UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI LÉKAŘSKÁ FAKULTA Ústav mikrobiologie. Doktorská disertační práce

UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI LÉKAŘSKÁ FAKULTA Ústav mikrobiologie MOŽNOSTI TESTOVÁNÍ ANTIMIKROBNÍ AKTIVITY STÁVAJÍCÍCH A NOVĚ VYVÍJENÝCH LÁTEK Doktorská disertační práce Olomouc 2017 Mgr. Renata Večeřová 1

Poděkování Děkuji svému školiteli prof. MUDr. Milanu Kolářovi, Ph.D za odborné vedení v průběhu celého doktorského studia a za cenné rady, připomínky a náměty při zpracování disertační práce. Poděkování patří také doc. RNDr. Aleši Panáčkovi, Ph.D z Katedry fyzikální chemie Přírodovědecké fakulty Univerzity Palackého v Olomouci a Ing. Dominiku Rejmanovi Ph.D. z Ústavu organické chemie a biochemie AV ČR za výbornou spolupráci a přípravu látek pro testování antimikrobní aktivity. V neposlední řadě děkuji své rodině za podporu, zázemí a trpělivost. 2

Čestné prohlášení Čestně prohlašuji, že jsem disertační práci s názvem Možnosti testování antimikrobní aktivity stávajících a nově vyvíjených látek vypracovala samostatně. Použitou literaturu a všechny podklady uvádím v přiloženém seznamu literatury. V Olomouci dne 18. dubna 2017. Mgr. Renata Večeřová 3

OBSAH 1. ÚVOD... 7 1.1 PROBLEMATIKA BAKTERIÁLNÍ REZISTENCE K ANTIMIKROBNÍM PŘÍPRAVKŮM... 7 1.1.1 Rezistence bakterií k antibiotikům a její vývoj... 7 1.1.2 Klinický dopad bakteriální rezistence na antibiotickou léčbu... 7 1.1.3 Možnosti řešení problému bakteriální rezistence... 8 1.2 VÝVOJ NOVÝCH LÁTEK S ANTIMIKROBNÍ ÚČINNOSTÍ... 8 1.2.1 Vývoj nových antibiotik... 8 1.2.2 Nanočástice stříbra... 8 1.2.2.1 Stříbro a historie jeho použití v medicíně... 8 1.2.2.2 Koloidní stříbro... 9 1.2.3 Lipofosfonoxiny... 9 2. CÍL PRÁCE...10 2.1 STANOVENÍ ANTIMIKROBNÍ AKTIVITY NANOČÁSTIC STŘÍBRA...10 2.1.1 Stanovení antimikrobní účinnosti nanočástic stříbra a jejich kombinace s antibiotiky...10 2.1.2 Stanovení antimikrobní účinnosti nanokompozitů a povrchů s nanočásticemi stříbra...10 2.1.3 Indukce bakteriální rezistence k nanočásticím stříbra...10 2.2 STANOVENÍ ANTIMIKROBNÍ AKTIVITY LIPOFOSFONOXINŮ...10 2.2.1 Stanovení antimikrobní účinnosti lipofosfonoxinů...10 2.2.2 Stanovení antimikrobní účinnosti kostních cementů s navázanými lipofosfonoxiny...10 2.2.3 Indukce bakteriální rezistence k lipofosfonoxinům...10 3. MATERIÁL A METODY...11 3.1 STANOVENÍ ANTIMIKROBNÍ AKTIVITY NANOČÁSTIC STŘÍBRA...11 3.1.1 Stanovení antimikrobní účinnosti nanočástic stříbra a jejich kombinace s antibiotiky...11 3.1.1.1 Stanovení antibakteriální účinnosti...11 3.1.1.2 Stanovení antifungální účinnosti...12 3.1.1.3 Stanovení účinku kombinace nanočástic stříbra a antibiotik...12 3.1.1.3.1 Účinek kombinace AgNPs a antibiotik na citlivé bakterie...12 3.1.1.3.2 Účinek kombinace AgNPs a antibiotik na rezistentní bakterie...13 3.1.1.3.3 Fenotypová detekce produkce ESBL na modifikovaných agarech s AgNPs...13 3.1.2 Stanovení antimikrobní účinnosti nanokompozitů a povrchů s nanočásticemi stříbra...14 3.1.2.1 Stanovení účinku nanokompozitů s nanočásticemi stříbra...14 3.1.2.1.1 Nanokompozit Ag/PDDA-křemelina...14 3.1.2.1.1.1 Stanovení MIC Ag/PDDA-CBL3...15 3.1.2.1.1.2 Kvalitativní stanovení rychlosti baktericidního účinku...15 4

3.1.2.1.1.3 Kvantitativní stanovení rychlosti baktericidního účinku...16 3.1.2.1.2 Stanovení aktivity metylcelulózového hydrogelu s nanočásticemi stříbra...16 3.1.2.2 Stanovení antibakteriálního účinku povrchů s nanočásticemi stříbra...17 3.1.2.2.1 Testování antibakteriální aktivity povrchu plastů...17 3.1.2.2.2 Testování antibakteriální aktivity textilií...18 3.1.3 Indukce bakteriální rezistence k nanočásticím stříbra...20 3.2 STANOVENÍ ANTIMIKROBNÍ AKTIVITY LIPOFOSFONOXINŮ...21 3.2.1 Stanovení antibakteriální účinnosti...21 3.2.2 Semikvantitativní hodnocení baktericidního účinku v čase...22 3.2.3 Stanovení účinku kostních cementů s lipofosfonoxiny...22 3.2.4 Indukce bakteriální rezistence k lipofosfonoxinům...23 4. VÝSLEDKY...24 4.1 ANTIMIKROBNÍ AKTIVITA NANOČÁSTIC STŘÍBRA...24 4.1.1 Stanovení antimikrobní účinnosti nanočástic stříbra a jejich kombinace s antibiotiky...24 4.1.1.1 Antibakteriální aktivita nanočástic stříbra...24 4.1.1.2 Antifungální aktivita nanočástic stříbra...25 4.1.1.3 Účinek nanočástic stříbra a jejich kombinace s antibiotiky...26 4.1.1.3.1 Účinek kombinace AgNPs a antibiotik na citlivé bakterie...26 4.1.1.3.2 Účinek kombinace AgNPs a antibiotik na rezistentní bakterie...26 4.1.1.3.3 Inhibice produkce ESBL na modifikovaném agaru s AgNPs...31 4.1.2 Antimikrobní účinnost nanokompozitů a povrchů s nanočásticemi stříbra...32 4.1.2.1 Nanokompozity s nanočásticemi stříbra...32 4.1.2.1.1 Účinek nanokompozitu Ag/PDDA-křemelina...32 4.1.2.1.1.1 Stanovení MIC nanokompozitu...32 4.1.2.1.1.2 Kvalitativní stanovení baktericidního účinku...32 4.1.2.1.1.3 Kvantitativní stanovení baktericidního účinku...33 4.1.2.1.2 Účinek metylcelulózového hydrogelu s nanočásticemi stříbra...34 4.1.2.2 Aktivita povrchů s nanočásticemi stříbra...36 4.1.2.2.1 Antibakteriální aktivita povrchu plastů...36 4.1.2.2.2 Antibakteriální aktivita textilií...37 4.1.3 Indukce bakteriální rezistence k nanočásticím stříbra...39 4.2 ANTIMIKROBNÍ AKTIVITA LIPOFOSFONOXINŮ...44 4.2.1 Stanovení antibakteriální účinnosti...44 4.2.1.1 Stanovení MIC a MBC lipofosfonoxinů...44 4.2.1.2 Semikvantitativní hodnocení baktericidního účinku...45 4.2.2 Antimikrobní účinnost kostních cementů s navázanými lipofosfonoxiny...47 4.2.3 Indukce rezistence k lipofosfonoxinům...48 5

5. DISKUZE...50 5.1 STŘÍBRO A JEHO ANTIMIKROBNÍ AKTIVITA...50 5.1.1 Zhodnocení antimikrobní účinnosti nanočástic stříbra a jejich kombinace s antibiotiky...50 5.1.2 Možnosti nanokompozitů a povrchů s nanočásticemi stříbra...52 5.1.3 Problematika bakteriální rezistence k nanočásticím stříbra...53 5.2 ANTIMIKROBNÍ ÚČINNOST LIPOFOSFONOXINŮ...54 5.2.1 Zhodnocení účinku lipofosfonoxinů na bakterie...54 5.2.2 Možnosti kostních cementů s navázanými lipofosfonoxiny...55 5.2.3 Potenciální vývoj bakteriální rezistence k lipofosfonoxinům...56 6. ZÁVĚR...57 7. SOUHRN...59 8. SUMMARY...61 9. SEZNAM ZKRATEK...63 10. SEZNAMY TABULEK, SCHÉMAT, GRAFŮ A OBRÁZKŮ...64 10.1 SEZNAM TABULEK...64 10.2 SEZNAM SCHÉMAT...65 10.3 SEZNAM GRAFŮ...65 10.4 SEZNAM OBRÁZKŮ...66 11. LITERATURA...67 12. SEZNAM PUBLIKACÍ SOUVISEJÍCÍCH S TÉMATEM DISERTAČNÍ PRÁCE...74 12.1 PUBLIKACE V ČASOPISECH S IMPAKT FAKTOREM...74 12.2 PUBLIKACE V RECENZOVANÝCH ČASOPISECH...75 13. SEZNAM PŘEDNÁŠEK A POSTERŮ SOUVISEJÍCÍCH S TÉMATEM DISERTAČNÍ PRÁCE...75 6

1. ÚVOD 1.1 PROBLEMATIKA BAKTERIÁLNÍ REZISTENCE K ANTIMIKROBNÍM PŘÍPRAVKŮM 1.1.1 Rezistence bakterií k antibiotikům a její vývoj Bakteriální rezistence je schopnost bakterií odolat působení antimikrobní látky. Bakteriální rezistence se dělí na dva základní typy, přirozenou (primární) a získanou (sekundární). Bakterie jsou vůči některým antibiotikům primárně rezistentní, protože nemají cílovou strukturu příslušného antibiotika. Příkladem mohou být mykoplasmata přirozeně rezistentní ke všem beta-laktamovým antibiotikům, enterobakterie rezistentní k penicilinu, enterokoky k cefalosporinům nebo kmeny Proteus sp. ke kolistinu. Získaná (sekundární) rezistence vzniká následkem evoluce bakteriálního genomu a selekčního tlaku prostředí. Původně citlivý kmen se stává k definované antibakteriální látce rezistentní. Mechanismy získané rezistence lze rozdělit do několika skupin: změna cílové struktury, zábrana nebo zhoršený průnik antibiotika do buňky, aktivní eflux antibiotika z buňky nebo inaktivace antibiotika enzymem. Ke změnám genomu dochází mutací (chromozomální rezistence) nebo převzetím extrachromozomální DNA od bakterií rezistentních na dané antibiotikum (extrachromozomální rezistence) [83]. Vlivem selekčního tlaku antibiotik rezistentní kmeny přežívají a rychle se rozšiřují. Například ve Fakultní nemocnici Olomouc byla popsána souvislost mezi zvýšenou aplikací cefalosporinů III. generace a nárůstem četnosti ESBL produkujících kmenů Klebsiella pneumoniae rezistentních k širokospektrým penicilinům a cefalosporinům [75]. Objevují se ale i studie, které přímou souvislost mezi spotřebou antibiotik a rostoucí rezistencí bakterií popírají. Například práce Htoutou Sedlákové a kol. uvádí, že během11-letého sledování nedošlo ke snížení výskytu kmenů rezistentních k cefalosporinům a fluorochinolonům, i když jejich spotřeba klesala [26]. Je tedy nutné počítat s možností, že geny kódující rezistenci se mohou rekombinačními procesy horizontálně dále šířit bez ohledu na spotřebu antibiotik. Nicméně vysoká spotřeba antibiotik v humánní i veterinární oblasti vytváří nadále ideální podmínky pro vznik a šíření bakteriální rezistence. 1.1.2 Klinický dopad bakteriální rezistence na antibiotickou léčbu Vzrůstající rezistence bakterií ke stávajícím antibakteriálním přípravkům představuje závažný problém ve zdravotnictví a infekce způsobené multirezistentními bakteriemi zvyšují nemocnost a úmrtnost pacientů z důvodu selhání antibiotické léčby. Narůstající invazivita léčebných a diagnostických postupů v současné medicíně má za následek stoupající počet komplikujících bakteriálních infekcí, především u pacientů hospitalizovaných na jednotkách intenzívní péče [34, 58]. Při léčbě infekcí způsobených multirezistentními gramnegativními patogeny, jako jsou komplikované intraabdominální infekce nebo ventilátorové pneumonie a sepse, dochází k situacím, kdy k eradikaci 7

