Moderní biotechnologie, zdroje informací a jejich využití při výuce na středních školách

Univerzita Palackého v Olomouci Přírodovědecká fakulta Katedra botaniky Moderní biotechnologie, zdroje informací a jejich využití při výuce na středních školách Diplomová práce Bc. Milan Glabazňa Studijní program: Chemie Studijní obory: Učitelství chemie pro střední školy Učitelství biologie pro střední školy Forma studia: Prezenční Olomouc 2012 Vedoucí práce: Ing. Ludmila Ohnoutková, Ph.D.

Prohlašuji, že předložená práce je mým původním autorským dílem, které jsem vypracoval samostatně pod vedením Ing. Ludmily Ohnoutkové, Ph.D.. Veškerou literaturu a další zdroje, z nichž jsem při zpracování čerpal, v práci řádně cituji a jsou uvedeny v seznamu použité literatury. V Olomouci dne 30. 7. 2012.. Bc. Milan Glabazňa 2

Děkuji Ing. Ludmile Ohnoutkové, Ph.D. za odborné konzultace, cenné připomínky a čas, který mi věnovala při vedení mé diplomové práce. Také děkuji Bc. Janě Vaškové za pomoc při práci v laboratoři. 3

BIBLIOGRAFICKÁ IDENTIFIKACE Jméno a příjmení autora: Název práce: Typ práce: Pracoviště: Vedoucí práce: Bc. Milan Glabazňa Moderní biotechnologie, zdroje informací a jejich využití při výuce na středních školách Diplomová práce Katedra botaniky Ing. Ludmila Ohnoutková, Ph.D. Rok obhajoby práce: 2012 ABSTRAKT Cílem této diplomové práce je tvorba výukového programu, který se věnuje problematice moderních biotechnologií. Soubor multimediálních prezentací je rozčleněn na tři celky. Obecná část shrnuje základní techniky práce s nukleovými kyselinami, které jsou pro moderní biotechnologie klíčové. Specifická část seznamuje posluchače s transgenními rostlinami, jejich podstatou, historií a legislativou. Doplňková část slouží k opakování nabytých vědomostí a shrnuje základní důležité pojmy. Veškeré prezentace byly vytvořeny s použitím programu Microsoft Office PowerPoint 2007 a jsou určeny především pro studenty a učitele gymnázií, kteří si můžou multimediální prezentace upravovat podle svého uvážení. Diplomová práce má dvě části: teoretickou a přílohy. Teoretická část obsahuje podrobnější rozbor výukových prezentací a návody k praktickým cvičením. Přílohy tvoří vytištěné prezentace a multimediální CD. Klíčová slova: Biotechnologie, DNA, GMO, transgenní rostlina Počet stran: 42 Počet příloh: 2 Jazyk: Čeština 4

BIBLIOGRAPHICAL IDENTIFICATION: Author s name: Title: Type of thesis: Department: Supervisor: Bc. Milan Glabazňa Modern biotechnology, informatik resources used on teaching high school students Master Botany Ing. Ludmila Ohnoutková, Ph.D. The year of presentation: 2012 ABSTRACT The aim of this thesis is the creation of educational program that addresses issues of modern biotechnology. Collection of multimedia presentations is divided into three parts. The general part summarizes the basic techniques for working with nucleic acids that are crucial for modern biotechnology. The specific part introduces students to the transgenic plants, their nature, history and legislation. Additional section to repeat the acquired knowledge and summarizes the important concepts. All presentations were created using Microsoft Office PowerPoint 2007, and are intended primarily for students and teachers of high schools, who may edit multimedia presentations at its discretion. This thesis has two parts: theoretical and attachments. The theoretical part contains a more detailed analysis of the educational presentations and instructions for practical exercises. Attachments are printed presentations, and multimedia CDs. Keywords: Biotechnology, DNA, GMO, transgenic plant Number of pages: 42 Number of appendices: 2 Language: Czech 5

OBSAH Teoretická část 1. Úvod 8 2. Cíle práce 9 3. Materiál a metody 10 4. Rozbor výukových prezentací 12 A. DNA 12 B. Genomika 15 C. Klonování DNA 17 D. Transgenní rostliny 20 E. GMO v zemědělství 22 F. GMO: historie a zákony 23 G. Slovník 26 H. Opakování 27 5. Návody na praktická cvičení 28 6. Výsledky 35 7. Diskuse 37 8. Závěr 38 9. Seznam použitých zdrojů 39 10. Seznam použitých zkratek 41 11. Seznam obrázků 42 Přílohy Příloha č. 1: Vytištěné prezentace Příloha č. 2: Multimediální CD 6

Teoretická část 7

1. ÚVOD Biotechnologie je interdisciplinární vědní obor, který využívá poznatky z různých oborů jako např. mikrobiologie, biochemie, chemické inženýrství, genetika či elektronika. Dle definice OSN v dohodě o biologické diverzitě je biotechnologie jakákoli technologie, která využívá biologické systémy, živé organismy nebo jejich části k určité výrobě nebo jejich přeměně či jinému specifickému využití. Biotechnologii jako vědu lze rozdělit na dvě skupiny: klasická a moderní. Tato diplomová práce je zaměřena na moderní biotechnologie, jejichž podstatou je genetická modifikace organismů na základě přenosu genetického materiálu z jednoho druhu organismu do druhého. Rozvoj tohoto oboru je záležitostí hlavně posledních třiceti let. Moderní biotechnologie nacházejí široké uplatnění především v medicíně, farmacii a zemědělství. V zemědělství jde především o zlepšování odolnosti pěstovaných plodin a zajišťování potravinových zdrojů. Tyto cíleně změněné rostliny jsou označovány jako geneticky modifikované organismy (GMO). Geneticky modifikované organismy na druhé straně vzbuzují u veřejnosti celou řadu environmentálních či zdravotnických obav, které pramení zejména z nejistoty důsledků jejich používání z dlouhodobého hlediska. Moderní biotechnologie a geneticky modifikované organismy mohou mít do budoucna velký potenciální užitek, musí však být vyvíjeny a využívány s použitím odpovídajících bezpečnostních opatření, zejména ve vztahu k životnímu prostředí a lidskému zdraví (Roudná, 2010). 8

