Interakce iontů s proteiny Ion-Protein Interactions

Přírodovědecká fakulta Univerzity Karlovy v Praze Katedra fyzikální a makromolekulární chemie Charles University in Prague, Faculty of Science Department of Physical and Macromolecular Chemistry Modelování chemických vlastností nano- a biostruktur Modelling of Chemical Properties of Nano- and Biostructures Autoreferát disertační práce Summary of the Ph.D. Thesis Interakce iontů s proteiny Ion-Protein Interactions Mgr. et Mgr. Jan Heyda Ústav organické chemie a biochemie, AV ČR v.v.i. Centrum biomolekul a komplexních molekulových systémů Školitel/Advisor: Prof. Pavel Jungwirth, DSc. Praha, 2011

CONTENTS 2 Contents 1 Abstract in English 5 1.1 Introduction into complex systems................. 5 1.2 Aims of the study........................... 6 1.3 Computational methods....................... 6 1.3.1 Simulation protocol...................... 6 1.3.2 Methods of analysis...................... 7 1.4 Results and discussion........................ 8 1.4.1 Case study Model of the peptide bond.......... 9 1.4.2 Amino acid proxies...................... 10 1.4.3 Single amino acids and short oligopeptides......... 10 1.4.4 Peptides and proteins..................... 11 1.5 Summary............................... 11 2 Autoreferát v českém jazyce 13 2.1 Úvod do komplexních systémů.................... 13 2.2 Cíle práce............................... 14 2.3 Výpočetní metody.......................... 14 2.3.1 Simulační protokol...................... 14 2.3.2 Druhy analýzy........................ 15 2.4 Výsledky a diskuse.......................... 15 2.4.1 Příklad studie modelu peptidové vazby.......... 16 2.4.2 Modely funkčních skupin................... 18 2.4.3 Jednotlivé aminokyseliny a krátké oligopeptidy...... 18 2.4.4 Peptidy a proteiny...................... 19 2.5 Závěr.................................. 19 Bibliography 21 Curriculum vitae 24 Selected Publications/Seznam publikací 25

Title: Ion-Protein Interactions Author: Mgr. et Mgr. Jan Heyda Department: Physical and Macromoleculer Chemistry Advisor: Prof. Pavel Jungwirth, DSc., IOCB AS CR, v.v.i. Advisor s e-mail address: pavel.jungwirth@uochb.cas.cz Abstract: Conventional molecular dynamics simulations in combination with advanced methods of analyses were used to improve the understanding of the interaction between ions and proteins in salt solutions. Thus systems of diverse complexity and size were investigated, starting with simple (and molecular) salt solutions with small fragments that mimic the various functional groups of amino acids such as N-methylacetamide representing the peptide bond or alkylated ammonium cations. Continuing with individual positively charged amino acids (arginine, histidine, lysine) a strong binding interaction with small fluoride anion that is significantly weakened for larger halides (Cl, Br, I ) was described. This observation was extended by detecting the strong sensitivity of fluoride to charge distribution on ammonium, lysine side chain, and the N-terminal of glycine while sensitivity of iodide was found to be low. Later it was shown that the attractive side chain-side chain interactions are significant for short positively charged peptide fragments in polyarginine and dihistidine, while they are not present at all in case of polylysine. Considering the qualitative difference in the origin of ion-specific interactions, electrophoretic mobility measurements (for mono- and tetra- amino acids) were employed in tandem with MD simulations. The ion-specific arginine-sulphate and arginine-guanidinium interactions were proved, both pronounced as the specific decrease or increase in electrophoretic mobility in contrast to observations for lysine, chloride anion, and sodium cation. Cation-specific interaction was found, both experimentally and computationally, to be responsible for specific affecting of the enzymatic activity of HIV-1 protease and LinB enzyme from dehalogenase family. In both cases the general salting out effect was experimentally observed (pronounced as the increase of the enzymatic activity). Finally, the denaturant-specific unfolding pathway of TrpCage minipeptide was identified by comparing the denaturation process in urea and guanidinium chloride solution. In all the studies the aim was to shed more light on complex behaviour caused by ion-specific effects such as ordering in Hofmeister series, speeding up the enzymatic activity, preferential interactions with functional groups or the osmolyte specific denaturation pathways. Keywords: molecular dynamics, proteins, denaturation, salts, osmolytes.

