SOMATICKÉ BU KY V MLÉCE

SOMATICKÉ BU KY V MLÉCE Mléko v období laktace, sekrety mlé né žlázy v období kolostrogeneze, v kolostrálním období a v období aktivní involuce, jakož i tekutina obsažená v dutinovém systému juvenilní mlé né žlázy a mlé né žlázy v období trvalé involuce obsahují bu ky. Paape se spolupracovníky v r. 1963 pro n zavedl ozna ení somatické bu ky. Tento pojem dosáhl širokého uplatn ní: Po et somatických bun k ve tvr ovém vzorku z prvních st ik je spolu s nálezem bakteriologického vyšet ení prost edkem diagnostické klasifikace mastitid. Po et somatických bun k v individuálním vzorku krav (v konvovém vzorku) je prost edkem operativního ízení chovatelských a veterinárních inností v jednotlivých stádech a také prost edkem šlechtitelské prevence mastitid. Po et somatických bun k v bazénovém vzorku je významným jakostním znakem syrového mléka. Somatické bu ky v mléce jsou p evážn bu kami bílé krevní ady. Jsou to: makrofágy (mononukleární fagocyty, kolostrální t líska, p nové bu ky) neutrofilní granulocyty (polymorfonukleární fagocyty, polymorfonukleáry, neutrofily) lymfocyty V menším zastoupení to jsou epiteliální bu ky, eozinofily, bazofily, erytrocyty, histiocyty, plazmatické bu ky, žírné bu ky. Názory na podíl epiteliálních bun k v mléce se r zní. N kte í auto i udávají až 16 % (Miller et al., 1991; Paape, 2003), jiní pouhá 2 % (Lee et al.,1980). Faktory ovliv ující po et somatických bun k Po et somatických bun k v jednotlivých druzích vzork mléka je odlišný. Paape a Tucker v r. 1966 totiž prokázali, že se po et bun k ve frak ních vzorcích mléka odebraných v pr b hu dojení významn liší. V prvních st icích mléka je vyšší, aby následn poklesl a v dodojkové porci a v reziduálním mléce výrazn vzrostl. U sm sných vzork se velmi výrazn uplat uje edící fenomén. Proto nem že existovat jedna obecn platná limitní hodnota po tu pro rozlišení normálního sekretu, nýbrž existují r zné limity p íslušné druhu vzorku mléka. Rozlišujeme: tvr ový vzorek (QMS = quarter milk sample): o Vzorek z prvních st ik mléka (FQMS = Foremilk quarte milk sample); o Sm sný tvr ový vzorek (QCMS = Quarter composite milk sample) Individuální vzorek (konvový vzorek ; ICMS = Individual couws milk sample) Bazénový vzorek mléka (BTMS = Bulk tank milk sample). Nejvýznamn jším initelem ovliv ujícím celkový i diferenciální po et somatických bun k je zán tlivý proces, p i kterém vzr stá po et somatických bun k ve tvr ovém vzorku až o n kolik ád (z 10 4 na 10 7 ). Za limitní hodnotu pro rozlišení zán tlivého sekretu se považovalo u krav 250. 10 3. ml -1, u jalovic 150. 10 3. ml -1 ve tvr ovém vzorku z prvních st ik mléka (IDF, 1987). V sou asnosti se za limitní hodnotu po tu somatických bun k ve tvr ovém vzorku považuje 100. 10 3. ml -1 (Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft, 1994; Hamann, 2003). V diferenciálním po tu vzr stá p i akutním zán tu zastoupení polymorfonukleárních leukocyt, které m že dosáhnout 90 i více %. Chronický zán t je provázen vyšším zastoupením makrofág a lymfocyt, avšak polymorfonukleární leukocyty z stávají dominantními. Celkový po et somatických bun k je ovlivn n i patogenním agens a jeho patogenitou. 1