vyvolávajícího bakteriálního patogena nemáme již žádné účinné antibiotikum nebo je výběr adekvátní antibiotické léčby je velmi limitovaný [67]. 1.1.3 Možnosti řešení problému bakteriální rezistence Při řešení problému vzrůstající rezistence bakteriálních patogenů k antibiotikům, je nutné využít všech stávajících možností. To znamená podávat antibiotika cíleně na základě mikrobiologického vyšetření a antibiogramu, optimalizovat dávkování a využívat působení kombinací antibiotik. Pokud není možná časová prodleva až do výsledku laboratorního vyšetření, zohlednit v iniciální antibiotické léčbě lokální situaci ve frekvenci bakteriálních patogenů a jejich rezistenci k antibiotikům. Z tohoto důvodu je tedy nezbytně nutné monitorovat výskyt rezistentních bakteriálních kmenů, resp. realizovat surveillance bakteriální rezistence v jejím plném rozsahu. Pro zabránění přenosu rezistentních bakterií je potřeba dodržovat příslušné hygienické a epidemiologické režimy. Velmi potřebná je informovanost odborné i laické veřejnosti. V neposlední řadě je nutné pokračovat ve studiu vlastností již známých látek s antimikrobním účinkem, vyvíjet a hledat látky nové [32, 33, 34]. 1.2 VÝVOJ NOVÝCH LÁTEK S ANTIMIKROBNÍ ÚČINNOSTÍ 1.2.1 Vývoj nových antibiotik Nové antibakteriální látky se na trh dostávají velmi pomalu. Jejich výzkum je finančně náročný a ve srovnání s jinými skupinami léčiv nerentabilní. Většina používaných antibiotik je známa ze 70. 80. let minulého století, v následujících letech se vývoj nových antibakteriálních látek výrazně zpomalil. Za posledních 15 let bylo registrováno 30 nových molekul antibiotik, z nichž většina má chemickou strukturu odvozenou od již známého antibiotika. Z hlediska vývoje rezistence je však důležité zaměřit se také na vývoj originálních molekul s novým mechanismem účinku. Ani to ovšem není zárukou jejich dlouhodobé účinnosti. Je jen otázkou času, kdy si bakterie vyvinou rezistenci i proti novým látkám [67]. 1.2.2 Nanočástice stříbra 1.2.2.1 STŘÍBRO A HISTORIE JEHO POUŽITÍ V MEDICÍNĚ Stříbro, latinsky Argentum, chemická značka Ag, je ušlechtilý kov bílé barvy, používaný člověkem pro své antimikrobní účinky již od starověku. Stříbrné nádoby se používaly k uchovávání potravin, do mléka a tekutin se vkládaly stříbrné mince pro prodloužení trvanlivosti. V 15. století se na stolech šlechty dokonce objevovaly slánky s mletým stříbrem, které se přidávalo do jídla [2]. Od konce 19. století se používala metoda tzv. kredeizace, tj. profylaktické opatření k zabránění hnisavé gonokokové konjunktivitidy novorozenců pomocí 1% roztoku AgNO 3. Počátkem 20. století se stříbro 8

užívalo jako lék na různé druhy infekcí a chorob, ale také lokálně na ošetření popálenin a léčení plísňových nákaz. S příchodem antibiotické éry používání stříbra v medicíně ustupovalo a stříbro se používalo pouze pro dezinfekci pitné vody nebo pro povrchové lokální ošetření ran přípravky s obsahem sulfodiazinu stříbrného [2, 44]. Dnešní doba přináší renesanci používání stříbra pro medicínské i průmyslové aplikace. Příkladem jsou lokální přípravky s obsahem stříbra k ošetření ran (náplasti, obvazový materiál), kosmetické přípravky, hygienické potřeby, roušky, textil a obuv, matrace nebo nátěrové hmoty. Biologickým vlastnostem stříbra je věnována velká pozornost [5, 7]. Intenzivně studované jsou zejména antimikrobní vlastnosti a toxicita koloidního stříbra. Prokázaný antimikrobní efekt koloidního stříbra je však ve svém uplatnění omezován nežádoucími vedlejšími účinky. Při lokální aplikaci byly popsány reakce z přecitlivělosti. Dlouhodobé celkové i lokální užívání může vést k ukládání stříbra a jeho solí do tkání. Výsledkem je nevratné šedomodré zabarvení, tzv. argyrie. Tyto nežádoucí účinky byly důvodem zákazu vnitřního užívání koloidního stříbra v rámci EU s platností od 1. 1. 2010 [2, 5, 15, 44]. 1.2.2.2 KOLOIDNÍ STŘÍBRO Koloid je označení pro disperzní soustavu, ve které jsou rozptýlené částice o velikostí 1-500 nm. Koloidní částice v tomto rozmezí udělují danému systému unikátní vlastnosti, které se nevyskytují u částic jiných rozměrů. Tyto vlastnosti souvisí s malým rozměrem částic a velkou plochou jejich povrchu, charakterem fázového rozhraní a jeho interakcí s okolním prostředím [15]. Koloidní stříbro je vyráběno ve formě vodní disperze. Obvykle se jedná o nanočástice stříbra o velikosti 5 100 nm. Nejužívanějšími metodami přípravy jsou chemické redukční metody, které jsou levné, rychlé a umožňují ovlivnění konečných vlastností nanočástic stříbra jako je jejich velikost, tvar a povrchový náboj [52, 53]. Nanočástice stříbra lze vyrobit také elektrochemickým procesem za použití stříbrných elektrod nebo syntetizovat pomocí různých mikroorganizmů, například enterobakterií, stafylokoků nebo vláknitých hub, které jsou zdrojem redukčních enzymů. Nevýhodou biologické výroby nanočástic je omezená možnost ovlivnění jejich vlastností [40, 63]. 1.2.3 Lipofosfonoxiny Lipofosfonoxiny (LPPOs) jsou nedávno objevené látky, u kterých byla zjištěna antibakteriální aktivita proti grampozitivním bakteriím, na které působí baktericidně destrukcí cytoplasmatické membrány [60]. Jsou to uměle vytvořené modulární látky vycházející ze struktury fosfonoxinů, skládají se ze čtyř strukturních modulů: nukleosid, iminocukr, hydrofobní lipofilní alkylový řetězec a spojovací fosfanát, který spojuje jednotlivé moduly. Obecná struktura LPPOs je zobrazena ve 9

schématu 1 [61, 71]. Výzkum lipofosfonoxinů nadále probíhá a snahou je vytvořit nové látky, které by působily na široké spektrum mikroorganismů, včetně multirezistentních gramnegativních bakterií. Schéma 1: Modulární struktura lipofosfonoxinů 2. CÍL PRÁCE Cíle předložené disertační práce jsou definovány následujícími body: 2.1 STANOVENÍ ANTIMIKROBNÍ AKTIVITY NANOČÁSTIC STŘÍBRA 2.1.1 Stanovení antimikrobní účinnosti nanočástic stříbra a jejich kombinace s antibiotiky 2.1.2 Stanovení antimikrobní účinnosti nanokompozitů a povrchů s nanočásticemi stříbra 2.1.3 Indukce bakteriální rezistence k nanočásticím stříbra 2.2 STANOVENÍ ANTIMIKROBNÍ AKTIVITY LIPOFOSFONOXINŮ 2.2.1 Stanovení antimikrobní účinnosti lipofosfonoxinů 2.2.2 Stanovení antimikrobní účinnosti kostních cementů s navázanými lipofosfonoxiny 2.2.3 Indukce bakteriální rezistence k lipofosfonoxinům 10

3. MATERIÁL A METODY 3.1 STANOVENÍ ANTIMIKROBNÍ AKTIVITY NANOČÁSTIC STŘÍBRA Nanočástice stříbra (AgNPs) a všechny koloidní systémy byly připraveny na Katedře fyzikální chemie Přírodovědecké fakulty Univerzity Palackého v Olomouci modifikovaným Tollensovým procesem za použití kationového komplexu [Ag(NH 3 ) 2 ] +, který byl v alkalickém prostředí (ph = 11.5) redukován D-maltózou (Schéma 2). Počáteční koncentrace AgNO 3 byla 1.10-3 mol/l, NH 3 5.10-3 mol/l, NaOH a maltózy 1.10-2 mol/l. Reakce probíhala při laboratorní teplotě za stálého míchání po dobu 5 minut. Koncentrace připravených nanočástic stříbra byla 108 mg/l. Schéma 2: Modifikovaný Tollensův proces NaOH, redukující látka Ag + + 2NH 3 [Ag(NH 3 ) 2 ] + Ag 0 3.1.1 Stanovení antimikrobní účinnosti nanočástic stříbra a jejich kombinace s antibiotiky Pro stanovení antimikrobní aktivity nanočástic stříbra bylo provedeno testování s aerobními, fakultativně anaerobními a anaerobními bakteriemi, přičemž byly použity citlivé i rezistentní bakteriální kmeny. Dále byla sledována účinnost na kvasinky a posouzena možná synergická aktivita nanočástic stříbra s antibiotiky. 3.1.1.1 STANOVENÍ ANTIBAKTERIÁLNÍ ÚČINNOSTI Antibakteriální účinnost byla testována pomocí standardní diluční mikrometody určením minimální inhibiční koncentrace (MIC) látky potřebné k inhibici růstu bakterie a minimální baktericidní koncentrace (MBC) látky potřebné k usmrcení bakterií. Testování bylo prováděno v mikrotitrační destičce, vzorky byly ředěny geometrickou řadou v Mueller-Hinton (MH) bujónu na koncentrace 54 0,084 mg/l. Pro srovnání antimikrobního účinku bylo testováno také iontové stříbro ve formě AgNO 3. Do destiček bylo očkováno standardní množství testovaného mikroba, hustota inokula odpovídala 10 6 CFU/ml. Po 24 hod inkubace při 35 C byla odečtena MIC jako nejnižší koncentrace testované látky, která inhibovala viditelný růst mikroorganismu. Jamky bez viditelného růstu byly inokulovány na krevní agar pro stanovení MBC [12, 14, 76]. Testované bakterie zahrnovaly sbírkové kmeny: Enterococcus faecalis CCM 4224, Staphylococcus aureus CCM 3953, Escherichia coli CCM 3954, Pseudomonas aeruginosa CCM 3955 a kmeny ze sbírky Ústavu mikrobiologie Lékařské fakulty Univerzity Palackého v Olomouci 11

Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus MRSA, Enterococcus faecium VRE a ESBL-pozitivní kmen Klebsiella pneumoniae. Pro přípravu kultivačního MH bujónu byl použitý Beef extrakt dessicated (Difco), Casein acid hydrolysate technical (HIMEDIA), ph 7,2 bylo upraveno pomocí 20% NaHCO 3. Antibakteriální účinnost AgNPs o velikosti 28 nm u anaerobních bakterií byla testována pomocí diluční mikrometody určením MIC. Testování bylo provedeno v mikrotitrační destičce, vzorky byly ředěny geometrickou řadou ve VL bujónu. Pro přípravu kultivačního VL bujónu byly použity Brain Heart Infusion (HIMEDIA), Yeast autolysate (HIMEDIA), Ferrum (LEK) a Kanavit (BIOTIKA). Do destiček bylo očkováno standardní množství testovaného mikroba, hustota inokula odpovídala 10 6 CFU/ml. Po 72 hodinách inkubace v anaerobní atmosféře (Systém pro anaerobní kultivaci LAS, Trios) při 35 C byla odečtena MIC jako nejnižší koncentrace testované látky, která inhibovala viditelný růst testovaných mikroorganismů. Pro testování byly použity anaerobní bakterie z České sbírky mikroorganismů v Brně: Bacteroides fragilis CCM 4712, Bacteroides thetaiotaomicron CCM 4713, Eggerthella lenta CCM 4714, Propionibacterium acnes CCM 3343, Clostridium perfringens CCM 4991 a Clostridium difficile CCM 3593. Kmen Fusobacterium varium pocházel ze sbírky bakterií Ústavu mikrobiologie Lékařské fakulty Univerzity Palackého v Olomouci [81]. 3.1.1.2 STANOVENÍ ANTIFUNGÁLNÍ ÚČINNOSTI Antifungální účinky byly stanoveny podobně jako antibakteriální účinky, tedy stanovením MIC pomocí diluční mikrometody a určením minimální fungicidní aktivity (MFC) po přeočkování na Sabouraudův agar a následné kultivaci. Pro testování byly zvoleny nanočástice stříbra o velikosti 25 nm připravené redukcí maltosou a stabilizované povrchově aktivními látkami (sodium dodecylsulfát, Tween 80, Brij, PVP 360). Antifungální aktivita nanočástic stříbra byla testována u čtyř kmenů kvasinek ze sbírky Ústavu mikrobiologie Lékařské fakulty Univerzity Palackého v Olomouci. Jednalo se o 2 kmeny Candida albicans, Candida parapsilosis a Candida tropicalis [51]. 3.1.1.3 STANOVENÍ ÚČINKU KOMBINACE NANOČÁSTIC STŘÍBRA A ANTIBIOTIK Účinek kombinací vybraných antibiotik s různým mechanismem účinku a nanočástic stříbra byl hodnocen u citlivých i rezistentních bakterií pomocí diluční mikrometody. 3.1.1.3.1 ÚČINEK KOMBINACE AGNPS A ANTIBIOTIK NA CITLIVÉ BAKTERIE Synergická aktivita byla hodnocena při subinhibičních koncentracích, tedy při koncentracích pod hodnotami MIC samotných antibiotik i nanočástic stříbra. V testech byly použity referenční bakterie Escherichia coli CCM 4225, Pseudomonas aeruginosa CCM 3955 a Staphylococcus aureus CCM 4223 citlivé k testovaným antibiotikům. Sestava testovaných antibiotik se lišila podle druhu 12

bakterie. Pro Escherichia coli byla zvolena antibiotika ampicilin, ampicilin/sulbactam, cefazolin, cefuroxim, cefoxitin, gentamicin, sulfamethoxazol/trimethoprim, kolistin, kyselina oxolinová, ofloxacin, tetracyklin a aztreonam. U Pseudomonas aeruginosa byla testována antibiotika piperacilin, piperacilin/tazobactam, aztreonam, meropenem, ceftazidim, cefoperazon, cefepim, gentamicin, amikacin, kolistin, ofloxacin a ciprofloxacin. Pro Staphylococcus aureus byla vybrána antibiotika benzylpenicilin, oxacilin, ampicilin/sulbactam, chloramfenikol, sulfamethoxazol/trimethoprim, tetracyklin, erytromycin, klindamycin, ciprofloxacin, gentamicin, teikoplanin a vankomycin. 3.1.1.3.2 ÚČINEK KOMBINACE AGNPS A ANTIBIOTIK NA REZISTENTNÍ BAKTERIE Synergický, indiferentní nebo aditivní účinek každé jednotlivé kombinace antibiotika a nanočástic stříbra byl stanoven pomocí koeficientu FIC (frakční inhibiční koncentrace). Postup výpočtu znázorňuje schéma 3. Hodnota FIC 0,5 byla vyhodnocena jako synergie; FIC 0,5-1 byla hodnocena jako aditivní efekt, FIC 1-2 indiferentní účinek a hodnota FIC 2 byla hodnocena jako antagonismus [14, 29]. V testech byly použity multirezistentní bakterie ze sbírky bakterií Ústavu mikrobiologie Lékařské fakulty Univerzity Palackého v Olomouci: Klebsiella pneumoniae produkující ESBL (blatem, blashv, blactx-m), Escherichia coli produkující ESBL (blashv-12), Escherichia coli produkující AmpC (blacmy-2) a Klebsiella pneumoniae produkující karbapenemázu (blakpc). U všech kmenů byla v kombinaci s AgNPs testována následující antibiotika: cefotaxim, ceftazidim, meropenem, ciprofloxacin a gentamicin. Schéma 3:Výpočet hodnoty FIC FIC = MIC AgNPs v kombinaci MIC AgNPs + MIC ATB v kombinaci MIC ATB 3.1.1.3.3 FENOTYPOVÁ DETEKCE PRODUKCE ESBL NA MODIFIKOVANÝCH AGARECH S AGNPS Stanovení produkce širokospektrých beta-laktamáz ESBL metodou DDST (double disk synergy test) je založeno na detekci deformace inhibičních zón, které vytváří testovaný kmen na Mueller-Hinton agaru mezi disky s cefalosporiny a aztreonamem a diskem s obsahem amoxicilinu s kyselinou klavulanovou. Vzdálenost disků byla v rozmezí 20 30 mm od středů. Současně byla hodnocena velikost inhibiční zóny kolem disků ceftazidimu a ceftazidimu s kyselinou klavulanovou. Inokulované plotny s rozmístěnými antibiotickými disky byly inkubovány při 35 C po dobu 24 hod. DDST testy byly provedeny u ESBL-pozitivních kmenů Escherichia coli a Klebsiella pneumoniae. Test byl proveden na standardním MH agaru a na MH agaru obsahujícím AgNPs v subinhibiční koncentraci 5 mg/l. Modifikovaný agar byl připraven tak, že do ještě tekutého MH agaru byla po 13

sterilizaci přidána, při teplotě 50 C, suspenze AgNPs. Agar byl rozplněn do Petriho misek, aby bylo dosaženo výšky agaru 4 mm. Doporučené kombinace a rozložení antibiotických disků ukazuje schéma 4 [13]. Schéma 4: Schéma provedení DDST 3.1.2 Stanovení antimikrobní účinnosti nanokompozitů a povrchů s nanočásticemi stříbra Antibakteriální aktivita nanočástic stříbra byla hodnocena také v konkrétních aplikacích při vazbě AgNPs na křemelinu, metylcelulózu, povrchy plastů a textilií. 3.1.2.1 STANOVENÍ ÚČINKU NANOKOMPOZITŮ S NANOČÁSTICEMI STŘÍBRA Termínem nanokompozity jsou označovány materiály složené ze dvou nebo více složek, z nichž alespoň jedna se v materiálu vyskytuje ve formě částic o velikosti do 100 nm. Vzorky nanokompozitů s AgNPs byly připraveny na Přírodovědecké fakultě Univerzity Palackého v Olomouci. 3.1.2.1.1 NANOKOMPOZIT AG/PDDA-KŘEMELINA Křemelina je běžně používána k filtracím v potravinářském průmyslu. Jedná se o lehký práškový materiál s velkým množstvím pórů o velikosti 10 200 µm, které zachytí hrubé nečistoty a kvasinky, ale propustí bakterie. Testovaný nanokompozit Ag/PDDA-CBL3 byl připraven navázáním AgNPs na křemelinu CBL3 (Obrázek 1). Koncentrace stříbra byla 46,6 mg AgNPs na 1 g kompozitu. Stříbrné nanočástice byly velmi silně poutány na povrch křemeliny, koncentrace uvolňovaného stříbra z nanokompozitů byla ve vodném prostředí velmi nízká [49]. 14

Obrázek 1: TEM snímek nanokompozitu Ag/PDDA-CBL3 3.1.2.1.1.1 Stanovení MIC Ag/PDDA-CBL3 Diluční mikrometodou byla určena MIC nanokompozitů. Pro testování byly použity bakteriální kmeny Enterococcus faecalis CCM 4224, Staphylococcus aureus CCM 3953, Escherichia coli CCM 3954, Pseudomonas aeruginosa CCM 3955 a multirezistentní kmeny ze sbírky Ústavu mikrobiologie Lékařské fakulty Univerzity Palackého v Olomouci, konkrétně ciprofloxacin-rezistentní kmen Pseudomonas aeruginosa, ESBL-pozitivní kmen Klebsiella pneumoniae, oxacilin-rezistentní kmen Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus MRSA a Enterococcus faecium VRE. 3.1.2.1.1.2 Kvalitativní stanovení rychlosti baktericidního účinku Kvalitativní stanovení rychlosti baktericidního účinku bylo testováno u nanokompozitů s koncentracemi Ag 120 a 60 mg/l u bakterií Escherichia coli CCM 3954 a Enterococcus faecalis CCM 4224. Z čerstvě narostlé bakteriální kultury byla připravena buněčná suspenze v destilované vodě o koncentraci cca 3x10 8 CFU/ml. K 5 ml vzorku bylo přidáno 50 μl připravené bakteriální suspenze a vzorky s bakteriemi byly inkubovány ve vodní třepací lázni při 24 C. V časech 0, 15, 30, 45 a 60 min byly vzorky vyočkovány na krevní agar a po 24 hodinové inkubaci při 35 C vyhodnoceny. Rozmístění vyočkovaných vzorků na krevním agaru je znázorněno ve schématu 5. Schéma 5: Kvalitativní stanovení baktericidního účinku 1 Enterococcus faecalis 120 mg/l Ag 2 Enterococcus faecalis 60 mg/l 3 Enterococcus faecalis CBL-3 bez Ag 4 Enterococcus faecalis - kontrola růstu 5 Escherichia coli 120 mg/l Ag 6 Escherichia coli 60 mg/l Ag 7 Escherichia coli CBL-3 bez Ag 8 Escherichia coli - kontrola růstu 1 2 3 4 8 5 7 6 15