2. CÍLE PRÁCE 1. Vyhledání literárních zdrojů v českém a anglickém jazyce. 2. Analýza možností uplatnění dostupných informací ve výuce na středních školách. 3. Vysvětlení odborných termínů z oblasti moderních biotechnologií. 4. Vypracování odborného slovníku. 5. Návrh výukového programu. 9

3. MATERIÁL A METODY Výukový program Moderní biotechnologie má za cíl prostřednictvím multimediálních prezentací seznámit studenty se základy poměrně mladého a rychlým tempem se vyvíjejícího oboru, který má obrovský potenciál do budoucna. Pro tvorbu prezentací byl použit software společnosti Microsoft: PowerPoint 2007. Součástí multimediálních prezentací jsou původní názorné animace, fotografie, obrázky, tabulky a odkazy na videa, která se věnují konkrétnímu tématu. Těmito prostředky bylo docíleno didaktické zásady názornosti. Z hlediska mezipředmětových vztahů jsou ukázková videa v původním anglickém znění. Zásada vědeckosti byla dosažena čerpáním informací z odborné literatury v českém a anglickém jazyce. Taktéž byly využity elektronické informační zdroje univerzity Palackého. Mezi použitými prameny jsou také tuzemské i zahraniční internetové stránky. Zásady soustavnosti a zpětné vazby bylo docíleno rozdělením osmi výukových multimediálních prezentací do tří celků, které na sebe navazují: Struktura výukového programu: Obecná část: A. DNA B. Genomika C. Klonování DNA Specifická část: D. Transgenní rostliny E. GMO v zemědělství F. GMO: historie a zákony Doplňková část: G. Slovník H. Opakování 10

K prohloubení zájmu a motivace studentů byla použita didaktická zásada spojení teorie s praxí formou návodů k praktickým cvičením, která lze zrealizovat téměř v každé středoškolské chemické či biologické laboratoři. U všech prezentací je použita jednotná forma vhodná pro výuku středoškolských studentů. Každá prezentace začíná snímkem, na kterém je název výukového programu a konkrétní téma, kterým se daná prezentace zabývá (viz obr. 1). Obr. 1: Úvodní snímek prezentace Na druhém snímku každé prezentace je pro přehlednost vždy uvedena koncepce celého výukového programu a na ní je zvýrazněno no téma dané výukové prezentace (viz obr. 2). Výukové cíle jsou shrnuty na třetích snímcích prezentací a slouží k rychlému zjištění osnovy, tedy konkrétních problematik, které jsou v prezentacích stručně a výstižně zmíněny (viz obr. 3). Obr. 2: Koncepce výukového programu Obr. 3: Výukové cíle prezentace 11

A. DNA 4. ROZBOR VÝUKOVÝCH PREZENTACÍ První výuková prezentace obecné části se zabývá základním materiálem moderních biotechnologií: DNA deoxyribonukleovou kyselinou. K výukovým cílům této prezentace patří základní složky DNA, její struktura, výskyt a funkce. Na snímku A4 jsou uvedeny základní stavební jednotky DNA: P = zbytek kyseliny trihydrogenfosforečné, né, S = sacharid (na stavbě DNA se podílí sacharid deoxyribosa o pěti uhlících), B = dusíkatá organická báze, jejímž základem je vždy cyklus se šesti uhlíky. Pro názornou představu je použito zjednodušené zobrazení jejich vzájemného spojení, čímž vzniká nukleotid. Obr. 4: Zjednodušené znázornění ní nukleotidu Snímek A5 znázorňuje souvislost mezi nukleotidem, řetězcem DNA, genem a chromozómem (viz obr. 5). Nukleotidy jsou základem každého řetězce DNA, proto se tomuto řetězci říká polynukleotidový na stavbě molekuly DNA se podílí celkem dva polynukleotidové řetězce. Část DNA, která nese genetickou informaci, se označuje jako gen. Geny jsou pak součástí chromozómu (chromozómy kromě DNA nesoucí genetickou informaci obsahují také bílkoviny tzv. histony). 12

Obr. 5: Od chromozómu k nukleotidu Obrázek na snímku A7 znázorňuje pravotočivou dvojšroubovici (dihelix) DNA. Tento model poprvé vytvořili v roce 1953 vědci Watson a Crick a v roce 1962 jim za tento objev byla udělena Nobelova cena. Strukturou DNA se již dříve zabývali Wilkins a Franklinová. Obr. 6: Dihelix DNA Na obrázku dihelixu DNA je dobře vidět spojení dvou polynukleotidových řetězců na základě párování neboli komplementarity dusíkatých bází. Adenin na jednom řetězci se vždy páruje s thyminem na řetězci druhém. Guanin je komplementární s cytosinem. Spojení dusíkatých bází probíhá za vzniku slabých vodíkových vazeb. Mezi adeninem a thyminem vznikají dvě a mezi guaninem a cytosinem tři vodíkové vazby. Při replikaci se právě tyto vazby enzymaticky poruší, aby mohlo dojít k rozpletení dvojšroubovice. 13

Snímky A8 a A9 shrnují výskyt DNA v živých organismech. U prokaryontních organismů je potřeba studentům nezapomenout zmínit plazmidy, o nichž bude pojednáno v souvislosti s klonováním DNA a vznikem geneticky modifikovaných organismů. Mitochondrie a chloroplasty jsou tzv. semiautonomní organely, které obsahují vlastní DNA a proteosyntetický aparát. Poslední snímek zmiňuje základní funkce DNA. Genetická informace je z chemického hlediska soubor návodů na proteosyntézu tvorbu všech proteinů daného organismu. 14