Celkový po et somatických bun k a patogenní agens Patogen Aritmetický pr m r [. 10 3. ml -1 ] Geometrický pr m r [. 10 3. ml -1 ] Staphylococcus aureus 1616 449 Streptococcus agalactiae 1965 793 Streptococcus dysgalactiae 1358 477 Streptococcus uberis 1125 578 Enterococcus spp. 591 239 negativní 494 174 Tolle, 1975 Celkový i diferenciální po et somatických bun k je rozdílný v jednotlivých funk ních obdobích mlé né žlázy. Celkový a diferenciální po et somatických bun k ve funk ních obdobích mlé né žlázy Období Celkový po et Makrofágy Neutrofily Lymfocyty [. 10 3. ml -1 ] [%] [%] [%] laktace 200 60 12 28 kolostrální 280 37 37 26 aktivní involuce 18000 43 19 38 Concha, C., 1986 Celkový po et somatických bun k ovliv uje celá ada dalších faktor, n které z nich jsou jen potenciálním rizikem zvýšení po tu somatických bun k: Anamnéza mlé né žlázy. Po et somatických bun k z stává zvýšen u tvrtí, které mají ve své anamnéze prod lanou mastitidu, by infek ní agens bylo lé ebn nebo spontánn eliminováno. N kdy se uvádí, že zvýšení po tu bun k trvá do konce laktace a s novou laktací se stav normalizuje. Opakovan lé ené tvrt z stávají trvale postiženy. Tato okolnost souvisí s dalším faktorem ovliv ujícím po et somatických bun k. V k - po adí laktace. Byl zaznamená významný vzestup lakta ních pr m r po tu somatických bun k od první do desáté laktace, a to i u krav, které v den vzorkování byly prosté infekce. Lze ovšem p edpokládat, že mimo termín vyšet ení tato zví ata prod lala subklinické mastitidy. U dojnic v desáté a vyšších laktacích po et somatických bun k klesá, což se vysv tluje tím, že tak vysokého v ku se dožívají pouze zví ata zvlášt odolná v i infekci a zran ním mlé ných žláz. Plemenná p íslušnost. Uvádí se, že horská plemena mají o 50 000 až 100 000 bun k v mililitru mléka nižší po et somatických bun k, než plemena nížinná. Ne vždy se tento rozdíl poda ilo prokázat. Rozdíl v po tu somatických bun k mezi plemeny byl nap. zaznamenán jen ve vzorcích z infikovaných mlé ných žláz. 2

Lakta ní pr m ry po tu somatických bun k podle plemen (individuální vzorky mléka zdravých dojnic) Plemeno Aritmetický pr m r Geometrický pr m r [. 10 3. ml -1 ] [. 10 3. ml -1 ] Holštýnské 177,56 121,26 Ayrshirské 154,99 98,53 Jerseyské 163,56 119,06 Švýcarské hn dé 121,78 89,72 Tvarové vlastnosti vemen. Prokazateln vyšší po et somatických bun k byl zaznamenán u dojnic s p íliš hlubokými vemeny (s distancí hrot struk od podlahy pod 400 mm). Dojitelnost. Vyšší po et somatických bun k mléka byl pozorován u lehce dojitelných krav oproti kravám s normální nebo pomalou intenzitou dojení. Stadium laktace. Po et somatických bun k je zvýšen na za átku laktace, po 5 až 14 dn. K podstatnému zvýšení dochází na konci laktace. Z eteln je to možné pozorovat, když se mléko za íná m nit ve starodojný sekret, p i poklesu denního výdojku pod 4 kg mléka. Frakce výdojku. V prvních st icích mléka a obzvlášt pak v dodojkové porci je po et somatických bun k vyšší než v hlavním výdojku. Vysoký po et p etrvává 4 až 5 hodin po dojení. Tento fakt má zásadní význam pro standardizaci stanovení po tu somatických bun k. Podle doporu ení Mezinárodní mléka ské federace (Bulletin 211, 1987) se mají k vyšet ení používat tvr ové vzorky odebrané na za átku regulérního dojení po odstran ní 10 až 20 ml prvních st ik mléka. Frekvence dojení. Po et somatických bun k se zvyšuje p i zm n frekvence dojení za dvou na jedno denn. Proto se doporu uje p i postupném zp sobu zaprahování vylou it z dodávky k mlékárenskému zpracování sekret po zm n frekvence dojení. Denní variabilita. Vyšší po et somatických bun k byl zaznamenám p i ve erní dojení oproti rannímu. N kte í auto i uvád jí, že to platí pouze pro sekrety infikovaných mlé ných žláz. Ro ní sezónnost. Minimum zaznamenáváme v m sících prosinci až b eznu, pak následuje vzestup s maximy v kv tnu až íjnu a op t pokles k ro nímu minimu. Krmení. Zvýšení po tu somatických bun k zaznamenáváme p i p echodu ze zimního na letní typ krmné dávky. Za átek pastevního období je rovn ž provázen zvýšením po tu somatických bun k. Dyspepsie a pr jmová onemocn ní zp sobovaná zkrmováním zdravotn závadných statkových krmiv jsou další p í inou zvýšení po tu somatických bun k. Metabolická onemocn ní. Zvýšení po tu somatických bun k provází zejména onemocn ní chronickou acidózou a subklinickou ketózou. P i akutní acidóze a bachorové alkalóze byla zaznamenána vyšší etnost výskytu klinických mastitid. Stres. Manipula ní i sociální stres zp sobují zvýšení po tu somatických bun k. Manipula ní stres provází hromadné zákroky, jako jsou vakcinace, odb ry krve, úprava pazneht a další. Sociální stres se dostavuje p i obnovování sociální hierarchie stáda nebo produk ní skupiny po zm n jejich složení. Nebyl prokázán vliv krátkodobého teplotního stresu na po et somatických bun k.v kontrolovaných pokusech, v klimatických komorách. P i dlouhodobém vystavení dojnic 3