Název práce: Interakce iontů s proteiny Autor: Mgr. et Mgr. Jan Heyda Katedra: Fyzikální a makromolekulární chemie Vedoucí doktorské práce: Prof. Pavel Jungwirth, DSc., E-mail vedoucího: pavel.jungwirth@uochb.cas.cz ÚOCHB AV ČR, v.v.i. Abstrakt: V předkládané práci byly použity metody molekulové dynamiky v kombinaci s pokročilými technikami analýzy k získání detailních informací a pro hlubší pochopení interakcí mezi ionty a proteiny v roztocích. Proto byly zkoumány systémy o různém stupni komplexity, počínaje roztoky molekulárních solí s drobnými fragmenty, podobajícími se funkčním skupinám aminokyselin, jako např. N-methylacetamid reprezentující peptidovou vazbu nebo alkylované amonné kationty. Dále se předmětem našeho studia staly jednotlivé kladně nabité aminokyseliny, u nichž byla popsána silná interakce s malým fluoridovým aniontem, jež je však pro větší halogenidy (Cl, Br, I ) výrazně zeslabena. Toto pozorování bylo prohloubeno objevem vysoké citlivosti fluoridu na rozložení náboje na amonné skupině, bočním řetězci lysinu a N-konci glycinu, zatímco jodid zde vykazoval pouze velice nízkou citlivost. Následně bylo prokázáno, že u krátkých kladně nabitých peptidových úseků v polyargininu a dihistidinu jsou preferované přitažlivé interakce mezi bočními řetězci, naopak v případě polylysinu přítomny nejsou. Na základě existence kvalitativního rozdílu v původu iontově specifických interakcí bylo společně s MD simulacemi provedeno měření elektroforetických pohyblivostí (pro mono- a tetra aminokyseliny). Tímto způsobem byly odhaleny iontově specifické interakce mezi arigininem a sulfátem, a mezi argininem a guanidným kationtem oba efekty se projevily jako charakteristické zvýšení či snížení elektroforetické pohyblivosti ve srovnání s lysinem, chloridovým aniontem a sodíkovým kationtem. Dále bylo experimentálně i výpočetně zjištěno, že enzymatická aktivita HIV- 1 proteázy a enzymu LinB z rodiny dehalogenáz souvisí s kationtově specifickou interakcí, která vysvětluje některé změny v aktivitě. V obou případech byl experimentálně pozorován i efekt vysolování (v podobě zvýšení enzymatické aktivity). V neposlední řadě byly srovnány denaturační procesy probíhající v roztocích močoviny a chloridu guanidného a identifikovány dva různé způsoby rozbalení minipeptidu TrpCage. Ve všech zmíněných studiích bylo snahou více osvětlit komplexní chování výše uvedených systémů, a to zejména objasnit iontově charakteristické jevy, jako např. pořadí v Hofmeisterově řadě iontů, urychlení enzymatické aktivity, favorizované interakce nebo průběh denaturace závislý na daném osmolytu. Klíčová slova: molekulová dynamika, proteiny, denaturace, soli, osmolyty.

1 Abstract in English 5 1 Abstract in English 1.1 Introduction into complex systems Biomolecules are always in contact with solvents and solvents are rarely ionfree. Proteins in salt solutions are examples of complex systems which are arguably the most popular research targets in contemporary computational science [1 4]. The number and quality of publications rise in hand with increasing and persuading evidence of which effects are robust and which are not. In simple systems such as binary or ternary solutions of electrolytes/non-electrolytes it is becoming increasingly difficult to provide so needed novelty for high-quality publications. However, recent achievements appeared even in the field of neat water. The water is alive and challenging as documented by examples, such as Laage [5], who studied water reorientation and hydrogen-bond cleavage, Sedlmeier [6], who critically compared water models with structure factors from neutron scattering experiment, or Dzubiella [7], who introduced a new generation of implicit solvents. In any case once the complex species, either polymer, peptide or even a pair of large spheres, is introduced into the simple solution, the number of study opportunities quickly increases [2,8 10]. Not only the general presence and evidence of an effect, but rather its absolute strength is important. It is typically the detailed balance between competing interactions (i.e. electrostatics vs. solvation) that makes this research relevant for biological systems. Proteins are very individual objects, therefore there are not many generally valid rules. However, the building blocks, twenty amino acids connected by the peptide bonds, are always present. In the crudest approximation we can assign all the relevancy to the functional groups, shown in Figure 1, and neglect everything else. This leads to a study of charged groups (carboxyl, ammonium, imidazolium, guanidinium), polar groups (alcohols, thiols, carboxamide), and also the peptide bond. It is not self evident if this is the correct approach. A breakthrough appeared in 2007, when Auton, Holthauzen and Bolen [11] redid the analysis of the old experimental data from the 1970s. Their study brought a completely new insight into interpretation of protein denaturation and reestab- Figure 1. The functional groups that are supposed to be crucial for local interaction of salts and solvent with proteins and peptides. A charged carboxyl group of aspartate, glutamate and C-terminal (A), ammonium moiety of lysine or N- terminal (B), guanidinium moiety of arginine (C), imidazolium moiety of histidine (D), alcohols and thiols (E), carboxamide group of asparagine and glutamine (E), and the peptide bond (H).

1.2 Aims of the study 6 lished the validity of the so called transfer model [12], which is essentially nothing but the reductionist approach of cutting into pieces. This brought a lot of enthusiasm between theoreticians, as the simplified models are not stand-alone projects any more. 1.2 Aims of the study We would like to deal with the systems in their full complexity, but there is usually no other way to proceed further than to use approximations. Therefore the reductionist approach is often used with advantage and a system is divided into pieces using the best accessible knowledge, or by a methodology that has shown to be recently the most successful and promising. The usual progress towards the understanding of ion-protein interactions would start with ion-ion, ion-amino acid proxy, ion-amino acid, and ion-peptide complexes so as to naturally reach the ion-protein system. Even though the first two steps capture most of the essence, the practical aspects (keeping the bio-track) force us to work in parallel on all fields. We started with ion-protein studies [13, 14] from the very beginning, having in mind that these systems with their wide range of interactions are a challenging task. The effects of sodium and potassium cations were investigated, and following the protocol of Vrbka et al. [2], we quantified the sodium preference when compared to potassium. However, the simulation data provided us with much more. The complexity encountered was another goal of these studies. In this way we faced the upcoming obstacles and learned which effects need to be carefully treated. While the ion-protein projects took long time, putting in front of us new obstacles and challenges, both of the methodological and fundamental origin, it supplied us continuously by new phenomena and effects that were itself of an interest and many smaller projects consequently arose. 1.3 Computational methods 1.3.1 Simulation protocol I focused on extensive direct classical molecular dynamics (MD) calculations, since my projects were quite suited for this technique. Also, in some of my studies the time-evolution was an important aspect [15], or even a key factor if the effect was dynamic [14]. The system for the data-harvesting part of the simulation can be usually prepared in the following way. The salt and water molecules are mixed in amounts so as to reach the desired concentration and so that the simple energy minimization avoids the potential problems of close contacts. We are employing the periodic boundary conditions (PBC): an infinite number of periodic images of the original system are placed in all three dimensions, giving rise to the effectively infinite system (this is the common, but vital trick). System is heated and pressurized to the target temperature and density. One can now insert (expose) any object into the solution, let the system evolve (propagate) in time, visiting relevant configurations and collect the data for the