B. GENOMIKA V pořadí druhá prezentace obecné části výukového programu se zabývá základy vědního oboru genomika. Na snímku B4 je vymezen a blíže specifikován předmět. Termín genomika poprvé použil Thomas Roderick v roce 1986, zatímco pojem genom byl poprvé použit již v roce 1920. Jedná se o rychle se rozvíjející obor, který spadá pod bioinformatiku a v dnešní době se již neobejde bez použití moderní výpočetní techniky (Rastogi, 2007), (viz. např. přístroje pro měření koncentrace DNA na snímcích B10 a B12). Snímek B5 vyobrazuje transkripci přepis genetické informace z DNA do RNA a následné vystřižení nekódujících sekvencí intronů za vzniku mediátorové RNA, podle které se v procesu translace tvoří na ribozomech konkrétní bílkoviny (viz obr. 7). Obr. 7: Schéma transkripce Jedním ze základních cílů genomiky je sekvenování DNA. Podstatou tohoto procesu je sestavení sekvence = pořadí dusíkatých bází, tedy nukleotidů v jednom vlákně DNA, které jsou základem dědičné genetické informace. Takováto znalost genetické kódu je nesmírně důležitá pro další obory biologie a dá se říci, že je také základním materiálem pro moderní biotechnologie ve výzkumu geneticky modifikovaných organismů. 15

Snímek B8 obsahuje zjednodušenou animaci gelové elektroforézy (spustí se po kliknutí). Princip elektroforézy je v protlačování fragmentů (úseků) DNA rozpuštěných v tekutém prostředí ve stejnosměrném elektrickém poli molekulovým sítem, který tvoří gel z agarózy. Základním silou, která způsobuje usměrněný pohyb DNA je celkový záporný náboj molekuly DNA, který je způsoben zbytky kyseliny trihydrogenfosforečné. To je důvod, proč fragmenty DNA putují ve stejnosměrném elektrickém poli od záporného ke kladnému pólu (Bartoš a kol., 2006) Na snímku B9 je vpravo dole umístěn odkaz na online video s animací gelové elektroforézy. Z metod měření koncentrace DNA jsou v prezentaci uvedeny spektrometrie a fluorimetrie. Na snímku B12 je mimo jiné znázorněna struktura molekuly ethidium bromidu. Jedná se o silnou mutagenní látku, která způsobuje mutace v lidské DNA. Proto je potřeba při práci s touto sloučeninou dbát bezpečnosti práce a pracovat pouze v nepropustných rukavicích a ochranném oděvu. Ethidium bromid se nesmí vylévat do kanalizace, ale musí být řádně degradován (např. vysokou teplotou ve spalovnách). Na posledním snímku B13 je fotografie výstupu měření koncentrace DNA na agarózovém gelu na principu fluorescence ethidium bromidu po ozáření UV-zářením. 16

C. KLONOVÁNÍ DNA Poslední prezentace obecné části se věnuje klonování DNA základní technice genetického inženýrství. Základní kroky klonování DNA jsou shrnuty na snímku C5 a podrobněji popsány na následujících snímcích: Snímek C7 obsahuje schéma vnesení neboli inzerce části cizorodé DNA žádaného genu (na obrázku vyznačen jako oranžový úsek DNA) do plazmidu bakterie (ve výzkumu transgenních rostlin se nejčastěji ji používá patogenní bakterie Agrobacterium tumefaciens viz prezentace Transgenní rostliny ). Pro zobrazení všech částí snímku je potřeba dvakrát kliknout. Obr 8: Izolace plazmidu a inzerce DNA Rozštěpení plazmidu se děje pomocí tzv. restrikčních enzymů, které v určitém místě otevřou ou cyklickou molekulu DNA plazmidu, do kterého se poté vnese část cizorodé DNA, např. zájmový gen (Gene of Interest - GOI). Spojení cizorodé DNA probíhá opět enzymaticky pomocí spojovacího enzymu DNA ligázy. V dnešní době je komerčně dostupná celá řada plazmidů. Všechny tyto komerčně vyráběné plazmidy obsahují speciální gen, který zajišťuje jeho rezistenci (odolnost) vůči antibiotiku. Tato výhoda zajistí přežití pouze těch bakterií, které obsahují náš žádaný plazmid. Snímek C8 znázorňuje proces transformace = přenesení rekombinantní DNA (rekombinantního plazmidu) do hostitelské buňky pomocí elektroporace (vystavení elektrickým pulsům o vysokém napětí) nebo pomocí tepelného šoku (1krát kliknout). 17

Po přípravě rekombinantního plazmidu je potřeba jej začlenit zpět do bakteriální hostitelské buňky, která dovede rekombinantní plazmid namnožit (naklonovat). Do snímku je také vloženo online video s animací jednotlivých kroků při klonování genů. Snímek C9 uvádí postup při množení (amplifikaci) vektoru v hostitelských buňkách. Transformované bakterie se naočkují na živné médium o přesně známém složení a typu antibiotika, které odpovídá genu rezistence. Snímek C10 se zabývá výběrem (selekcí) transformovaných buněk, které již obsahují rekombinantní plazmid. Ne všechny buňky však tento plazmid obsahují. Je proto zapotřebí je nějakým způsobem odlišit. Např. u komerčního plazmidu pbluescript se využívá gen, který zabraňuje transformovaným bakteriím hydrolyzovat sacharid v živném médiu tyto bakterie zůstanou bíle zbarveny a modře se zabarví kolonie bakterií, které neobsahují ve svých plazmidech cizorodou DNA (viz obr. 10). Obr. 9: Kultivace transformovaných bakterií 18

Praktické využití klonování DNA je znázorněno no posledním snímku. Obr. 10: Využití klonování DNA Prokaryotní organismy s rekombinantní DNA se mohou využívat k produkci tzv. transgenních organismů ů nebo ve farmaceutickém průmyslu k přípravě proteinů, hormonů nebo enzymů. 19