3.1.2.1.1.3 Kvantitativní stanovení rychlosti baktericidního účinku Pro kvantitativní stanovení rychlosti baktericidního účinku (kill time assay) byl testován nanokompozit Ag/PDDA-CBL-3 s kmeny Escherichia coli CCM 3954 a Enterococcus faecalis CCM 4224. V disperzích nanokompozitu odpovídajícím koncentraci stříbra 40; 20; 10; 5; a 2,5 mg/l byla připravena bakteriální suspenze o počáteční koncentraci 10 6 CFU/ml. Všechny vzorky byly inkubovány za stálého míchání při teplotě 24 C po dobu 360 min. V časových intervalech 0, 15, 30, 45, 60, 120, 180 a 360 min bylo vyočkováno 100 µl vzorků, ředěno fyziologickým roztokem a očkováno na krevní agar. Po 24 hodinách inkubace při 35 C byly spočítány narostlé kolonie a přepočítané na počet CFU/ml [29, 49]. 3.1.2.1.2 STANOVENÍ AKTIVITY METYLCELULÓZOVÉHO HYDROGELU S NANOČÁSTICEMI STŘÍBRA Metylcelulózový hydrogel s nanočásticemi stříbra byl syntetizován pro možnou lokální aplikaci na rány a popáleniny. V hydrogelu byly navázány nanočástice stříbra o velikosti 10 nm ve vysoké koncentraci 5 g/l. Pro přípravu AgNPs o velikosti 10 nm bylo použité redukční činidlo NaBH 4 a pro stabilizaci vzniklých AgNPs byl použitý polyakrylát sodný. Takto připravené AgNPs byly vloženy do metylcelulózové suspenze a za zvýšené teploty byl vytvořen hydrogel. Antimikrobní účinnost AgNPs o velikosti 10 nm, NaBH 4 a polyakrylátu sodného byla ověřena stanovením MIC diluční mikrometodou. Antimikrobní účinnost hydrogelu s navázanými AgNPs byla testována difúzní agarovou metodou. 100 µl hydrogelu s různými koncentracemi stříbra bylo přidáno do jamek v MH agaru, který byl inokulován bakteriální nebo kvasinkovou suspenzí o hustotě 10 6 CFU/ml. Schéma 6 popisuje rozložení testovaných vzorků na agaru. Sestava testovaných bakterií a kvasinek zahrnovala sbírkové bakterie Enterococcus faecalis CCM 4224, Staphylococcus aureus CCM 3953, Escherichia coli CCM 3954, Pseudomonas aeruginosa CCM 3955, rezistentní kmeny ze sbírky Ústavu mikrobiologie Lékařské fakulty Univerzity Palackého v Olomouci Pseudomonas aeruginosa ciprofloxacin-rezistentní kmen, ESBL-pozitivní kmen Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus epidermidis oxacilin-rezistentní kmen, Staphylococcus aureus MRSA, Enterococcus faecium VRE a kvasinky Candida albicans (2 kmeny), Candida parapsilosis a Candida tropicalis. Aktivita byla hodnocena na základě inhibičních zón kolem jamek s testovanými látkami na agaru s inokulovanou testovanou bakterií nebo kvasinkou [50]. 16

Schéma 6: Testování metylcelulózového hydrogelu s AgNPs 3.1.2.2 STANOVENÍ ANTIBAKTERIÁLNÍHO ÚČINKU POVRCHŮ S NANOČÁSTICEMI STŘÍBRA Nanočásticemi stříbra upravené povrchy textilií a plastů byly připraveny na Přírodovědecké fakultě Univerzity Palackého v Olomouci. Antibakteriální aktivita modifikovaných materiálů byla hodnocena u 2 bakteriálních kmenů, a to Escherichia coli CCM 39554 a Staphylococcus aureus CCM 3953. 3.1.2.2.1 TESTOVÁNÍ ANTIBAKTERIÁLNÍ AKTIVITY POVRCHU PLASTŮ Vzorky plastových folií byly připraveny v rámci projektu: Využití nanomateriálů a přírodních extraktů jako funkčních látek ve vývoji aktivních obalových materiálů s bariérovým, antimikrobiálním, protektivním a kyslík pohlcujícím efektem (TAČR 03010799, Technologická agentura České republiky). Cílem bylo připravit fólie s antimikrobním účinkem pro suchou desinfekci a optimalizovat výrobu aktivních obalových fólií obsahujících také aktivní stříbro. Prášková disperze AgNPs byla nanesena na plastovou folii LDPE typu AC 100 LD v koncentracích 0,2; 0,1; 0,05 a 0,025 g AgNPs na 1 kg polymeru (Obrázek 2). Obrázek 2:Folie LDPE s obsahem 0,2; 0,1; 0,05 a 0,025 g AgNPs na 1 kg polymeru 17

Vzorky folií byly zpracovány modifikovanou metodou vycházející z ISO 22196:2011 Plastics Measurment of antibacterial activity on plastics surfaces [21, 28]. Plastový vzorek o velikosti 5 x 5 cm byl opláchnutý 70% etanolem. Po oschnutí bylo na povrch vzorku umístěného ve sterilní Petriho misce inokulováno 0,4 ml bakteriální suspenze Staphylococcus aureus CCM 3953 nebo Escherichia coli CCM 3954, hustota inokula odpovídala 10 5 CFU/ml v MH bujónu ředěném 1/500 destilovanou vodou. Přes inokulum byla přiložena polyetylenová folie LDPE o velikosti 40 x 40 x 0,65 mm. Vzorky byly inkubovány 24 hodin při 35 C ve vlhké komoře. Po inkubaci byly vzorky důkladně opláchnuty 10 ml fyziologického roztoku. Oplachovací roztok byl ředěn geometrickou řadou fyziologickým roztokem. Z každého ředění bylo vyočkováno 0,1 ml na MH agar a rozetřeno inokulační hokejkou. Po inkubaci 24 hodin při 35 C byly odečteny počty CFU a přepočítány na CFU/cm 2. Antibakteriální aktivita (R) byla vypočtena podle ISO 22196 (Schéma 7). Schéma 7: Výpočet antibakteriální aktivity (R) podle ISO 22196. R = log CFU na cm 2 neošetřené kontrolní fólie log CFU na cm 2 fólie s AgNPs 3.1.2.2.2 TESTOVÁNÍ ANTIBAKTERIÁLNÍ AKTIVITY TEXTILIÍ Nosné tkaniny bavlnu (BAV), polyester (PES), polyamid (PA), bavlnu/polyester 1:1 (BAV/PES) dodala firma INOTEX s.r.o. Pro impregnaci textilií nanočásticemi stříbra byly použity různé metody přípravy, ponoření tkaniny do disperze před redukcí (in situ), po proběhlé redukci (ex situ) za použití různých redukčních činidel a impregnace tkaniny během sonochemické reakce. Při všech postupech došlo ke změnám fyzikálních vlastností tkanin a viditelné změně barvy na žlutohnědou v závislosti na koncentraci AgNPs. Navázané stříbrné nanočástice měly různou velikost a lišila se také koncentrace navázaných AgNPs. Cílem testování bylo porovnat jednotlivé typy přípravy textilií z pohledu účinnosti, náročnosti přípravy a vhodnosti pro další použití pro průmyslovou výrobu. Při impregnaci tkanin disperzí AgNPs připravenou redukcí komplexu [Ag(NH 3 ) 2 ] + maltozou za využití sonochemické metody byla velikost navázaných AgNPs 25 34 nm, koncentrace navázaného stříbra se pohybovala v rozmezí 37 46 µg/g tkaniny, obojí v závislosti na typu nosné textilie (Obrázek 3). 18

Obrázek 3: Tkaniny BAV, PES, BAV/PES, PA impregnované sonochemickou metodou Při impregnaci tkanin disperzí AgNPs připravenou redukcí [Ag(NH 3 ) 2 ] + maltózou metodou in situ byla tkanina vložena do reakčního roztoku před přidáním redukčního činidla, impregnace probíhala po dobu 5 minut. Velikost navázaných AgNPs byla 39 56 nm, koncentrace navázaného stříbra se pohybovala v rozmezí 64-167 µg/g tkaniny. Při použití metody ex situ byla tkanina vložena do hotové disperze AgNPs na dobu 23 hodin. Velikost navázaných AgNPs byla 29 39 nm, koncentrace navázaného stříbra se pohybovala v rozmezí 85 194 µg/g tkaniny. Při impregnaci tkanin metodou ex situ disperzí AgNPs, v konečné koncentraci stříbra 5 g/l nebo 0,1 g/l disperze, připravenou redukcí [Ag(NH 3 ) 2 ] + pomocí NaBH 4 za přítomnosti stabilizátoru NaPA 15000, byla velikost AgNPs 31 34 nm, resp. 21 28 nm, koncentrace navázaného stříbra se pohybovala v rozmezí 668 20 784 µg/g tkaniny, resp. 245 541 µg/g tkaniny. Vysoká koncentrace navázaného AgNPs při použití koncentrovanější disperze byla viditelná pouhým okem, textilie byly výrazně zbarveny žlutohnědě, impregnace nebyla homogenní (Obrázek 4). Při použití disperze o koncentraci stříbra 0,1 g/l byla koncentrace navázaného stříbra výrazně nižší (Obrázek 5). Obrázek 4: Tkaniny BAV, PES, PAV/PES, PA impregnované metodou ex situ disperzí AgNPs o koncentraci 5g/l 19

Obrázek 5: Tkaniny BAV, PES, PAV/PES, PA impregnované metodou ex situ disperzí AgNPs o koncentraci 0,1 g/l Pro vyhodnocení antibakteriální aktivity byly vzorky zpracovány upravenou metodou vycházející z JIS1902/ISO 20743 Textiles - Determination of antibacterial activity of antibacterial finished products [21, 27]. Textilní vzorek o hmotnosti 0,4 g byl sterilizován autoklávováním při 120 C po dobu 15 minut. Na vzorek uložený ve sterilní plastové zkumavce bylo inokulováno 0,2 ml bakteriální suspenze Staphylococcus aureus CCM 3953 nebo Escherichia coli CCM 3954. Hustota inokula byla 10 5 CFU/ml v MH bujónu ředěném 1/20 destilovanou vodou. Vzorky byly inkubovány po dobu 24 hodin při 35 C. Po inkubaci byly vzorky důkladně vypláchnuty do 20 ml fyziologického roztoku. Vyplachovací roztok byl ředěn geometrickou řadou fyziologickým roztokem. Z každého ředění bylo vyočkováno 0,1 ml na MH agar a rozetřeno inokulační hokejkou. Po inkubaci 24 hodin při 35 C byly odečteny počty CFU a přepočítány na CFU/vzorek. Antibakteriální aktivita (R) tkaniny byla vypočtena srovnáním logaritmů počtu CFU na neošetřeném a ošetřeném vzorku. Výpočet vychází z normy ISO 20743 (Schéma 8). Schéma 8: Výpočet antibakteriální aktivity R podle ISO 20743 R = log CFU na kontrolním vzorku log CFU na vzorku s AgNPs 3.1.3 Indukce bakteriální rezistence k nanočásticím stříbra Bakterie byly vystaveny dlouhodobému a opakovanému účinku stříbra při subinhibičních koncentracích s cílem prokázat či vyvrátit možnost indukce bakteriální rezistence. K testování indukce rezistence, resp. zvýšení hodnot MIC, byly použity kmeny Staphylococcus aureus CCM 3953, Escherichia coli CCM 3954 a Pseudomonas aeruginosa CCM 3955 z České sbírky mikroorganismů v Brně, dále pak kmeny Staphylococcus aureus 008 a Escherichia coli 013 ze sbírky Ústavu mikrobiologie Lékařské fakulty Univerzity Palackého v Olomouci. 20