1.3 Computational methods 7 purpose of the analysis. Some of the analyzing techniques are described in the following section. Note that the atoms inside the system move in time (the time step is usually 1 fs) according to Newtonian equations of motion, interacting with each other via the so called force-field (the effective empirical potential). 1.3.2 Methods of analysis For basic analyses we used the internal module PTRAJ [16]. An important example is the so called radial distribution function (RDF), which expresses the probability of finding two bodies in a given distance. It is the central object in the statistical thermodynamics, directly related to thermodynamics. To understand the ion-specific effects in different contexts we needed methods to be descriptive enough to capture both quantitative and qualitative pictures. These more advanced tools were coded as Python scripts. Two of them, descriptive by their nature the spatial distribution function and the proximal distribution function are briefly described below. The spatial distribution function provides a description of environment around the central particle with three dimensional resolution. Thus for a general (non-spherical) object, it is significantly more descriptive than the conventional one dimensional radial distribution function. An example of distribution of sodium cation and chloride and iodide anions around N- methylacetamide is given in the left side of Figure 3. The proximal distribution function is one dimensional, but unlike RDF (implicitly assuming sphericity) it takes into account the real shape of the central molecule, therefore is suited for descriptions in complex systems. Division of N-methylacetamide in polar peptide bond and hydrophobic methyl groups is depicted in the right side of Figure 3. Finally, for the biomolecule in a salt solution the basic question is: Is the salt attracted, or depleated from the vicinity of the biomolecule? These situations are schematically drawn in Figure 2. For the quantification, the so called preferrential binding parameter, Γ, is introduced (Equation 1). This single number is very powerful as it is directly related to the change of thermodynamic properties of a biomolecule in a given solution. Γ = N vicinity salt N salt bulk N vicinity Nwater bulk water (1) where the Nsalt local, N salt bulk are the number of salt molecules in the vicinity and far from the biomolecule, and the Nwater, local Nwater bulk represent the same for water. The formula simply displays if the salt is more attracted (Γ > 0) or excluded (Γ < 0) from the vicinity of a biomolecule compared to its concentration in solution.

1.4 Results and discussion 8 Figure 2. Competition of water (blue spheres) and cosolvent (yellow ellipses) molecules for the vicinity of the protein (a large gray sphere). The preferential binding of cosolvent (excess of cosolvent, Γ > 0 the left figure), and preferential hydration (depletion of cosolvent, Γ < 0 the right figure). 1.4 Results and discussion This thesis consists of 13 articles in which we have investigated ion-specific effects in solutions. We focus on interactions of ions with peptide and protein surfaces, nevertheless, the objects of our interest range from solutions of molecular salts (i.e., ammonium chloride, or guanidinium sulphate), salts acting on small organic fragments, or amino acids, to the effect on surfaces of peptides and proteins. All these projects have shed more light on the following issues: Understanding of ion-specific effects, and consequent ordering in Hofmeister series [17, 18] for cations, anions, and osmolytes. Interaction of ions with organic molecules and biomolecules. Rationalization of the reductionistic approach and understanding of its limitations. To these points, my contribution, following the complexity of the system, can be divided into three parts: 1. Interaction of ions with model systems. Examples are small molecules that mimic the peptide bond or amino acid side chain. 2. Ion-amino acid interaction, with dominant, but not exclusive, focus on positively charged amino acids. 3. Ion-peptide and ion-protein interaction. This part shows the diversity that is a genuine property of complex systems. It seems to be convenient to illustrate here on the molecule of N-methylacetamide the concepts that were used in our work. Other systems are more difficult to introduce within the limited abstract format. The reader is referred to our publications for more details.

1.4 Results and discussion 9 Figure 3. Spatial distribution (left) of iodide (top, in violet) and chloride (bottom, in gold) anion and sodium cation (green) around N-methylacetamide complemented by partial contributions (of carbonyl (red), amide (blue), and methyl groups (black)) of the proximal distribution function (right). 1.4.1 Case study Model of the peptide bond In our case, the ultimate goal is to understand the interaction between ions and proteins. The composition obviously varies, but the peptide bond is a unique feature that is always present. For that reason we investigated how the sodium/potassium halides solutions affect N-methylacetamide (NMA) i.e., the proxy of the peptide bond. The simple and fairly rigid molecule is shown in the left part of Figure 3. It is the peptide bond to some extent protected on both ends by methyl groups. This model system is worth a deeper exploration mainly due to the recent results of Bolen and Rose [19, 20]. It was shown that the peptide bond is the key player for protein stabilization and denaturation. That is why the deeper knowledge about NMA properties in salt solutions is essential. Owing to the fact that NMA contains a polar part (the peptide bond) and also hydrophobic pieces (methyl groups) we conducted also polarizable simulations [15], which treat more accurately the weak, but important, interaction of anions with hydrophobes. Simulations were analyzed not only in terms of spatial, proximal and standard radial distribution functions, but also the distribution of residence times was estimated together with mean times of interaction that were calculated based on the first order kinetic assumptions. The spatial distribution functions in Figure 3 clearly show that the polar groups are the most prominent sites for both cations (carbonyl oxygen) and anions (amide hydrogen). However, since the accessible volume is rather limited, the corresponding proximal distribution functions carry this preference only for