D. TRANSGENNÍ ROSTLINY První prezentace specifické části seznamuje posluchače se vznikem, kultivací a využitím transgenních rostlin. V prezentaci jsou uvedeny dva způsoby transformace genů, které jsou předmětem našeho zájmu. V laboratořích rostlinných biotechnologií je hojně využívána metoda přenosu pomocí patogenní bakterie Agrobacterium tumefaciens (viz snímek D5) Tato patogenní bakterie se vyskytuje ve volné přírodě ě a napadá dvouděložné rostliny. Její plazmid obsahuje dvě části: Ti a T-DNA část. Jednovláknový meziprodukt T-DNA části je bakterie schopna vnést do rostliny a začlenit ji do genomické DNA. Tento princip je využíván v genetickém inženýrství rostlin (viz snímek D6 obsahuje také online video s animací transformace). Obr. 11: Praktický příklad: získání transgenní rostliny tabáku Snímek D10 obsahuje obrázek s popisem jednotlivých kroků ů při vzniku geneticky modifikované rostliny tabáku: 1. Z listu rostliny tabáku, kterou chceme geneticky modifikovat, se izolují tzv. listové disky. 20

2. Listové disky se kultivují na živné médium a jsou ošetřeny suspenzí obsahující Agrobacterium. 3. Za 24 hodin jsou explantáty přeneseny na médium pro indukci kalusu (nediferencované rostlinné pletivo), které je totipotentní. Totipotence u rostlin je definována jako schopnost dediferencovaných buněk regenerovat zpět v rostlinu. Do kultivačního média je také přidáno antibiotikum pro zničení Agrobacteria. 4. Rostoucí kalusy se postupně pasážují na regenerační média indukující růst listů a kořenů. Vlivem přítomnosti růstových hormonů dochází k diferenciaci rostlinných buněk a tvorbě rostlinných orgánů a celistvé rostliny. 5. Předpokládá se, že takto vzniklá rostlina je geneticky modifikovaná a její buňky obsahují gen, který byl na počátku transformován do bakteriálního plazmidu. 6. Přítomnost vnesených genů je však nutné ověřit. Za pomocí molekulárních metod se přítomnost genů ověřuje na úrovni DNA, RNA, proteinů. Na snímku D11 je pak zmíněna tzv. mikroprojektilová metoda, kdy je plazmidová DNA s požadovanými geny nastřelena pomocí genového děla přímo do rostlinné buňky. Na posledním snímku jsou uvedeny příklady pěstování geneticky modifikovaných rostlin: Odolnost vůči virům: např. transgenní papája odolná proti viru kroužkové skvrnitosti. Odolnost vůči herbicidům: uplatnění u bavlníku, sóji, řepky a kukuřice. Při postřiku pole herbicidem se zahubí jen plevel, kulturní transgenní plodiny obsahují gen vytvářející enzym, který herbicid (nejčastěji používaný Roundup) zneškodní. Odolnost vůči hmyzím škůdcům: použití genu bakterie Baccilus thuringiensis, který je zodpovědný za tvorbu tzv. Bt-toxinu = bílkovinný jed poškozující trávicí ústrojí hmyzu. Dnes se tento gen používá u kukuřice, brambor a bavlníku. Trvanlivost plodů: poprvé použito u rajčete, do kterého byl vložen gen zeslabující produkci enzymu rozkládajícího pektin v buněčné stěně. Farmaceutický průmysl: produkce vakcinačních látek (naděje pro země, kde lidé postrádají základní lékařskou péči). 21

E. GMO V ZEMĚDĚLSTVÍ Výuková prezentace se blíže zabývá geneticky modifikovanými rostlinami v agrárním sektoru. Postupně jsou zmíněna témata: rozšíření GMO v zemědělství, nejčastěji pěstované GM plodiny, základní pravidla koexistence, monitoring GM produktů v EU a testy GMO. Snímek E4: rozšíření GMO v zemědělství 160 milionů hektarů půdy využívané pro pěstování GM plodin je údaj z roku 2011. Ve 29 zemích pěstuje transgenní plodiny přes 15 milionů zemědělců. Od roku 1996 je celosvětově pozorován 10% nárůst ploch osetých GM plodinami. V Evropě jsou doposud povolené pouze dva typy plodin: Bt-kukuřice odolná vůči hmyzu a brambory se změněným složením škrobu (Svobodová a kol., 2012). Snímek E5 pak znázorňuje celkový nárůst území s pěstovanými GM plodinami, po kliknutí na ikonu videa se zobrazí webová stránka s filmem Spor o geny, který se zabývá GM plodinami v zemědělství. Na snímku E6 je uvedena tabulka s přehledem pěstovaných GM plodin v jednotlivých zemích (viz obr. 12). Obr. 12: Přehled pěstovaných GM plodin Převzato z: http://www.ochranapudy.cz/grafika/clanky/tabulka-zemi-s-gmo.jpg Malé rozšíření transgenních plodin v EU je dáno přísnými pravidly pěstování těchto rostlin (pravidla koexistence) jejich stručný přehled je uveden na snímku E8. Snímky E9 až E11 se věnují monitoringu a testům GM plodin. 22