Indukce rezistence byla provedena v mikrotitrační destičce opakovanou expozicí výše uvedených bakteriálních kmenů subinhibičním koncentracím nanočástic stříbra a AgNO 3. Testované vzorky byly exponenciálně naředěny v kultivačním MH bujónu a inokulovány bakteriální suspenzí. Konečná koncentrace inokula v jamce byla 10 6 CFU/ml. Destičky byly inkubovány při 35 C po dobu 24 hodin. Po inkubaci bylo 10 µl bakteriální suspenze z jamky s nejvyšší subinhibiční koncentrací testované látky vyočkováno na krevní agar a inkubováno 24 hodin při 35 C. Získané bakterie byly použity pro další cyklus. Popsaný postup představuje 1 cyklus indukce rezistence a celkem bylo provedeno 20 cyklů. Při 10. cyklu a posledním 20. cyklu indukce rezistence byla stanovena MIC původního kmene a srovnána s MIC kmene vystaveného opakovanému působení AgNPs a AgNO 3. 3.2 STANOVENÍ ANTIMIKROBNÍ AKTIVITY LIPOFOSFONOXINŮ Všechny testované lipofosfonoxiny (LPPOs) byly připravené v Ústavu organické chemie a biochemie AV ČR v.v.i. Testované látky vycházely ze základní struktury fosfonoxinů (Schéma 1). Chemické vzorce látek DR5026 a DR5047 patřících do I. generace LPPOs jsou znázorněny ve schématu 9. Schéma 9: Struktura lipofosfonoxinu DR5047a DR5026 3.2.1 Stanovení antibakteriální účinnosti Minimální inhibiční koncentrace testovaných LPPOs byly stanoveny standardní diluční mikrometodou. Hodnota minimální baktericidní koncentrace byla určena vyočkováním jamek se zábranou růstu na krevní agar [14, 76]. Stanovení MIC bylo provedeno u několika desítek nově syntetizovaných látek. Testované bakterie zahrnovaly sbírkové kmeny Enterococcus faecalis CCM 4224, Staphylococcus aureus CCM 3953, Escherichia coli CCM 3954, Pseudomonas aeruginosa CCM 3955 a kmeny ze sbírky Ústavu mikrobiologie Lékařské fakulty Univerzity Palackého v Olomouci Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolyticus, Bacillus subtilis, Streptococcus agalactiae, Staphylococcus aureus MRSA, Enterococcus faecium VRE a k chinolonům rezistentní kmeny Escherichia coli a Pseudomonas aeruginosa. 21

3.2.2 Semikvantitativní hodnocení baktericidního účinku v čase Pro stanovení rychlosti baktericidního účinku byly vybrány vzorky lipofosfonoxinů II. generace DR6155 a DR6180 v koncentracích odpovídající MBC a jejím násobkům, tedy 6,25; 12,5 a 25 µg/ml. Vzorky testovaných látek byly naředěny do 5 ml BHI media a inokulovány bakteriálním kmenem Staphylococcus aureus CCM 4223 a Escherichia coli CCM 3954. Počáteční koncentrace inokula byla 10 6 CF/ml. Zkumavky byly inkubovány 24 hodin při 35 C. Během inkubace bylo v časových intervalech 0, 15, 30 a 45 minut a 1, 2, 3, 4, 5, 6 a 24 hodin vyočkováno 10 µl vzorku na krevní agar a po 24 hodinách inkubaci při 35 C semikvantitativně odečten počet kolonií (CFU). Ze získaných dat byla sestavena kill-time křivka pro každý bakteriální kmen. 3.2.3 Stanovení účinku kostních cementů s lipofosfonoxiny Pro vyhodnocení vlivu lipofosfonoxinu na bakteriální kolonizaci kostního cementu byly sledovány počet a aktivita bakterií adherovaných na cementových kuličkách. Za sterilních podmínek byl připraven kostní cement (Hi-Fatigue Bone Cement 2x 40, aap Biomaterials GmbH, Germany) s testovaným lipofosfonoxinem. 300 mg DR5026 bylo smícháno s 5 g kostního cementu a polymerizováno přidáním 2,5 ml polymerizačního media. Z připraveného cementu byly vytvarovány kuličky o průměru cca 5 mm. Jako kontrola byl použit cement, který byl připraven ze stejné výrobní šarže, avšak bez přidané antimikrobní látky. Vzorky kostních cementů byly umístěny do 12-jamkových panelů a zality 3 ml kultivačního media (Brain heart infusion s 0,5 % glukózy) s bakteriální suspenzí Staphylococcus epidermidis CCM 7221. Počáteční hustota bakteriálního inokula odpovídala 10 6 CFU/ml. Následovala statická inkubace po dobu 3, 24 a 48 hodin, poté byly vzorky z jamek vyjmuty, třikrát opláchnuty sterilním fyziologickým roztokem a umístěny do 2 ml kultivačního media ve zkumavce. Pro uvolnění adherovaných buněk byla použita sonikace a důkladné roztřepání. Do jamek sterilní mikrotitrační destičky bylo následně přeneseno 100 µl sonikovaného kultivačního media a destička byla umístěna do spektrofotometru se zabudovaným inkubátorem. Statická inkubace probíhala 24 hodin při 35 C, v intervalu 1 hodiny byla po dvouminutovém roztřepání měřena absorbance při 630 nm. Ze získaných hodnot byla sestavena růstová křivka [3]. Zároveň bylo sonikované medium ředěno geometrickou řadou fyziologickým roztokem. Z každého ředění bylo přeneseno100 µl na MH agar (Trios) a rozetřeno inokulační hokejkou. Po 24 hodinách inkubace při 35 C byly spočítány narostlé kolonie a přepočítány na počet CFU adherovaných na vzorek. Christensenovou metodou byla potvrzena schopnost tvorby biofilmu kmenem Staphylococcus epidermidis CCM 7221 (Česká sbírka mikroorganismů, Brno; pozitivní kontrola pro detekci tvorby biofilmu a ica operonu) v kultivačním mediu Brain heart infusion (HIMEDIA) s 0,5 % glukózy. Do jamek mikrotitrační destičky typu P bylo napipetováno 200 μl bakteriální suspenze, po 24 hodinové statické inkubaci při 35 C byla destička šetrně promyta vodou a tím odstraněny volné bakteriální 22

buňky, adherované bakterie byly na povrch jamky fixovány 200 μl 99% metanolu po dobu 15 min. Po odsátí metanolu byl bakteriální biofilm barven 1% krystalovou violetí po dobu 10 min. Po důkladném promytí a odsátí volného barviva bylo barvivo navázáné na biofilm rozpuštěno v 33% kyselině octové a změřena optická denzita při vlnové délce 570 nm [11, 62, 68]. 3.2.4 Indukce bakteriální rezistence k lipofosfonoxinům K testování indukce rezistence, resp. zvýšení hodnot MIC, byly použity kmeny Staphylococcus aureus CCM 4223, Enterococcus faecalis CCM 4224, Pseudomonas aeruginosa CCM 3955 (Česká sbírka mikroorganismů, Brno) a Streptococcus agalactiae AV2006 (sbírka Ústavu mikrobiologie Lékařské fakulty Univerzity Palackého v Olomouci). Indukce rezistence byla provedena v mikrotitrační destičce opakovanou expozicí výše uvedených bakteriálních kmenů subinhibičním koncentracím testovaných látek DR5026, DR5047, DR5557, DR6088, DR6155 a DR6180, které byly v kultivačním mediu (Brain heart infusion, HIMEDIA) exponenciálně naředěny na koncentrace 1,6 200 mg/l. Připravené destičky byly skladovány při -20 C. Do rozmražené mikrotitrační desky byl inokulován příslušný bakteriální kmen. Konečná koncentrace inokula v jamce byla 10 6 CFU/ml. Destičky byly inkubovány při 35 C po dobu 24 hodin. Po inkubaci bylo 10 µl bakteriální suspenze z jamky s nejvyšší subinhibiční koncentrací testované látky vyočkováno na krevní agar a inkubováno 24 hodin při 35 C. Získané bakterie byly použity pro další cyklus. Popsaný postup představuje 1 cyklus indukce rezistence a celkem bylo provedeno 14 cyklů. Po posledním cyklu byla stanovena MIC původního kmene a srovnána s MIC po indukci. Jako kontrolní látka pro indukci vzniku rezistence byl použit ciprofloxacin, ke kterému vzniká rezistence velmi rychle [31]. Ciprofloxacin byl testován za stejných podmínek v koncentracích 0,06 8 mg/l. 23

4. VÝSLEDKY 4.1 ANTIMIKROBNÍ AKTIVITA NANOČÁSTIC STŘÍBRA 4.1.1 Stanovení antimikrobní účinnosti nanočástic stříbra a jejich kombinace s antibiotiky V následující kapitole jsou uvedeny výsledky získané při testování aktivity nanočástic stříbra na aerobní, fakultativně anaerobní a anaerobní bakterie, dále pak na kvasinky a současně jsou popsány možnosti synergického účinku s antibakteriálnímí látkami. 4.1.1.1 ANTIBAKTERIÁLNÍ AKTIVITA NANOČÁSTIC STŘÍBRA Stanovením MIC nanočástic stříbra diluční mikrometodou byla potvrzena jejich antibakteriální aktivita. Účinnost AgNPs byla závislá na jejich velikosti. Nejnižší hodnoty MIC měly nanočástice stříbra o velikosti 25 nm redukované maltosou, které se v některých případech dostaly až na hodnoty MIC iontového stříbra, tedy AgNO 3. Částice redukované galaktózou o velikosti 50 nm už dosahovaly MIC 27 - >54 mg/l. Hodnoty MIC se rovnaly hodnotám MBC. MIC AgNO 3 se pohybovaly v rozmezí 0,84 6,75 mg/l. Výsledky MIC AgNPs o různých velikostech jsou uvedeny v tabulce 1 [53]. Tabulka 1: Minimální inhibiční koncentrace AgNPs o různé velikosti (nm) a AgNO 3 MIC AgNPs (mg/l) 50 nm 40 nm 35 nm 25nm AgNO 3 Enterococcus faecalis CCM 4224 >54 >54 54,0 13,5 6,75 Staphylococcus aureus CCM 3953 54,0 6,75 6,75 6,75 6,75 Escherichia coli CCM 3954 >54 27,0 27,0 3,38 1,69 Pseudomonas aeruginosa CCM 3955 >54 27,0 13,5 6,75 0,84 Pseudomonas aeruginosa ciprofloxacin-rezistentní kmen Staphylococcus epidermidis oxacilin-citlivý kmen Staphylococcus epidermidis oxacilin-rezistentní kmen 27,0 13,5 6,75 1,69 0,84 6,75 13,5 6,75 1,69 0,84 54,0 6,75 6,75 1,69 1,69 Staphylococcus aureus MRSA 54,0 27,0 27,0 6,75 6,75 Enterococcus faecium VRE >54 >54 54,0 13,5 3,38 Klebsiella pneumoniae producent ESBL >108 27 54,0 6,75 3,38 24