1.4 Results and discussion 10 cations (height of the peak is roughly 4 for sodium), while being around unity for anions. The second very important observation is the smeared, but in total strong and robust, preference of softer anions for the methyl groups (peaks ranging from 1.5 for chloride to 3 for iodide). This fact leads to an exclusion of fluoride, neutral behaviour of chloride, and to attraction of bromide and iodide to NMA. The results of other projects are briefly summarized in the next sections. All the projects are framed by the concept of ion-specific interactions. 1.4.2 Amino acid proxies Starting with the simpler systems, we were able to interpret and propose a mechanism by which ions affect the peptide bond, finding the strong affinity of cations, but only modest of anions. This effect has direct implications for proteins [15]. To probe the Collins concept of matching water affinities [21] for ammonium cation we employed the combined MC-MD approach [22] and compared with experimental data available (through the activity coefficients of ammonium salts). We observed significantly stronger pairing of ammonium with small halides implying that the ammonium should be considered the small (so called hard) cation, in contrast to the concept of water affinities. We touched the same topic using the neutron scattering experiments linked with MD [23] calculations, where we found that the ammonium and ammonium moieties in lysine and zwitterionic glycine are not equally attractive for fluoride anion. On the contrary, iodide binds similarly in all cases. 1.4.3 Single amino acids and short oligopeptides The positively charged amino acids (monomers) are perfect targets for halide anions. We characterized the organization of small (F ) and large (I ) anions in the vicinity of positivey charged sidechains (arginine, lysine, histidine) [24]. We found not only that smaller anions bind in all cases stronger, but also that the binding strength is sidechain-dependent (arginine histidine lysine). The positively charged amino acids themselves already as dipeptides exhibit a surprising feature. Similarly to a pair of sodium cations one expect the repulsion of two sidechains of the like charge. However, we revealed and quantitatively characterized the origin of like-charge attraction (parallel stacking) in case of two arginines and two histidines [25 27]. This effect does not exist for two lysines. One always asks for a more direct proof of any qualitative effect. To that point, motivated by mounting evidence of specific behaviour of guanidinium (cationcation stacking, strong pairing with sulphate, etc.), we succesfully combined the MD framework with measurements of electrophoretic mobilities of tetra-argine and tetra-lysine [28, 29]. While MD provided the initial motivation and atomistic insight, capillary electrophoresis provided hard experimental data, placing the proposed effects on solid ground. In tandem with surface sensitive experimental techniques (second harmonic generation (SHG) spectroscopy) we explored the ph dependent surface activity of the β-amyloid 1-16 fragment, charge of which varies dramatically from +6 at ph = 3, through +2 at ph = 7 to -6 at ph = 11. The results captured the dominant

1.5 Summary 11 role of total charge and sketched the surface behaviour of positively and negatively charged groups [30]. 1.4.4 Peptides and proteins β-amyloid 1-16 fragment was a 16 amino acid long peptide. However,it does not exhibit features of larger proteins, such as stable secondary structure elements or three dimensional fold. The 20 amino acid long TrpCage minipeptide was designed and synthetized in 2002 so as to mimic the large proteins [31]. While other research groups concentrated on the thermodynamical description of peptide unfolding [32], we focused on the dynamics of peptide denaturation. Two widely used denaturants (urea and guanidinium chloride) were investigated when acting on the TrpCage minipeptide [14]. Two different (denaturantspecific) pathways of unfolding were observed, however, with a similar result i.e., the ensemble of denatured states. The denaturation processes were experimentally characterized by three independent techniques (circular dichroism, differential scanning calorimetry and nuclear magnetic resonance). The different denaturating effect of neighbouring cations in Hofmeister series [18] (tetrapropyl ammonium and guanidinium) was rationalized based on the pair interactions. In this way we took into acount both the ion-specific interactions in salt solution and the ion-specific interaction with the protein surface [33]. The powerful denaturing action of guanidinium can be weakened by an addition of sulphate, which is related to strong cation-anion pairing. In contrast, tetrapropyl ammonium is insensitive to anions, but being unable to create hydrogen bonds it may be a denaturant for one and stabilizer for another protein. The predictions we made in 2009 came true in 2011, when they were experimentally verified [34]. Even though Hofmeister measured the salting out effect of egg white protein [17], the Hofmeister series miraculously appear across fields. Revealing of the effect of salts on enzymatic activity is still far from being reached, nevertheless, we have tried to tackle this problem. The Hofmeister series for cations was tested in two studies employing very relevant enzymes. In the first case, the enzymatic activity assay (within Michaelis- Menten kinetics) of HIV-1 protease was performed in sodium chloride and potassium chloride, observing the activity consistently higher by 20 % in the latter case. MD calculations found generally a twice higher affinity of sodium cation to the enzyme surface, and on top of that, particular spatially resolved maxima around the active site [13]. The second study, which is still under progress, targets the catalytic activity of the LinB dehalogenase, in a large set of salt solutions at various concentrations. From the computational side, we aimed at alkali chloride salts where we found to a large extent direct Hofmeister ordering [18]. 1.5 Summary To summarize, in this thesis I demonstrated the wide range of applications for MD simulations for biologically relevant systems at various level of complexity. The all-atom description allowed to obtain information about ion-specific effects

1.5 Summary 12 in all studied contexts. Due to the fact that proteins are always exposed to solvents and salty solutions this work has potential applications to many different fields, such as biophysics, biochemistry, biology or biotechnology.