F. GMO: HISTORIE A ZÁKONY Poslední prezentace specifické části obsahuje základní data důležitá v historií GMO a blíže je zmíněna na legislativa, která se týká pěstování a nakládání s GMO v EU a ČR Na snímcích F4 až F7 jsou zmíněny základní mezníky v historii GMO se zaměřením na transgenní rostliny. Obr. 13: Základní mezníky v historii GMO Snímek F8 v bodech pojednává o nakládání při práci s GMO. Dle zákona č. 78/2004 Sb. České republiky, která je součástí EU, se rozlišují 3 typy nakládání s GMO a genetickými produkty: Uzavřené nakládání s GMO každá činnost, při níž jsou organismy geneticky modifikovány nebo při níž jsou GMO pěstovány, uchovávány, dopravovány, ničeny, zneškodňovány ovány nebo jakýmkoli jiným způsobem používány v uzavřeném prostoru. Uvádění GMO do životního prostředí mimo uzavřený prostor. Uvádění GMO do oběhu úplatné nebo neúplatné předání nebo nabídnutí jiné osobě, nejde-li o předání nebo nabídnutí výlučně za účelem uzavřeného nakládání nebo uvádění do životního prostředí osobě oprávněné k tomuto způsobu nakládání. Na snímku F9 je uveden výčet regulačních rámců EU, které jsou veřejně dostupné na internetových stránkách http://eur-lex.europa.eu/cs/index.htm. 23

Poslední snímek F10 zmiňuje základní rámec legislativy GMO v ČR. Podrobný výklad zákona č. 78/2004 Sb. A další dokumenty jsou k dispozici na internetové adrese ministerstva životního prostředí: http://www.mzp.cz/cz/geneticky_modifikovane_organismy Jako zajímavost lze uvést povinnosti pěstitele GM Bt kukuřice od roku 2010 a soupis právních předpisů, z nichž vycházejí stanovené povinnosti, které jsou uveřejněné na webových stránkách MŽP: (platí pro každou fyzickou či právnickou osobu, která pěstuje, popř. hodlá pěstovat Bt kukuřici na půdním bloku, popř. dílu půdního bloku) 1. Informovat nejpozději do 1. března o záměru vysetí Bt kukuřice sousedního pěstitele (neplatí v případě, že od pozemku, kde bude pěstována Bt kukuřice, leží do vzdálenosti 140 m pouze vlastní pozemky a zároveň se do 400 m nenachází žádný ekologicky hospodařící zemědělec). Je možné využít formulář MZe (Ohlášení GM plodiny PŘED zahájením pěstování). 2. Dodržet minimální vzdálenost 70 m mezi porostem Bt kukuřice a jiným pozemkem s nemodifikovanou kukuřicí (popř. obsít klasickou kukuřicí, která se při sklizni považuje za GMO, dle schématu, kdy 1 řádek klasické kukuřice o min. šíři 70 cm kolem Bt kukuřice nahrazuje 2 m minimální odstupné vzdálenosti např. při těsně přiléhajících pozemcích s kukuřicí je nutné Bt hybridy obsít min. 35 řadami klasické kukuřice). 3. Dodržet minimální vzdálenost 200 m mezi porostem Bt kukuřice a jiným pozemkem s kukuřicí, která je pěstována v režimu ekologického zemědělství. 4. Informovat o vysetí Bt kukuřice sousedního pěstitele do 15 dnů od zasetí (neplatí v případě, že od pozemku, kde je pěstována Bt kukuřice, leží do vzdálenosti 140 m pouze vlastní pozemky a zároveň se do 400 m nenachází žádný ekologicky hospodařící zemědělec). 5. Písemně informovat o vysetí Bt kukuřice místní agenturu pro zemědělství a venkov nejpozději do 30 dnů od zasetí (je možné využít formulář MZe Ohlášení GM plodiny PO zahájení pěstování). 6. Písemně informovat o místě pěstování Bt kukuřice Ministerstvo životního prostředí nejpozději do 60 dnů od zasetí (informaci zaslat na adresu: Ministerstvo životního prostředí, odbor environmentálních rizik, Vršovická 65, 100 10 Praha 10). 7. Po sklizni označit produkt Bt kukuřice jako geneticky modifikovaný organismus včetně jednoznačného identifikačního kódu - u hybridů kukuřice typu MON810 je tímto kódem MON-ØØ81Ø-6 (tyto informace předat písemně odběrateli Bt kukuřice). Stejným způsobem označit klasickou kukuřici, která tvořila obsev! Živočišné produkty zvířat krmených Bt kukuřicí není třeba označovat. 24

8. Evidovat údaje o nakládání s Bt kukuřicí a uchovat je v podniku po dobu min. 5 let. Konkrétní požadované údaje jsou uvedeny ve vyhlášce č. 89/2006 Sb., o bližších podmínkách pěstování geneticky modifikované odrůdy. Právní předpisy, z nichž vycházejí výše stanovené povinnosti: Body č. 1, 2, 3, 4, 5 a 8 vycházejí ze zákona č. 252/1997 Sb., o zemědělství, ve znění novel č. 441/2005 Sb. a č. 291/2009 Sb., a následné vyhlášky č. 89/2006 Sb., o bližších podmínkách pěstování geneticky modifikované odrůdy, ve znění vyhlášky č. 58/2010 Sb. Body č. 6 a 7 vycházejí ze zákona č. 78/2004 Sb., o nakládání s geneticky modifikovanými organismy a genetickými produkty, ve znění pozdějších předpisů Bod č. 7 vychází z Nařízení Evropského parlamentu a Rady 1830/2003, o zpětné sledovatelnosti a označování geneticky modifikovaných organismů a zpětné sledovatelnosti potravin a krmiv vyrobených z geneticky modifikovaných organismů a o změně směrnice 2001/18/ES 25

G. Slovník Doplňková prezentace shrnující všechny odborné termíny, které jsou použity ve výukovém programu. Snímek G3 je výchozím rozcestníkem obsahující počáteční písmena, po kliknutí na písmeno se otevře snímek s termíny začínajícími na dané písmeno. Po kliknutí na šipku v pravém dolním rohu se opět zobrazí rozcestník. Obr. 14: Slovník základních pojmů 26

H. Opakování Poslední prezentace výukové programu obsahuje otázky k procvičení celého učiva. Jsou zde otevřené i uzavřené otázky. Po kliknutí myší se studentům zobrazí červeně správné výsledky a můžou si tak zkontrolovat správnost jejich řešení. Obr. 15: Procvičování učiva 27

