNA přeměněna v konkrétní buněčné struktury, přičemž tato DNA zůstává relativně nezměněna. Výsledné produkty procesu exprese genů jsou molekuly proteinů, ale i ribonukleové kyseliny (RNA). Exprese strukturních genů obecně zahrnuje transkripci, kdy je určitý úsek DNA (gen) přepsán v mediátorovou RNA (mrna), která slouží jako matrice pro syntézu proteinů v procesu translace. Genová exprese eukaryot je podstatně složitější než u prokaryot, protože tato buňka je rozdělena na jednotlivé organely, které vykonávají odlišnou funkci. Stejně tak fáze genové exprese jsou fyzicky izolovány (transkripce probíhá v jádře, translace v cytoplazmě buňky), čímž je umožněna regulace exprese na různých místech. V současné době je známa řada mechanizmů, které organismy využívají k regulaci genové exprese (např. indukce exprese faktory prostředí, hormony, nebo chemikáliemi, RNA interference, remodelace chromatinu, metylace DNA, imprinting, amplifikace genů, aktivace nebo inaktivace chromozomů). Genová exprese a její regulace je dobře prostudována u bakterií a virů, na rozdíl od buněk eukaryotických, které stále ukrývají mnoho tajemství (Daryl & Granner, 2002; Snustad et al., 2009). V souvislosti s metodami analýzy genové exprese se zajímáme o míru genové exprese, tedy o počet kopií RNA transkriptů vytvořených během transkripce specifického genu ve sledovaném čase. Stanovení hladiny genové exprese vypovídá o transkripční aktivitě sledovaného genu (Dziuda, 2010). 30