2 Autoreferát v českém jazyce 13 2 Autoreferát v českém jazyce 2.1 Úvod do komplexních systémů Biomolekuly lze jen těžko nalézt mimo vodné prostředí a to jen málokdy neobsahuje žádné ionty. Bílkovina ve slané vodě je příkladem tzv. komplexního systému, který bývá asi nejčastějším předmětem výzkumu ve výpočetní komunitě [1 4]. Četnost a kvalita publikací jde ruku v ruce s poznáním, které jevy se ukázaly být významné a které nikoliv. Stává se tak čím dál obtížnější přijít s průlomovým objevem, jenž je jedním z nezbytných předpokladů pro přijetí do vysoce impaktovaných časopisů v oboru roztoků jednoduchých solí a neelektrolytů. Přesto se i v poslední době můžeme setkat se zásadními poznatky i pro tak jednoduchý systém, jakým je čistá voda. Voda je tak stále vděčné téma vyzývající k dalšímu bádání. Např. Laage [5] se zabýval tím, jak při rotacích molekul vody dochází k vzniku a zániku vodíkové vazby, Sedlmeier [6] srovnal výsledky počítačových simulací čisté vody s experimenty neutronového rozptylu, a konečně Dzubiella [7] uvedl nový model pro výpočet implicitní solvatace. Jakmile je sledovaný systém, ať již se jedná o polymer, peptid nebo pouze hydrofobní kouli, umístěn do roztoku, možnosti nových podnětů ke studiu výrazně narostou [2, 8 10]. V poslední době však již nejde pouze o to, zda efekt existuje, ale zejména o sílu tohoto efektu. Většinou je to právě detailní rovnováha mezi soupeřícími interakcemi, která je klíčová v bio-systémech (např. elektrostatická interakce versus hydratační energie). Bílkoviny jsou velmi rozmanité molekuly a z toho důvodu je pro ně težké nalézt obecně platná pravidla. Nicméně základní kameny dvacet aminokyselin, které jsou spojovány peptidovou vazbou jsou vždy přítomné. V nejhrubším přiblížení pak můžeme veškerý význam připsat jejich funkčním skupinám uvedeným na obrázku 4, protože to je to jediné, čím se liší. Vše ostatní zanedbáme. To vede ke studiu nabitých skupin (karboxylová skupina, amonný kation, imidazoliový kation, guanidný kation), polárních skupin (alkoholy, thioly, karboxamidy) a také peptidové vazby. Bohužel nebylo zatím dostatečně prokázáno, zda je takový postup opodstatněný a správný. Obrázek 4. Funkční skupiny aminokyselin, kterým je přisuzován zásadní vliv na lokální interakci s ionty a solventy. Nabitá karboxylová skupina aspartátu, glutámatu a C-konce (A), amonná skupina lysinu, resp. N-konce (B), guanidná skupina z postranního řetězce argininu (C), imidazoliová skupina histidinu (D), alkoholy a thioly (E), karboxamidová skupina asparaginu a glutaminu (E), a peptidová vazba (H).

2.2 Cíle práce 14 Zásadní zvrat nastal v roce 2007, kdy Auton, Holthauzen a Bolen [11] kompletním způsobem zrevidovali experimentální a teoretická data ze 70. let. Jejich práce vnesla zcela nové světlo do popisu denaturace proteinů, čímž znovu objevili a prokázali platnost tzv. transferového modelu [12], který není nic jiného než proces rozdělení proteinu na jednotlivé části. 2.2 Cíle práce Bylo by velice užitečné, kdyby bylo reálné studovat systémy a jejich vzájemné interakce v jejich přirozeném prostředí, ale díky jejich složitosti je to zatím mimo naše možnosti a musíme se proto uchýlit k aproximacím. Nejběžnější je tzv. metoda redukce, kdy se původní systém rozseká na kousky a ty se studují odděleně v rámci nejlepší (a nejslibnější) dostupné teorie. Z tohoto pohledu se jako nejvýhodnější jeví začít simulacemi interakcí iontů mezi sebou, dále iontů a malých organických molekul, a poté iontů a aminokyselin, čímž se konečně dostaneme ke kýženým proteinům. I přesto, že důležité jsou zejména první dva kroky, je z praktických důvodů potřeba postupovat současně na různých úrovních. V našem případě jsme navázali na práci Vrbka et al. [2] a zabývali se vlivem chloridu sodného a draselného na HIV-1 proteázu. Z výpočetního hlediska výsledky potvrdily preferenci sodných kationtů nad draselnými na povrchu HIV-1 proteázy [13]. Podstatné bylo, že jsme se setkávali s dílčími jevy, které je třeba pochopit, abychom mohli plně porozumět problematice proteinů v celé její šíři. Projekty zkoumající proteiny byly dlouhodobého charakteru, neboť před nás opakovaně kladly nové překážky a výzvy (ať fundamentální či technické) [13, 14]. Tím však s sebou přinášely menší projekty, které byly zajímavé per-se. 2.3 Výpočetní metody 2.3.1 Simulační protokol Klasická molekulová dynamika se ukázala jako ideální volba pro studium našich systémů. Často bylo podstatné pouze získat sadu struktur, avšak v některých případech byl důležitý časový vývoj [14, 15]. K tom docházelo tehdy, když byla studována přímo dynamika daného děje. Na začátku každého projektu stojí příprava systému. Pokusím se nastínit důležité kroky. Nejprve se molekuly vody a soli náhodně smísí v poměru, který odpovídá cílové koncentraci. Následně provedeme krátkou minimalizaci energie systému, jež nás zbaví nežádoucích artefaktů (např. náhodného překryvu dvou atomů apod.). Prakticky vždy používáme v simulaci periodické okrajové podmínky, tj. rozmnožíme náš systém ve všech rozměrech, čímž dostaneme nekonečný systém. Jde o důležitý a běžně používaný trik, jak ze systému o cca 1000 atomech udělat obrovský systém, kde již beze zbytku platí zákony statistiky. Na závěr systém zahřejeme a stlačíme, aby měl požadovanou hustotu a teplotu. Pokud chceme studovat chování molekuly vystavené účinkům slaného roztoku, vložíme ji do připraveného systému a necháme ho vyvíjet v čase, čímž prozkoumáme zejména relevantní (ale do jisté míry i jiné málo pravděpodobné)