5. NÁVODY NA PRAKTICKÁ CVIČENÍ Izolace DNA z jahod Pomůcky: Filtrační nálevka, kádinka, laboratorní lžička, kus látky, plastový sáček, skleněná tyčinka, mražené jahody Chemikálie: Chlorid sodný, isopropanol, detergent (např. saponát na nádobí) Obr. 16: Pomůcky a chemikálie pro izolaci DNA Postup: 1. Připravíme si extrakční činidlo: 100 ml vody smícháme s 5 kapkami detergentu (Jaru) a lžičkou chloridu sodného. 2. V plastovém sáčku s uzávěrem rozmělníme na kaši několik zralých jahod 6-10 ks. 3. Přidáme extrakční činidlo, promícháme a znovu rozmělníme. 4. Takto připravenou heterogenní směs přefiltrujeme přes gázu nebo scedíme přes sítko do kádinky. 5. Ke vzniklému filtrátu přilijeme stejné množství vychlazeného izopropylalkoholu, po několika minutách pozorujeme vysráženou DNA. 28

Obr. 17: Úprava jahod pro izolaci DNA Obr. 18: Vysrážení DNA Finance: do 50 Kč 29

Elektroforéza Pomůcky: 2 plastové krabičky s víkem (cca 10 x 15 cm), stabilizovaný napájecí adaptér (12 V, 500 ma), dvojlinka, kancelářské sponky, pinzeta, nůž, filtrační papír, potravinové barvy Chemikálie: Agar, TRIS (tris(hydroxymethyl)aminomethan), H 3 BO 3, destilovaná H 2 O Obr. 19: Pomůcky a chemikálie pro elektroforézu barviv Postup: 1. Příprava elektrolytu 1x TB: V 500 ml destilované vody rozpustíme 5,4 g TRIS, 2,75 g H 3 BO 3 a doplníme na objem 1 l. 2. Příprava gelu: 1% agar v 1x TB Do 250 ml Erlenmayerovy baňky nasypeme 1 g agarosy a přidáme 100 ml 1krát TB. Roztok dáme do mikrovlnné trouby a necháme 2krát projít varem. Po vychladnutí asi na 55 C nalijeme do plastové krabičky, necháme vychladnout a ztuhnout. (Pokud zabráníme vyschnutí, můžeme takto připravený gel skladovat i několik týdnů.) 30

3. Příprava zdroje elektrického proudu: Oddělíme od sebe cca 15 cm dvojlinky a cca 8 cm odizolujeme, na druhý konec připojíme konektor jack (zásuvka) a připojíme k napájecímu adaptéru (Pozor: adaptér nesmí být připojen ke zdroji napětí!). Do plastové krabičky nalijeme 50 100 ml připraveného elektrolytu, do kterého ponoříme odizolované části dvojlinky tak, aby se nedotýkaly. Zaizolované části přichytíme kancelářskými sponkami ke stěně krabičky. Obr. 20: Elektroforéza_příprava zdroje napětí 4. Vložení barev: Z filtračního papíru nastříháme tři proužky široké cca 3 mm. Připravíme si roztoky modré, žluté a zelené potravinové barvy. Do roztoků ponoříme proužky filtračního papíru a necháme napustit dolní konce. Takto napuštěné papírky pověsíme a necháme 10 minut zaschnout. Z barevných částí pak vystřihneme čtverečky 3x3 mm. Uřežeme kousek zásobního gelu a nožem uděláme tři zářezy vzdálené cca 7 mm od okraje, do kterých pak pinzetou vložíme barevné čtverečky. 5. Spuštění elektroforézy: Takto připravený gel vložíme do plastové krabičky mezi odizolované konce dvojlinky tak, aby čtverečky s barvami byly blíže k drátu, u kterého unikají bublinky. Nalijeme dostatek elektrolytu, aby překryl gel (nutno použít stejný roztok, z něhož byl připraven gel!). Krabičku uzavřeme průhledným víkem a zapojíme adaptér do elektrické zásuvky. Do 10 minut se složky barev v gelu rozdělí. 31

Obr. 21: Elektroforéza_počátek Obr. 22: Elektroforéza_konec Finance: do 250 Kč 32

Biodegradace oleje aerobními bakteriemi Pomůcky: 6 zavařovacích sklenic, akvarijní provzdušňovač, vzduchovací hadička, akvarijní rozvodky, akvarijní škrtítka, strojní olej, kapátko, hnědý papírový pytlík, laboratorní váhy, půdní vzorky, alobal, tužka, pravítko. Chemikálie: (NH 4 ) 3 PO 4, MgSO 4, K 3 PO 4, NaCl (nejodidovaný), destilovaná H 2 O Postup: 1. Zavařovací sklenice umyjeme a označíme lihovým fixem 1A, 1B až 3A, 3B. Stejné číslo značí stejnou variantu pokusu. 2. Do každé sklenice nalijeme 150 ml destilované vody a 2 g strojního mazacího oleje na rostlinné bázi. 3. Sklenice s označením 1A a 1B použijeme jako kontrolní a dáme je stranou. 4. Do ostatních sklenic vsypeme okolo 5 g půdního vzorku odebraného z organicky bohaté oblasti (hnojiště, ornice). 5. Do sklenic 3A a 3B přidáme navíc následující chemikálie: 0,25 g (NH 4 ) 3 PO 4 0,05 g MgSO 4 0,25 g K 3 PO 4 1,25 g NaCl 6. Vršky sklenic zakryjeme alobalem, abychom zabránili vypařování. Do alobalu uděláme díru, kterou prostrčíme vzduchovací hadičku do vody a následně ji připojíme na akvarijní provzdušňovač. 7. Výsledky zaznamenáváme z každé sklenice 1x za 3 dny po dobu 24 dní s použitím následující testu: Z hnědého papírového pytle vystřihneme čtverec 40 x 40 cm a tužkou jej rozdělíme na čtverce o straně 5 cm. Na jednom řádku nám tak vznikne 8 čtverců, do jejichž rohů napíšeme označení příslušné testované sklenice. Pomocí kapátka odebereme těsně z pod hladiny malé množství kapaliny a nakapeme 3 kapky na střed příslušného čtverce dle označení sklenice. Vzorky odebíráme vždy ze stejného místa! 33