Ag+ AgNPs AgNPs +0,01 % kaseinu AgNPs +0,1 % kaseinu AgNPs +1 % kaseinu AgNPs +0,1 % želatiny AgNPs +1 % PAA Tabulka 2 uvádí výsledky aktivity stříbra na testované kmeny anaerobních bakterií. Vysoké hodnoty MIC v intervalu od 13 do 34 mg/l prokázaly, že antibakteriální aktivita nestabilizovaných nanočástic stříbra vůči anaerobním bakteriím je nízká. MIC iontového stříbra dosahovaly u testovaných anaerobních bakterií hodnot v rozmezí 6 25 mg/l. Nejvyšší aktivity dosáhly částice stříbra stabilizované 1 % kaseinu, hodnoty MIC se pohybovaly se v intervalu od 1 do 13 mg/l. Aktivita takto stabilizovaných nanočástic byla dokonce vyšší než aktivita iontového stříbra. Částice stříbra stabilizované nižší koncentrací kaseinu a také částice stabilizované želatinou a polyakrylátem nevykazovaly významně nižší hodnoty MIC oproti nestabilizovaným částicím [81]. Tabulka 2: Minimální inhibiční koncentrace AgNPs (mg/l) u anaerobních bakterií MIC (mg/l) Bacteroides fragilis CCM 4712 8,72 22,78 30,38 40,50 6,75 >108 18,00 Bacteroides thetaiotaomicron CCM 4713 5,72 17,09 13,50 33,75 1,69 >108 23,63 Eggerthella lenta CCM 4714 10,02 30,52 40,50 33,75 0,89 27 12,33 Propionibacterium acnes CCM 3343 5,99 13,50 8,10 7,43 1,69 54 26,02 Clostridium perfringens CCM 4991 25,31 22,54 21,38 5,07 5,07 >108 54 Clostridium difficile CCM 3593 14,85 33,75 31,50 27,00 12,5 >108 27 Fusobacterium varium 15,19 24,75 21,94 27,00 6,75 >108 27 AgNPs nanočástice stříbra; PAA kyselina polyakrylová 4.1.1.2 ANTIFUNGÁLNÍ AKTIVITA NANOČÁSTIC STŘÍBRA Výsledky MIC u jednotlivých kvasinek jsou uvedeny v tabulce 3. MIC dosahovaly hodnot 0,1 1,69 mg/l. Hodnota MIC nestabilizovaných nanočástic stříbra se rovnala hodnotě MIC iontového stříbra. Při stabilizaci AgNPs pomocí SDS bylo dosaženo ještě nižších hodnot MIC, v případě Candida albicans I se MIC rovnala 0,05 mg/l. Hodnota minimální fungicidní koncentrace (MFC) byla 2-4x vyšší než hodnota minimální inhibiční koncentrace [51]. 25

Tabulka 3: Minimální inhibiční koncentrace AgNPs u kvasinek AgNO 3 AgNPs AgNPs + SDS MIC (mg/l) AgNPs + Tween 80 AgNPs + Brij AgNPs + PVP 360 Candida albicans I 0,42 0,42 0,05 0,10 0,10 0,10 Candida albicans II 0,42 0,21 0,10 0,21 0,21 0,21 Candida parapsilosis 1,69 1,69 0,84 0,84 0,84 0,84 Candida tropicalis 0,84 0,84 0,42 0,42 0,42 0,42 SDS sodium dodecylsulfát, Brij - Polyethylene glycol hexadecyl ether, PVP polyvinylpyrrolidon 4.1.1.3 ÚČINEK NANOČÁSTIC STŘÍBRA A JEJICH KOMBINACE S ANTIBIOTIKY 4.1.1.3.1 ÚČINEK KOMBINACE AGNPS A ANTIBIOTIK NA CITLIVÉ BAKTERIE Bez ohledu na mechanismus účinku nebo chemickou strukturu antibiotika byl potvrzen nespecifický synergický efekt mezi nanočásticemi stříbra a všemi testovanými antibiotiky. Nanočástice stříbra v subinhibiční koncentraci v kombinaci s jednotlivými antibiotiky snižovaly hodnotu MIC antibiotik, resp. zesilovaly jejich účinnost. Například MIC ampicilinu pro Escherichia coli CCM 4225 byla 64 mg/l, MIC nanočástic stříbra 7,5 mg/l. Přidání nanočástic stříbra v koncentraci 2,5 mg/l snížilo MIC ampicilinu na 0,03 mg/l. Hodnoty MIC kombinací antibiotik a AgNPs jsou uvedeny v tabulkách 4 6 [54]. 4.1.1.3.2 ÚČINEK KOMBINACE AGNPS A ANTIBIOTIK NA REZISTENTNÍ BAKTERIE Pomocí frakční inhibiční koncentrace (FIC) byl podrobněji vyhodnocen účinek kombinací antibiotik a AgNPs u rezistentních bakterií. Výsledky jsou shrnuty v tabulkách 7 10. Např. u ESBLpozitivního kmene Escherichia coli byla MIC samotného cefotaximu 4 mg/l, MIC AgNPs 0,8 mg/l. Přidáním AgNPs v koncentraci 0,4 mg/l došlo ke snížení MIC cefotaximu na 0,03 mg/l, hodnota FIC byla stanovena na 0,508, což vyjadřuje aditivní efekt uvedené kombinace. Při přidání 0,2 mg/l AgNPs k cefotaximu se jeho MIC dostala na hodnotu 0,125 mg/l, FIC byla vypočtena 0,281, což odpovídá synergickému působení uvedené kombinace [55]. Obecně lze říci, že nanočástice stříbra zesilovaly účinky antibiotik ve všech testovaných koncentracích, a to i při nejnižší koncentraci odpovídající koncentraci MIC AgNPs/16. Nejsilnější efekt na antibakteriální aktivitu byl pozorován při koncentracích AgNPs odpovídajících MIC AgNPs/2 a MIC AgNPs/4, kdy došlo až k 100násobnému snížení MIC příslušného antibiotika. Zvýšené antibakteriální účinky antibiotik v kombinaci s koncentracemi nanočástic odpovídající MIC AgNPs/8 a MIC AgNPs/16 byly stále patrné, i když ne tak výrazně. 26

Tabulka 4: Escherichia coli CCM 4225 - MIC antibiotik (mg/l) v přítomnosti subinhibičních koncentrací AgNPs (MIC AgNPs byla 7,5 mg/l) AMP AMS CZL CRX CXT GEN COT COL OXO OFL TET AZT ATB 64 8 2 1 1 0,5 4 0,5 0,5 0,03 4 0,03 ATB+5 mg/l AgNPs 0,001 0,001 0,001 0,001 0,001 0,0005 0,002 0,0005 0,001 0,0002 0,0005 0,002 ATB + 2,5 mg/l AgNPs 0,03 0,03 0,002 0,001 0,001 0,0005 2 0,001 0,5 0,0002 1 0,008 ATB + 1,25 mg/l AgNPs 64 8 2 1 1 0,06 2 0,125 0,5 0,015 2 0,03 ATB + 0,6 mg/l AgNPs 64 8 2 1 1 0,03 2 0,125 0,5 0,015 4 0,03 AMP ampicilin, AMS ampicilin/sulbactam, CZL cefazolin, CRX cefuroxim, CXT cefoxitin, GEN gentamicin, COT sulfamethoxazol/trimethoprim, COL kolistin, OXO kyselina oxolinová, OFL ofloxacin, TET tetracyklin, AZT aztreonam Tabulka 5: Pseudomonas aeruginosa CCM 3955 - MIC antibiotik (mg/l) v přítomnosti subinhibičních koncentrací AgNPs (MIC AgNPs byla 7,5 mg/l) PIP PPT AZT MER CTZ CPR CPM GEN AMI COL OFL CIP ATB 4 4 4 1 1 4 2 0,25 1 0,5 1 0,125 ATB+5 mg/l AgNPs 0,0078 0,0039 0,00097 0,0019 0,00024 0,00048 0,00024 0,00048 0,00048 0,00048 0,00024 0,00024 ATB + 2,5 mg/l AgNPs 0,015 0,0039 0,00097 0,0019 0,00024 0,00048 0,00024 0,00048 0,00048 0,00048 0,00024 0,00024 ATB + 1,25 mg/l AgNPs 2 4 4 0,5 1 4 1 0,015 0,25 0,06 1 0,03 ATB + 0,6 mg/l AgNPs 4 4 4 1 1 4 1 0,03 0,25 0,125 1 0,03 PIP piperacilin, PPT piperacilin/tazobactam, AZT aztreonam, MER meropenem, CTZ ceftazidim, CPR cefoperazon, CPM cefepim, GEN gentamicin, AMI amikacin, COL kolistin, OFL ofloxacin, CIP ciprofloxacin 27

Tabulka 6: Staphylococcus aureus CCM 4223 - MIC antibiotik (mg/l) v přítomnosti subinhibičních koncentrací AgNPs (MIC AgNPs byla 5 mg/l) PEN OXA AMS CMP TET COT ERY CLI CIP GEN TEI VAN ATB 0,125 0,25 0,5 4 0,25 1 0,125 0,125 0,25 0,25 0,25 1 ATB + 2,5 mg/l AgNPs 0,00006 0,00048 0,00048 0,00048 0,00012 0,0019 0,00012 0,00012 0,00012 0,00048 0,00097 0,00048 ATB + 1,25 mg/l AgNPs 0,015 0,03 0,06 2 0,015 0,0078 0,06 0,015 0,015 0,06 0,015 0,00097 ATB + 0,6 mg/l AgNPs 0,015 0,25 0,125 4 0,015 0,03 0,06 0,015 0,03 0,25 0,03 0,03 PEN benzylpenicilin, OXA oxacilin, AMS ampicilin/sulbactam, CMP chloramfenikol, TET tetracyklin, COT sulfamethoxazol/trimethoprim, ERY erytromycin, CLI klindamycin, CIP ciprofloxacin, GEN gentamicin, TEI teikoplanin, VAN - vankomycin 28

Tabulka 7: Účinek kombinací AgNPs a antibiotik na kmen Escherichia coli produkující ESBL MIC AgNPs = 0,8 mg/l CTX CTZ MER CIP GEN MIC FIC efekt MIC FIC efekt MIC FIC efekt MIC FIC efekt MIC FIC efekt ATB + AgNPs 0,0 mg/l 4 16 0,06 >32 0,5 ATB + AgNPs 0,4 mg/l 0,03 0,508 A 0,125 0,508 A 0,06 1,5 I 0,125 0,504 A 0,125 0,75 A ATB + AgNPs 0,2 mg/l 0,125 0,281 S 0,125 0,258 S 0,06 1,25 I 0,125 0,254 S 0,125 0,5 S ATB + AgNPs 0,1 mg/l 1 0,375 S 2 0,25 S 0,06 1,125 I 0,5 0,140 S 0,125 0,375 S ATB + AgNPs 0,05 mg/l 1 0,312 S 16 1,063 I 0,06 1,063 I 2 0,125 S 0,125 0,313 S Tabulka 8: Účinek kombinací AgNPs a antibiotik na kmen Escherichia coli produkující AmpC MIC AgNPs = 3,4 mg/l CTX CTZ MER CIP GEN MIC FIC efekt MIC FIC efekt MIC FIC efekt MIC FIC efekt MIC FIC efekt ATB + AgNPs 0,0 mg/l 8 32 0,06 32 0,5 ATB + AgNPs 1,7 mg/l 0,03 0,504 A 0,125 0,504 A 0,06 0,502 I 0,125 0,504 A 0,125 0,525 A ATB + AgNPs 0,8 mg/l 0,03 0,254 S 0,125 0,254 S 0,06 0,251 I 0,125 0,254 S 0,125 0,275 S ATB + AgNPs 0,4 mg/l 1 0,25 S 2 0,188 S 0,06 0,25 I 8 0,375 S 0,125 0,15 S ATB + AgNPs 0,2 mg/l 1 0,188 S 8 0,313 S 0,06 1,063 I 16 0,562 A 0,125 0,087 S A aditivní efekt, S synergie, I indiference CTX cefotaxim, CTZ ceftazidim, MER meropenem, CIP ciprofloxacin, GEN gentamicin 29