2.4 Výsledky a diskuse 15 stavy systému. Ty vytvoří statistický soubor, který můžeme následně analyzovat, například metodami popsanými v následující kapitole. Je třeba ještě podotknout, že časový krok používaný v simulacích je velmi krátký typicky 1 fs a veškerý pohyb je řízen Newtonovými rovnicemi. Jednotlivé částice na sebe působí tzv. silovým polem, což je předem stanovený efektivní potenciál (sada interakčních parametrů). 2.3.2 Druhy analýzy Pro rutinní analýzy jsme používali volně dostupný modul PTRAJ [16]. Důležitým příkladem je tzv. radiální distribuční funkce (RDF), která vyjadřuje pravděpodobnost nalezení dvou objektů (například kationtu a aniontu) v dané vzdálenosti. Její zásadní význam pramení ze skutečnosti, že se jedná o ústřední veličinu ve statistické termodynamice, přímo související s termodynamikou systému. Abychom porozuměli iontově specifickým interakcím, potřebujeme mít k dispozici typy analýzy, které jsou dostatečně popisné a zároveň i kvantitativní. Tyto pokročilejší, méně obvyklé metody byly implementovány v programovacím jazyku Python. Dvě z nich, mapa pravděpodobnosti a tzv. proximální distribuční funkce, jsou popsány níže. Mapa pravděpodobnosti poskytuje prostorové rozložení jednoho typu částic kolem druhého umístěného ve středu. Pro nesférické molekuly tak nese výrazně více informace než klasicky používaná RDF. Příklad jejího použití je v levé části obrázku 6. Proximální distribuční funkce je významově podobná RDF, ale na rozdíl od ní bere do úvahy i tvar molekuly (proximální, tj. nejblíže umístěný), kolem které je distribuční funkce počítána. Příklad jejího použití je znázorněn v pravé části obrázku 6. Ústřední otázkou, kterou si klademe při studiu biomolekul v roztocích je, zda je v její blízkosti složení roztoku odlišné čistého roztoku. Na obrázku 5 jsou pro ilustraci zobrazeny tyto dvě krajní možnosti. Pro kvantifikaci tohoto efektu je zaveden tzv. preferenční vazebný parametr Γ (rovnice 2), Γ = N vicinity salt N salt bulk N vicinity Nwater bulk water (2) kde Nsall local, Nsalt bulk vyjadřuje počet molekul soli (kosolventu) v blízkosti a daleko od biomolekuly, a Nwater, local Nwater bulk má stejný význam, avšak pro vodu (obecněji solvent). Hodnota parametru má přímočarý význam; zda se sůl vyskytuje více (Γ > 0), nebo méně (Γ < 0) v blízkosti biomolekuly, než odpovídá situaci daleko v roztoku. 2.4 Výsledky a diskuse Tato doktorská práce sestává z 13 článků v impaktovaných časopisech, v nichž jsme studovali iontově specifické efekty v nejrůznějších prostředích. Začali jsme

2.4 Výsledky a diskuse 16 Obrázek 5. Kompetice molekul solventu (např. vody; červené kroužky) a kosolventu (např. soli; žluté elipsy) o okolí proteinu (velký šedý kruh). Nadbytek kosolventu (Γ > 0 vlevo) a nadbytek molekul solventu (vyloučení kosolventu, Γ < 0 vpravo). roztoky molekulárních solí (jako například chloridem amonným nebo guanidným), pokračovali simulacemi aminokyselin vystavených slaným roztokům, abychom se nakonec zaměřili na povrchy peptidů a proteinů. Všechny projekty měly přispět k hlubšímu porozumění následujících bodů: Iontově specifické efekty a jejich projev v Hofmeisterových řadách [17, 18] kationtů, aniontů a osmolytů. Interakce iontů a organických molekul a biomolekul. Racionalizace metody redukce a stanovení hranic její platnosti. Můj příspěvek lze rozdělit do následujících tří kapitol podle jejich rostoucí složitosti: 1. Interakce iontů v modelových systémech. Příkladem budiž molekula napodobující peptidovou vazbu nebo postranní řetezec aminokyseliny. 2. Interakce iontů s aminokyselinami, zejména pak kladně nabitými. 3. Interakce iontů a bílkovin. Tato část ukazuje velkou rozmanitost, která je vlastní právě komplexním systémům. Na molekule N-metylacetamidu je vhodné ukázat, jaké postupy jsme obvykle používali při naší práci. Ostatní projekty jsou svou povahou komplikovanější na stručné shrnutí, proto odkazuji laskavého čtenáře na naše publikace, kde může nalézt všechny detaily. 2.4.1 Příklad studie modelu peptidové vazby Naším cílem je porozumět interakcí mezi ionty a proteiny. Zamyslíme-li se nad tím, co je to protein, zjistíme, že zatímco složením (tj. počty různých aminokyselin v sekvenci) se jednotlivé proteiny mezi sebou liší, peptidová vazba je unikátní prvek, který je vždy přítomný (právě jednou za každou aminokyselinu). Proto jsme studovali, jak sodné a draselné soli halogenidů budou ovlivňovat N-metylacetamid (NMA), molekulu mající charakter peptidové vazby. Tato poměrně