Po několika hodinách se voda odpaří a na papíře zůstane mastný flek, jehož okraje vyznačíme tužkou, změříme jeho průměr a hodnotu zapíšeme. Obr. 24: Uspořádání pokusu biodegradace Obr. 25: Způsob okysličení Finance: do 200 Kč 34

6. VÝSLEDKY Výsledky této diplomové práce jsou výukové prezentace a návody na laboratorní cvičení. V teoretické části práce jsou podrobněji rozebrány jednotlivé výukové prezentace včetně metodických pokynů k některým snímkům. K diplomové práci jsou přiřazeny přílohy ve formě tištěných výukových prezentací a jejich elektronická podoba na CD. Výukový program obsahuje celkem 8 prezentací: A. DNA Úvodní prezentace, ve které jsou rozebrány složky, struktura, výskyt a funkce DNA. B. Genomika Druhá prezentace v pořadí se zabývá genomikou, sekvenováním a měřením koncentrace DNA. Podrobněji je probrána gelová elektroforéza. C. Klonování DNA Klíčová prezentace týkající se klonování DNA pomocí klonovacího vektoru, vzniku transformovaných buněk a jejich využití. D. Transgenní rostliny V prezentaci jsou popsány základní metody transgenoze a vznik transgenních rostlin včetně zásad kultivace v podmínkách in vitro a možnosti jejich využití. E. GMO v zemědělství Tato prezentace se blíže zabývá rozšířením GM rostlin v zemědělství, nejčastěji pěstovanými GM plodinami a základními pravidly jejich pěstování na území EU. F. GMO: historie a zákony Poslední prezentace specifické části se věnuje základním datům historie moderních biotechnologií a legislativě s nakládáním GMO organismů v EU a ČR. 35

G. Slovník Doplňková prezentace k výukovému programu, která přehledně shrnuje základní termíny z oblasti moderních biotechnologií. H. Opakování Prezentace obsahuje soubor testových otázek pro zopakování probíraných témat v jednotlivých prezentacích A až F. 36

7. DISKUZE Z předpokládaných cílů diplomové práce vznikl soubor výukových prezentací a návodů na praktická laboratorní cvičení. Předkládaná práce je především prací didaktickou, která je volně k dispozici všem učitelům a studentům středních škol. Využití by mohla najít zejména na školách gymnaziálního typu, kde probíhá výuka přírodovědných předmětů. Multimediální výukový program je možné využít hlavně u vyšších ročníků, ve kterých je obvykle probírána oblast genetiky a jejího využití. Jelikož jsou veškeré prezentace volně šiřitelné, každý vyučující si je může upravit podle svých možností a uvážení. Osobně jsem zvolil jednotný styl všech prezentací, na kterých je tmavé písmo na bílém pozadí. Dle vlastních zkušeností z pozice učitele se mi jeví tato varianta jako nejvhodnější, protože ne vždy disponují multimediální učebny na středních školách výkonným dataprojektorem s vysokým kontrastem barev. Součástí dvou prezentací jsou také odkazy na online videa vyžadující připojení k internetu. V prezentacích jsou většinou zmíněny základní pilíře dané problematiky, které jsou podrobněji rozebrány v teoretické části diplomové práce. Před použitím prezentací je tak vhodné načíst si kapitolu Rozbor výukových prezentací. Mnoho informací a rozsáhlé texty na snímcích prezentace pouze odvádí pozornost posluchačů. Praktická cvičení doporučuji provést v biologické či chemické laboratoři jako frontální pokusy, kdy žáci pracují samostatně ve skupinách. V případě, že není možno studenty rozdělit do skupin nebo není k dispozici laboratoř je možno pokusy (především izolaci DNA) provést jako demonstrační. 37

8. ZÁVĚR Diplomová práce Moderní biotechnologie, zdroje informací a jejich využití při výuce na středních školách je určena především učitelům a studentům na gymnáziích. Základem práce jsou výukové multimediální prezentace rozčleněné do tří celků. Obecná část se zabývá DNA a základními metodami práce s touto látkou. Prezentace této části mohou být použity také na výuku genetiky či biochemie. Specifická část navazuje na část obecnou a přibližuje jeden z významných okruhů moderních biotechnologií dnešní doby transgenní neboli geneticky modifikované rostliny. Doplňková část obsahuje výčet základních odborných termínů použitých v této práci a úlohy pro zopakování a procvičení učiva. Součástí jsou rovněž návody na praktická laboratorní cvičení, která jsou proveditelná téměř na všech školách gymnaziálního typu. 38