Tabulka 9: Účinek kombinací AgNPs a antibiotik na kmen Klebsiella pneumoniae produkující KPC MIC AgNPs = 3,4 mg/l CTX CTZ MER CIP GEN MIC FIC efekt MIC FIC efekt MIC FIC efekt MIC FIC efekt MIC FIC efekt ATB + AgNPs 0,0 mg/l >16 >64 >32 >32 1 ATB + AgNPs 1,7 mg/l 0,03 0,502 A 0,125 0,502 A 0,06 0,502 A 0,125 0,504 A 0,125 0,625 A ATB + AgNPs 0,8 mg/l 2 0,375 S 0,125 0,252 S 0,06 0,252 S 0,5 0,267 S 0,125 0,375 S ATB + AgNPs 0,4 mg/l >16 1,125 I 2 0,156 S 4 0,25 S 8 0,375 S 0,125 0,25 S ATB + AgNPs 0,2 mg/l >16 1,063 I >64 1,063 I >32 1,063 I 16 0,563 A 1 1,063 I Tabulka 10: Účinek kombinací AgNPs a antibiotik na kmen Klebsiella pneumoniae produkující ESBL MIC AgNPs = 6,8 mg/l CTX CTZ MER CIP GEN MIC FIC efekt MIC FIC efekt MIC FIC efekt MIC FIC efekt MIC FIC efekt ATB + AgNPs 0,0 mg/l >32 32 0,06 0,25 >32 ATB + AgNPs 3,4 mg/l 0,03 0,501 A 0,125 0,504 A 0,06 1,5 A 0,125 1 A 0,125 0,504 I ATB + AgNPs 1,7 mg/l 0,03 0,251 S 0,125 0,254 S 0,06 1,25 A 0,125 0,75 A 1 0,281 S ATB + AgNPs 0,8 mg/l 0,03 0,126 S 0,125 0,129 S 0,06 1,125 I 0,25 1,125 I 2 0,187 S ATB + AgNPs 0,4 mg/l 1 0,094 S 2 0,125 S 0,06 1,063 I 0,25 1,063 I 16 0,563 I A aditivní efekt, S synergie, I indiference CTX cefotaxim, CTZ ceftazidim, MER meropenem, CIP ciprofloxacin, GEN - gentamicin 30

4.1.1.3.3 INHIBICE PRODUKCE ESBL NA MODIFIKOVANÉM AGARU S AGNPS Synergický účinek AgNPs a antibiotik byl potvrzen také při použití fenotypových testů pro průkaz ESBL. Použitím DDST byla potvrzena produkce ESBL u obou testovaných kmenů, tedy Escherichia coli a Klebsiella pneumoniae. Na MH agaru bez AgNPs došlo k deformaci inhibičních zón kolem antibiotik a ke zvětšení zóny ceftazidimu s kyselinou klavulanovou oproti inhibiční zóně samotného ceftazidimu (Obrázek 6a, 7a). Na MH agaru s 5 mg/l AgNPs se vytvořily velké inhibiční zóny kolem antibiotických disků, oba kmeny se jevily jako citlivé k testovaným antibiotikům a fenotypový průkaz ESBL byl vyhodnocen jako negativní (Obrázek 6b, 7b) [55]. Obrázek 6: Escherichia coli producent ESBL, fenotypový průkaz ESBL pomocí modifikovaného DDST testu, MH agar (a) a MH agar s AgNPs (b) Obrázek 7: Klebsiella pneumoniae producent ESBL, fenotypový průkaz ESBL pomocí modifikovaného DDST testu, MH agar (a) a MH agar s AgNPs (b) 31

4.1.2 Antimikrobní účinnost nanokompozitů a povrchů s nanočásticemi stříbra Kapitola shrnuje výsledky antimikrobní aktivity nanočástic stříbra v konkrétních aplikacích, a to při navázání nanočástic stříbra na nosiče křemelinu, metylcelulózu povrchy plastů a textilií. 4.1.2.1 NANOKOMPOZITY S NANOČÁSTICEMI STŘÍBRA 4.1.2.1.1 ÚČINEK NANOKOMPOZITU AG/PDDA-KŘEMELINA 4.1.2.1.1.1 Stanovení MIC nanokompozitu Připravený nanokompozit Ag/PDDA-křemelina vykazoval inhibiční aktivitu už při koncentraci stříbra 4,5 mg/l. Výsledky stanovení MIC testovaného nanokompozitu, resp. hodnoty MIC vztažené na množství nanočástic stříbra, u jednotlivých bakteriálních kmenů a kvasinek jsou uvedeny v tabulce 11. Tabulka 11: Minimální inhibiční koncentrace nanokompozitu Ag/PDDA-CBL-3 MIC Ag/PDDA- CBL-3 (mg/l) MIC navázaného Ag (mg/l) Enterococcus faecalis CCM 4224 100 4,55 Staphylococcus aureus CCM 3953 200 9,1 Escherichia coli CCM 3954 100 4,55 Pseudomonas aeruginosa CCM 3955 400 18,2 Pseudomonas aeruginosa 200 9,1 Staphylococcus epidermidis 1 200 9,1 Staphylococcus epidermidis 2 200 9,1 Staphylococcus aureus MRSA 100 4,55 Enterococcus faecium VRE 200 9,1 Klebsiella pneumoniae producent ESBL 200 9,1 Candida albicans I 200 9,1 Candida tropicalis 200 9,1 Candida parapsilosis 400 18,2 4.1.2.1.1.2 Kvalitativní stanovení baktericidního účinku Při kvalitativním hodnocení baktericidního účinku koncentrace stříbra u Escherichia coli, usmrtila koncentrace 120 mg/l ihned všechny buňky, k dosažení stejného výsledku u koncentrace 60 mg/l bylo potřeba 15 minut. V případě bakterie Enterococcus faecalis došlo k usmrcení všech 32

bakterií do 15 minut při použití koncentrace stříbra 120 mg/l, do 45 minut byly usmrceny všechny bakterie i ve vzorku s koncentrací stříbra 60 mg/l (Obrázek 8). Obrázek 8: Kvalitativní stanovení baktericidního účinku nanokompozitů 0 minut 15 minut 2 3 1 1 4 8 7 6 5 30 minut 45 minut 1 4: Enterococcus faecalis: 1-120 mg/l Ag, 2-60 mg/l, 3 - kompozit bez Ag, 4 - kontrola růstu 5 8: Escherichia coli: 5-120 mg/l Ag, 6-60 mg/l Ag, 7 - kompozit bez Ag, 8 - kontrola růstu 4.1.2.1.1.3 Kvantitativní stanovení baktericidního účinku Metodou kill-time assay byl potvrzen rychlý baktericidní účinek nanokompozitu. Při koncentraci stříbra 40 mg/l byly testované bakterie Escherichia coli usmrceny do 30 minut, resp. do 180 minut u Enterococcus faecalis. Výsledek počtu bakterií (CFU/ml) v čase je uvedený v grafech 1 a 2. Je zřejmé, že rychlost baktericidního účinku závisí na koncentraci stříbra. Rychlejší baktericidní účinek i při nižších koncentracích stříbra byl zaznamenán u Escherichia coli [49]. 33

log CFU/ml log CFU/ml Graf 1: Rychlost baktericidního účinku Ag/PDDA-křemeliny u Escherichia coli Escherichia coli 7 6 5 4 3 2 1 0 0 50 100 150 200 čas (min) 40 mg/l AgNPs 20 mg/l AgNPs 10 mg/l AgNPs 5 mg/l AgNPs 2,5 mg/l AgNPs 0 mg/l AgNPs Graf 2:Rychlost baktericidního účinku Ag/PDDA-křemeliny u Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis 7 6 5 4 3 2 1 0 0 50 100 150 200 čas (min) 40 mg/l AgNPs 20 mg/l AgNPs 10 mg/l AgNPs 5 mg/l AgNPs 2,5 mg/l AgNPs 0 mg/l AgNPs 4.1.2.1.2 ÚČINEK METYLCELULÓZOVÉHO HYDROGELU S NANOČÁSTICEMI STŘÍBRA Antimikrobní účinnost disperze AgNPs, NaBH 4 a polyakrylátu sodného je uvedena v tabulce 12. Z výsledku je zřejmé, že aktivitu v kompozitu zajišťují pouze stříbrné nanočástice. Borohydrát sodný ani polyakrylát sodný nemají na testované kmeny bakterií a kvasinek inhibiční vliv. 34

Tabulka 12: Minimální inhibiční koncentrace AgNPs o velikosti 10 nm, NaBH 4 a polyakrylátu sodného MIC (mg/l) AgNPs NaBH 4 NaPA Escherichia coli CCM 3954 1,69 - - Klebsiella pneumoniae 2486 producent ESBL 3,38 - - Pseudomonas aeruginosa CCM 3955 0,84 - - Pseudomonas aeruginosa 532 0,84 - - Staphylococcus aureus CCM 3953 1,84 - - Staphylococcus aureus 4591 MRSA 1,84 - - Staphylococcus epidermidis 879 0,84 - - Staphylococcus epidermidis 901 0,84 - - Candida albicans I 0,21 - - Candida albicans II 0,21 - - Candida tropicalis 0,42 - - Candida parapsilosis 0,42 - - NaBH 4 - borohydrát sodný, NaPA polyakrylát sodný Při použití difuzní metody byly srovnávány průměry inhibičních zón. Velikosti inhibičních zón se lišily v závislosti na testovaném mikroorganismu a koncentraci AgNPs v hydrogelu. Průměr inhibičních zón se zvětšoval se vzrůstající koncentrací AgNPs. Antimikrobní účinek metylcelulózového hydrogelu se stříbrem byl větší proti kvasinkám, což odpovídalo i hodnotám MIC samotných AgNPs. Antibakteriální aktivita hydrogelu proti jednotlivým testovaným bakteriím byla srovnatelná, pouze u testovaných kmenů enterobakterií (Escherichia coli a ESBL-pozitivní kmen Klebsiella pneumoniae) neměla nejnižší použitá koncentrace AgNPs 25 mg/l účinek. (Obrázek 9) Metylcelulóza s obsahem AgNPs 50-400 mg/l se tedy ukázala jako účinná proti testovaným bakteriím a kvasinkám [50]. 35

Obrázek 9: Antimikrobní aktivita metylcelulózového hydrogelu s AgNPs a b c d e f g h i j k l (a) Escherichia coli CCM 3954, (b) Staphylococcus aureus CCM 3953, (c) Staphylococcus epidermidis, (d) Staphylococcus aureus MRSA 4591, (e) Klebsiella pneumoniae producent ESBL 2486, (f) Pseudomonas aeruginosa CCM 3955, (g) Pseudomonas aeruginosa 532, (h) Staphylococcus epidermidis 901, (i) Candida albicans I, (j) Candida albicans II, (k) Candida tropicalis, (l) Candida parapsilosis 4.1.2.2 AKTIVITA POVRCHŮ S NANOČÁSTICEMI STŘÍBRA 4.1.2.2.1 ANTIBAKTERIÁLNÍ AKTIVITA POVRCHU PLASTŮ Antibakteriální aktivita testovaných plastových folií s různými koncentracemi AgNPs vypočtená dle ISO 22196 byla vysoká u obou testovaných bakterií, tedy Escherichia coli a Staphylococcus aureus. Výsledky jsou shrnuty v tabulce 13. Fólie s různými koncentracemi AgNPs vykazovaly stejně vysoké antimikrobní účinky i přes nehomogenitu nanesené disperze. Při antibakteriální aktivitě R = 3 dochází během 24 hodin ke snížení počtu CFU/cm 2 o 3 řády. 36