2.4 Výsledky a diskuse 17 Obrázek 6. Mapa pravděpodobnosti (vlevo) jodidových (nahoře, ve fialové barvě) a chloridových aniontů (dole, zlatou barvou) a sodných kationtů (zelenou barvou) kolem molekuly N-metylacetamidu vyjádřena komplementárně třemi příspěvky proximální distribuční funkce (vpravo; karbonylové skupiny (v červené barvě), amidové skupiny (v modré barvě) a metylové skupiny (v černé barvě)). rigidní molekula s jednoduchou strukturou, zobrazena v levé části obrázku 6, je v podstatě peptidovou vazbou metylovanou na obou stranách. Systém si zaslouží bližší pozornost také proto, že nedávné výsledky Bolena a Rose [19, 20] silně naznačují, že peptidová vazba je klíčovým elementem pro stabilitu a denaturaci. I proto je poznání vlastností NMA v roztocích solí tak důležitá. Jelikož NMA nese kromě polární peptidové vazby i hydrofóbní metylové skupiny, bylo třeba do našich výpočtů zahrnout polarizovatelnost vody a aniontů. Jenom tak bylo možné správně vyhodnotit sílu interakce aniontů s hydrofóbními skupinami. Data získaná ze simulací byla zpracována pomocí map pravděpodobnosti, proximálních distribučních funkcí a klasických RDF (tj. analýza, kde čas není důležitý). Dále jsme charakterizovali délku těchto kontaktů za předpokladu, že ionty se k peptidové vazbě vážou kinetikou prvního řádu (tj. explicitní čas je zde důležitý). Mapy pravděpodobnosti na obrázku 6 zcela jasně ukazují, že nejpravděpodobnější pozice v okolí molekuly NMA jsou pro kationty v blízkosti karbonylového kyslíku (který nese parciální záporný náboj) a pro anionty u vodíku (parciální kladný náboj) amidové skupiny. Druhou neméně důležitou skutečností je, že prostor, který přísluší těmto energeticky výhodným lokacím, je prostorově vymezený, zejména pak pro anionty. Proto při přechodu k proximální distribuční funkci vidíme (vpravo), že relativně vysoký pík má pouze sodný kation (cca o výšce 4), nikoliv tak anionty (kolem 1). Třetím faktem je, že anionty (na rozdíl od kationtů)

2.4 Výsledky a diskuse 18 vykazují afinitu k metylovým skupinám, kde křivka dosahuje hodnoty cca 1.5 pro chloridový a více než 3 pro jodidový aniont. Výsledky ostatních projektů jsou shrnuty v další kapitole. Můžeme v nich najít jednoho společného jmenovatele iontově specifické interakce. 2.4.2 Modely funkčních skupin V předchozí kapitole jsme začali jednoduchou molekulou, na níž jsme dokázali předpovědět a interpretovat sílu a mechanismus interakce, kterým budou ionty působit na peptidovou vazbu. Tato pozorování mají přímé důsledky pro vlastnosti bílkovin ve slaných roztocích [15]. Abychom ověřili koncept matching water affinities předpovězený Collinsem [21], detailně jsme kombinací molekulové dynamiky a metody Monte Carlo prozkoumali vazebné preference amonného kationtu, když se nachází v roztoku s halogenidovými anionty [22]. Výsledky jasně ukázaly, že amonný kation preferuje malé anionty před většími, a je tudíž tzv. malým (nebo též tvrdým) kationtem. Takový výsledek je v rozporu s konceptem matching water affinities, ale je plně v souladu s naměřenými aktivitními koeficienty. Toto téma jsme studovali také v kombinaci neutronového rozptylu a MD simulací [23]. Výsledky pregnantně ukazují, že amonný kation a amonné skupiny lysinu a glycinu nejsou k fluoridovému aniontu přitahovány se stejnou intenzitou. Naopak jodid se váže podobně ve všech případech. 2.4.3 Jednotlivé aminokyseliny a krátké oligopeptidy Kladně nabité aminokyseliny (v podobě monomerů) představují pro halogenidové anionty ideální terč [24]. Charakterizovali jsme uspořádání malých fluoridových a velkých jodidových aniontů v okolí kladně nabitých bočních řetězců (argininu, lysinu, histidinu). Menší anionty se vážou silněji ve všech případech a navíc se ukázalo, že vazebná síla je závislá na typu bočního řetězce. Kladně nabité aminokyseliny samy o sobě vykazují zajímavou vlastnost. Stejně jako je samozřejmé, že se odpuzují dva sodné kationty, je stejně tak překvapivé, že dva shodně nabité postranní řetězce argininu, nebo histidinu se přitahují a tvoří paralelní stack. [25 27] Naproti tomu postranní řetězce lysinu se chovají řádně a odpuzují se. Pro každý kvalitativní jev, který je svým způsobem neobvyklý, je vhodné najít experiment, jenž jej dokáže i kvantifikovat. V našem případě se ukázalo efektivní použití měření elektroforetické mobility pro peptidy tetraarginin a tetralysin [28, 29] v přítomnosti solí obsahující jedno- a dvoumocné anionty. Zatímco MD přispěla k motivaci výzkumu a poskytla vhled na atomární úrovni, kapilární elektroforéza naměřila potřebná experimentální data a přeměnila efekty z hypotetických na reálné. Spolu s povrchově citlivou spektroskopickou metodou (generování druhé harmonické frekvence (SHG)) jsme prozkoumali závislost povrchové aktivity β-amyloid 1-16 fragmentu na ph. β-amyloid 1-16 fragment má mnoho titrovatelných skupin, a proto se jeho náboj v kyselém (+6), bazickém (-6) a neutrálním (+2) ph velmi liší. Molekulová dynamika správně zachytila dominantní roli celkového