9. SEZNAM POUŽITÝCH ZDROJŮ BARTOŠ, Milan, Hana FOREJTNÍKOVÁ a Ladislava BARTOŠOVÁ. Biotechnologie pro farmaceuty: (návody k praktickým cvičením). Vyd. 1. Brno: Veterinární a farmaceutická univerzita, 2006, 98 s. ISBN 80-730-5559-7. CLARK, David P a Lonnie Dee RUSSELL. Molecular biology: made simple and fun. 3rd ed. St. Louis, MO: Cache River Press, 2005, vii, 515 p. ISBN 18898990703. CUSTERS, René. Průvodce biotechnologiemi: biotechnologie v zemědělství a potravinářství. Vyd. 1. Praha: Academia, 2006, 104 s. ISBN 80-200-1350-4. DROBNÍK, Jaroslav. Biotechnologie a společnost. 1. vyd. Praha: Karolinum, 2008, 213 s. ISBN 978-80-246-1484-7. IGNACIMUTHU, S. Biotechnology: an introduction. Oxford, U.K: Alpha Science International Ltd, 2008. ISBN 978-184-2654-514. JAMES, Clive. Global status of commercialized biotech/gm crops, 2009: brief 41 [online]. New Delhi: ISAAA South Asia Office, 2009, x, 290 p.[cit. 2012-07-4]. ISBN 978-1-892456-48-6. Dostupné z: www.isaaa.org/resources/publications/briefs/41/download/isaaa-brief-41-2009.pdf ONDRĚJ, Milos a Jaroslav DROBNÍK. Transgenoze rostlin. Vyd. 1. Praha: Academia, c2002, 316 p. ISBN 80-200-0958-2. RASTOGI, S.C. Biotechnology: principles and applications. Oxford, UK: Alpha Science International, 2007. ISBN 978-184-2653-708. ROUDNÁ (ED.), Milena, Jana MALÁ a Jaroslav DOBRÝ. Biotechnologie v lesnictví a příklady jejich využití - 2. Praha: Ministerstvo životního prostředí, 2010. ISBN 978-80-7212-545-6. ŠIFNER, František. Vybrané kapitoly z biotechnologií: pro studující učitelství biologie a ekologické výchovy. 1. vyd. Praha: Karolinum, 1998, 145 s. ISBN 80-718-4731-3. ŠTULÍK, Václav. Biotechnologie v praxi. Praha: ÚVTEI, 1991, 190 s. ISBN 80-212-0045-6. ŠUTA, Miroslav. Biotechnologie, životní prostředí a udržitelný rozvoj. Praha: Společnost pro trvale udržitelný život, 2007, 27 s. ISBN 978-80-902635-1-2. VODRÁŽKA, Zdeněk. Biochemie. 2. oprav. vyd. Praha: Academia, 2007, Přer. str. ISBN 80-200-0600-4. BRIEFING PAPER: EU GMO POLICIES, SUSTAINABLE FARMING AND PUBLIC RESEARCH [online]. 2012[cit. 2012-07-02]. Dostupné z: http://greenbiotech.eu/wpcontent/uploads/2012/06/farmers-scientists-briefing-paper-eu-gmo-policies-2012.pdf 39

Ekologické zemědělství a GMO: otázky koexistence : vaše otázky - naše odpovědi [online]. Olomouc: Bioinstitut, c2008, 37 s.[cit. 2012-07-03]. ISBN 978-80-904174-6-5. Dostupné z: http://www.bioinstitut.cz/documents/gmo-finalniverze.pdf Přínosy a rizika GMO využívaných v zemědělství a potravinářství ve vztahu k bezpečnosti potravin a k ochraně životního prostředí: sborník ze semináře : Výzkumný ústav rostlinné výroby Praha-Ruzyně, 26. říjen 2005. Editor Václav Stejskal, František Kocourek, Zuzana Pažourková. Praha: Výzkumný ústav rostlinné výroby, 2006, 93 s. ISBN 80-865-5584-4. Laboratoř molekulární biologie rostlin, společné pracoviště AF MENDELU a BFÚ AV ČR Ústav molekulární biologie a radiobiologie. Kultivace rostlin [online]. 13. 6. 2012 [cit. 2012-07-14]. Dostupné z: http://molecularbiology.symplia.eu/oblasti-vyzkumu/kultivacerostlin Ministerstvo zemědělství. Povinnosti pro pěstitele geneticky modifikované Bt kukuřice (od roku 2010) [online]. 2010 [cit. 2012-07-02]. Dostupné z: http://eagri.cz/public/web/file/45804/povinnosti_pro_pestitele_bt_kukurice_2010_8_3_ 2010.pdf Ministerstvo zemědělství. Pravidla pro pěstitele geneticky modifikovaných plodin v ČR [online]. 2010 [cit. 2012-07-02]. Dostupné z: http://eagri.cz/public/web/mze/zemedelstvi/gmo-geneticky-modifikovaneorganismy/pravidla-pro-pestitele-geneticky.html Společnost pro ochranu půdy v ČR. GMO se ve světě pěstuje již na desetině orné půdy [online]. 2008 [cit. 2012-07-02]. Dostupné z: http://www.ochranapudy.cz/?c=gmo-se-vesvete-pestuje-jiz-na-desetine-orne-pudy 40

10. SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK DNA ČR EU GMO T-DNA Deoxyribonukleová kyselina Česká republika Evropská unie Geneticky modifikovaný organismus Transferová deoxyribonukleová kyselina 41

11. SEZNAM OBRÁZKŮ Obr. 1: Úvodní snímek prezentace 11 Obr. 2: Koncepce výukového programu 11 Obr. 3: Výukové cíle prezentace 11 Obr. 4: Zjednodušené znázornění nukleotidu 12 Obr. 5: Od chromozómu k nukleotidu 13 Obr. 6: Dihelix DNA 13 Obr. 7: Schéma transkripce 15 Obr. 8: Izolace plazmidu a inzerce DNA 17 Obr. 9: Kultivace transformovaných bakterií 18 Obr. 10: Využití klonování DNA 19 Obr. 11: Praktický příklad: získání transgenní rostliny tabáku 20 Obr. 12: Přehled pěstovaných GM plodin 22 Obr. 13: Základní mezníky v historii GMO 23 Obr. 14: Slovník základních pojmů 26 Obr. 15: Procvičování učiva 27 Obr. 16: Pomůcky a chemikálie pro Izolaci DNA 28 Obr. 17: Úprava jahod pro izolaci DNA 29 Obr. 18: Vysrážení DNA 29 Obr. 19: Pomůcky a chemikálie pro elektroforézu barviv 30 Obr. 20: Elektroforéza_příprava zdroje napětí 31 Obr. 21: Elektroforéza_počátek 32 Obr. 22: Elektroforéza_konec 32 Obr. 23: Uspořádání pokusu biodegradace 34 Obr. 24: Způsob okysličení 34 42