Tabulka 13:Antibakteriální aktivita (R) folií s obsahem AgNPs CFU/cm 2 Escherichia coli Staphylococcus aureus Log CFU/cm 2 R CFU/cm 2 Log CFU/cm 2 0 g AgNPs/kg 12375 4,09 3250 3,51 R 0,2 g AgNPs/kg 10 1 3,09 10 1 2,51 0,1 g AgNPs/kg 37,5 1,57 2,52 10 1 2,51 0,05 g AgNPs/kg 10 1 3,09 10 1 2,51 0,025 g AgNPs/kg 10 1 3,09 10 1 2,51 Po optimalizaci postupu nanášení disperzí AgNPs a sériích dalších testů antibakteriální aktivity byl pro poloprovozní zkoušky vybrán vzorek polyetylenu LDPE s obsahem 0,025 g AgNPs na 1 kg polymeru. Po optimalizaci procesu výroby měl výsledný polymer antibakteriální aktivitu u Escherichia coli 1,11 (R = 1,11), v případě Staphylococcus aureus 2,12 (R = 2,12). 4.1.2.2.2 ANTIBAKTERIÁLNÍ AKTIVITA TEXTILIÍ Při impregnaci tkanin disperzí AgNPs s redukcí [Ag(NH 3 ) 2 ] + maltozou za využití sonochemické metody byly výsledky antibakteriální aktivity vysoké s výjimkou polyesteru, kde se hodnota R pohybovala v nulových hodnotách. Výsledky jsou shrnuty v tabulce 14. Tabulka 14: Antibakteriální aktivita (R) při impregnaci tkanin sonochemickou metodou CFU/cm 2 Escherichia coli Log CFU/vzorek Staphylococcus aureus R CFU/cm 2 Log CFU/vzorek BAV 1 680 000 6,23 2 169 000 6,34 R BAV + AgNPs 20 1,30 4,93 30 000 4,48 1,86 PES 1 192 000 6,08 1 539 000 6,19 PES + AgNPs 628 000 5,80 0,28 2 664 000 6,43-0,24 BAV/PES 1 612 000 6,21 2 081 000 6,32 BAV/PES + AgNPs 2000 3,30 2,91 180 000 4,26 2,06 PA 1 428 000 6,15 1 844 000 6,27 PA + AgNPs 20 1,30 4,85 20 1,30 4,96 BAV bavlna, PES polyester, PA - polyamid 37

Impregnace tkanin disperzí AgNPs připravenou redukcí [Ag(NH 3 ) 2 ] + maltózou metodou in situ, stejně jako impregnace tkanin metodou ex situ se z hlediska antibakteriální aktivity neosvědčila. Připravené textilie nevykazovaly antibakteriální aktivitu proti testovaným bakteriím. Hodnoty R se pohybovaly u všech druhů textilií v rozmezí 0 0,63 bez rozdílu v použité metodě impregnace. Impregnace tkanin metodou ex situ disperzí AgNPs připravenou redukcí [Ag(NH 3 ) 2 ]+ pomocí NaBH 4 za přítomnosti stabilizátoru NaPA 15000 bylo dosaženo vysokých hodnot antibakteriální aktivity. Při použití koncentrovanější disperze byla antibakteriální aktivita u všech textilií vysoká, pro Escherichia coli dosahovala antibakteriální aktivita hodnot 4,57 4,92, u stafylokoka byla nižší, a to v rozmezí 2,41 5,04 (Tabulka 15). Tabulka 15: Antibakteriální aktivita (R) při impregnace tkanin metodou ex situ disperzí AgNPs o koncentraci 5 g/l CFU/cm 2 Escherichia coli Log CFU/vzorek Staphylococcus aureus R CFU/cm 2 Log CFU/vzorek BAV 1 680 000 6,23 2 169 000 6,34 R BAV + AgNPs 20 1,36 4,92 20 1,30 5,04 PES 1 192 000 6,08 1 539 000 6,19 PES + AgNPs 20 1,30 4,78 6000 3,78 2,41 BAV/PES 1 392 000 6,14 16 000 4,20 BAV/PES + AgNPs 20 1,30 4,84 20 1,30 2,9 PA 74 000 5,87 22 000 4,34 PA + AgNPs 20 1,30 4,57 20 1,30 3,04 BAV bavlna, PES polyester, PA - polyamid Při použití disperze s koncentrací AgNPs 0,1 g/l byla zjištěná antibakteriální aktivita opět vysoká. U kmene Escherichia coli byly hodnoty R u všech druhů textilií vyšší než 4 a aktivita textilií byla srovnatelná s textiliemi impregnovanými koncentrovanější disperzí. U Staphylococcus aureus měl pouze polyamid nižší antibakteriální aktivitu (R = 1,04). Výsledky jsou shrnuty v tabulce 16. 38

Tabulka 16: Antibakteriální aktivita (R) impregnovaných tkanin metodou ex situ disperzí AgNPs o koncentraci 0,1g/l CFU/cm 2 Escherichia coli Log CFU/vzorek Staphyloccus aureus R CFU/cm 2 Log CFU/vzorek BAV 2 208 000 6,34 1 368 000 6,14 R BAV + AgNPs 200 2,30 4,04 200 2,30 3,84 PES 1 072 000 6,03 1 318 000 6,12 PES + AgNPs 20 1,30 4,73 20 1,30 4,82 BAV/PES 1 392 000 6,14 16 000 4,20 BAV/PES + AgNPs 20 1,30 4,84 20 1,30 2,9 PA 74 000 5,87 22 000 4,34 PA + AgNPs 20 1,30 4,84 2 000 3,30 1,04 BAV bavlna, PES polyester, PA - polyamid 4.1.3 Indukce bakteriální rezistence k nanočásticím stříbra Testované kmeny bakterií (Escherichia coli CCM 3954, Staphylococcus aureus CCM 3953, Pseudomonas aeruginosa CCM 3955, Staphylococcus aureus 008, Escherichia coli 013) byly k AgNPs citlivé, MIC se pohybovaly v rozmezí 1,69 13,5 mg/l v závislosti na bakteriálním druhu. Rostoucí odolnost jednotlivých bakterií vystavených opakované kultivaci v subinhibičních koncentracích nanočástic stříbra je doložena v tabulce 17. Tabulka shrnuje hodnoty MIC AgNPs u jednotlivých kmenů po každém kroku indukce rezistence a MIC kontrolních kmenů nevystavených působení AgNPs v testech provedených paralelně s 10. a 20. cyklem indukce. Z hodnot MIC je zřejmé, že si bakterie postupně vytváří odolnost k AgNPs. Jako první se stala odolnou bakterie Escherichia coli CCM 3954. Významně vyšší hodnota MIC 13,5 mg/l oproti původní 3,38 mg/l byla zaznamenána už po 6 cyklu indukce rezistence, po osmém cyklu se hodnota MIC zvýšila až na >54 mg/l. Staphylococcus aureus CCM 3953 se stal rezistentním po 12. cyklu indukce rezistence, kdy se MIC zvedla na hodnotu 54 mg/l oproti původním 13,5 mg/l. Ke změně MIC u Pseudomonas aeruginosa CCM 3955 došlo také po 12. cyklu indukce, MIC se zvedla z původní hodnoty 1,69 mg/l na >54 mg/l. 39

Tabulka 17: Minimální inhibiční koncentrace AgNPs testovaných bakterií po jednotlivých krocích indukce rezistence Escherichia coli CCM 3954 Staphylococcus aureus CCM 3953 Pseudomonas aeruginosa CCM 3955 Staphylococcus aureus 008 AgNPs MIC (mg/l) 1* 2 3 4 5 6 7 8 9 10 10* 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 20* 3,38 6,75 3,38 6,75 6,75 13,5 13,5 >54 >54 >54 3,38 >54 >54 >54 >54 >54 >54 >54 >54 >54 >54 6,75 13,5 13,5 6,75 13,5 6,75 13,5 6,75 6,75 13,5 13,5 13,5 13,5 54 27 54 54 54 27 13,5 27 54 13,5 1,69 3,38 0,89 1,69 3,38 3,38 1,69 1,69 3,38 6,75 1,69 3,38 >54 >54 >54 >54 >54 >54 >54 >54 >54 3,38 3,38 6,75 1,69 3,38 1,69 1,69 1,69 1,69 3,38 6,75 1,69 3,38 6,75 13,5 6,75 13,5 13,5 27 >54 >54 >54 3,38 Escherichia coli 013 27 27 13,5 27 13,5 13,5 13,5 13,5 13,5 13,5 13,5 27 27 54 >54 >54 >54 54 54 54 54 27 10*, 20* srovnání MIC původního kmene, zpracováno současně s kmenem z 10. nebo 20. kroku indukce rezistence 40

Po kultivaci rezistentních kmenů v MH bujónu s 54 mg/l AgNPs docházelo v mikrotitrační destičce ke změně barvy a vzniku sraženiny. V případě Escherichia coli CCM 3954 ilustruje uvedenou skutečnost obrázek 10. Obrázek 10: Růst citlivé a rezistentní Escherichia coli v MH bujonu s AgNPs A B Mikrotitrační destička po kultivaci citlivého (A) a rezistentního kmene (B) Escherichia coli v přítomnosti AgNPs naředěných v koncentrační řadě 54 0,84 mg/l. Horní řada obsahuje pouze disperzi AgNPs o koncentraci 108 mg/l. Rezistentní kmeny, získané opakovanou kultivací v tekutém MH mediu se subinhibičními koncentracemi AgNPs, byly naočkovány na MH agary s obsahem AgNPs v koncentraci 20 mg/l a 40 mg/l. Modifikované MH agary změnily barvu do žlutohněda v závislosti na přidané koncentraci AgNPs (Obrázek 11A, 11B, 11C). Při kultivaci bakterií na MH agaru s obsahem 20 a 40 mg/l AgNPs se potvrdila inhibice růstu citlivých kmenů, zatímco růst rezistentních kmenů nebyl inhibován. Růst rezistentní a citlivé Escherichia coli CCM 3954 na agarech s AgNPs ukazuje obrázek 11. Při růstu rezistentních kmenů na agaru s 40 mg/l AgNPs docházelo v okolí růstu bakterií k černému zbarvení agarové půdy (Obrázek 12). Obrázek 11: Růst citlivé a rezistentní Escherichia coli na MH agaru s AgNPs A B C 41

D E F G H I MH agar bez AgNPs (A), MH s obsahem AgNPs o koncentraci 20 mg/l (B), MH s obsahem AgNPs o koncentraci 40 mg/l(c), růst AgNPs citlivé Escherichia coli na MH bez obsahu AgNPs (D), inhibice růstu citlivé Escherichia coli na MH agaru s obsahem 20 mg/l (E) a 40 mg/l (F), růst AgNPs rezistentní Escherichia coli na MH agaru bez obsahu AgNPs (G) a s obsahem AgNPs o koncentraci 20 mg/l (H) a 40 mg/l (I). Obrázek 12: Růst AgNPs rezistentní Escherichia coli na MH agaru s obsahem 40 mg/l AgNPs Stejným postupem, tedy opakovanou kultivací v subinhibičních koncentracích AgNO 3, byla provedena indukce rezistence k iontové formě stříbra. Ani po 20 cyklech kultivace bakterií v subinhibičních koncentracích AgNO 3 nedošlo k zvýšení MIC. Hodnoty MIC AgNO 3 na začátku, po 10. a 20. cyklu indukce jsou uvedeny v tabulce 18. Opakovanou kultivací bakterií v subinhibičních koncentracích AgNO 3 nedošlo ke vzniku rezistence bakterií k AgNO 3. 42