2.5 Závěr 19 náboje a nastínila možné důvody pro pozorované rozdíly v kyselém a bazickém ph [30]. 2.4.4 Peptidy a proteiny β-amyloid 1-16 fragment má 16 aminokyselin, přesto nevykazuje chování větších proteinů, např. nenajdeme u něj stabilní sekundární strukturní prvky nebo balení do dominantní terciální struktury. Oproti tomu v roce 2002 uměle navržený 20 aminokyselinový TrpCage minipetid všechny tyto rysy nese [31]. Zatímco ostatní vědecké týmy se zaměřily na popis termodynamických vlastností jeho sbalení a rozbalení [32], my jsme si dali za cíl charakterizovat proces denaturace. Účinek dvou nejběžnějších denaturantů (močoviny a chloridu guanidného) byl zkoumán na minipeptidu TrpCage [14]. Překvapivě jsme zjistili, že průběh denaturace je závislý na denaturantu, nikoliv však výsledný efekt, který je stejný TrpCage minipeptid v rozbaleném, denaturovaném stavu. Denaturace minipeptidu byla nezávisle proměřena třemi separátními technikami (cirkulárním dichroismem, kalorimetricky a pomocí nukleární magnetické rezonance). V následující studii jsme se zaměřili na sousedy v Hofmeisterově řadě kationtů [18] tetrapropylamonium a guanidinium. K vysvětlení efektů jsme použili všechny dosud známé efektivní párové interakce, které vykazují specificitu jak mezi samotnými ionty v roztoku, tak i mezi ionty a povrchem proteinu [33]. Jedině v důsledku silného kation-aniontového párování může být vysvětleno, proč se z velmi silného denaturantu, kterým je chlorid guanidný, stane průměrný denaturant síranu guanidného. Naopak tetrapropyl amonium není vůbec citlivé na druh aniontu, s nímž se nachází v roztoku, zároveň ale vzhledem k absenci možnosti tvorby vodíkových vazeb může být pro jeden typ proteinů velmi silným denaturantem a pro druhé slabě stabilizujícím osmolytem. Konečně naše předpovědi z roku 2009 se vyplnily po provedení experimentů v roce 2011 [34]. Přestože Hofmeister v roce 1888 seřadil soli podle jejich schopnosti vysolovat vaječný bílek [17] z roztoku, objevují se Hofmeisterovy řady jako zázrakem napříč různými obory. Porozumět tomu, proč některé soli zvyšují enzymatickou aktivitu, je běh na dlouhou trať, ale i tak se musí podstoupit. Hofmeisterova řada pro kationty byla testována ve dvou studiích zabývajících se vybranými enzymy. V první z nich byl proveden rozbor enzymatické aktivity (s použitím kinetiky Michaelis-Mentenové) HIV-1 proteázy v chloridu sodném a draselném, který v případě KCl roztoku vedl k objevu o 20% vyšší aktivity než u NaCl. MD simulace poskytovaly obecně dvojnásobnou afinitu sodného kationtu k povrchu enzymu a nadto ukazovaly na prostorově rozlišená maxima v okolí aktivního místa. Druhá studie, jež je zatím ve fázi příprav, má za cíl poznání charakteru katalytické aktivity LinB dehalogenázy pro sadu roztoků solí o různých koncentracích. Z výpočetního hlediska jsme se zaměřili na chloridy alkalických kovů, u kterých jsme do značné míry pozorovali Hofmeisterovo uspořádání [18]. 2.5 Závěr Závěrem bych uvedl, že v předkládané dizertační práci bylo prezentováno široké spektrum aplikací molekulově dynamických simulací, a to zejména pro

2.5 Závěr 20 biologicky relevantní systémy s různým stupněm komplexity. Popis na úrovni jednotlivých atomů a molekul nám umožnil získat poznatky o iontově specifických efektech ve všech studovaných kontextech. Díky skutečnosti, že proteiny jsou ve svém přirozeném prostředí vždy vystaveny působení solventů a roztoků solí, má tato práce potenciální využití v mnoha vědních oborech, jako např. v biofyzice, biochemii, biologii nebo biotechnologii.