klimaticky vysokým teplotám, ochlazování zví at vedlo ke snížení po tu somatických bun k mléka. Dojicí stroj a technika dojení. Po et somatických bun k ovliv uje sám typ dojicího stroje. Záporný vliv byl zaznamenán p i dojení potrubními dojicími stroji ve stáji, p íznivý vliv, p i dojení v dojírnách. Byl prokázán vyšší po et somatických bun k v bazénových vzorcích mléka stád dojených dojicím stroji s nízkou zálohou výkonnosti výv vy. Proto se zd raz uje pozitivní význam soustavné pé e o funk ní stav dojicích za ízení. Zp sob p ípravy dojnic k dojení hraje rovn ž významnou roli. Po et somatických bun k p ízniv ovliv uje používání individuálních ut rek. Nep íznivý vliv byl zaznamenán p i toalet sprchováním vemen. Velmi p íznivý efekt má dezinfekce struk po dojení. P edojování m lo v n kterých pozorováních záporný vliv. Ustájení na vazných, extrémn krátkých stáních (pod 1400 mm), p íliš dlouhých stáních (nad 1900 mm) a na p íliš širokých stáních (nad 1200 mm) prokazateln zvyšovalo po et somatických bun k mléka. Ve volných typech ustájení má p íznivý vliv ustájení se slamnatou úspornou podestýlkou. Záporný vliv byl zaznamenán v bezstelivových ustájeních s tvrdým povrchem lehacích box a v systémech s úspornou podestýlkou. Dlouhodobá variabilita. Všechny uvedené vlivy se uplat ují jako zdroje prom nlivosti po tu somatických bun k jedné dojnice b hem laktace. Prom nlivost vyjád ená koeficientem variability se pohybuje pro individuální vzorky krávy od 59 do 301 %. Prom nlivost po tu somatických bun k bazénových vzork mléka je menší, nicmén u vzork odebíraných v m sí ních intervalech se pohybuje od 4 do 46 %. Z uvedeného vyplývá, že rozhodování na základ jednoho stanovení po tu somatických bun k by bylo zatíženo chybou náhodných odchylek. Proto v systémech sledování jakostních znak syrového mléka bylo zavedeno používání klouzavých geometrických pr m r (obvykle ze 6 stanovení za poslední 3 m síce). Estrus. U krav nebyl prokázán vliv íje, ani podávání estrogenních hormon na po et somatických bun k mléka. V pokusech s kozami estrus signifikantn zvyšoval po et bun k. Zaprahování je provázeno vzestupem po tu somatických bun k. Proto b hem postupného zaprahování je nutné vylou it sekret mlé né žlázy z dodávky k mlékárenskému zpracování. Po et somatických bun k v individuálních vzorcích mléka Individuální vzorky mléka krav (konvové vzorky) jsou využívány plemená skými organizacemi ke stanovení látkového složení mléka p i kontrole užitkovosti již mnoho let. Od p elomu sedmdesátých a osmdesátých let se vyvíjí snaha použít tyto vzorky i ke stanovení po tu somatických bun k a takto získané údaje k rozlišení krav s infekcí mlé né žlázy. Po ty somatických bun k bývají k tomuto ú elu vyjad ovány v logaritmické transformaci (log 2 ). Tomuto parametru bylo p i azeno bodové hodnocení, které se ozna uje skóre po tu somatických bun k (somatic cell score, SCS). D vodem pro tuto transformaci je to, že lépe odráží bakteriologický nález hlavních patogen mlé né žlázy, než prosté hodnoty po tu somatických bun k. 4

SCS se vypo ítá podle vztahu: SCC SCS = log 2 ( ) + 3 100 000 SCS = somatic cell score = skóre po tu somatických bun k; SCC = somatic cell count = po et somatických bun k v 1 ml Následující tabulka udává hodnoty SCS v konfrontaci s prostým po tem somatických bun k (SCC) a p edpokládanou ztrátou produkce mléka. Skóre a celkový po et somatických bun k v individuálních vzorcích mléka SCS SCC [.10 3. ml -1 ] St ední hodnota SCC [.10 3. ml -1 ] Rozmezí Pokles produkce mléka [kg/305 dní] 1. laktace 2. laktace NMC, 2004; 0 12,5 0-17 - - 1 25 18-34 - - 2 50 35-70 - - 3 100 72-140 90,6 181,3 4 200 141-282 181,3 362,6 5 400 283-565 272,0 543,9 6 800 566-1130 362,6 653,2 7 1600 1131-2262 453,3 906,6 8 3200 2263-4525 - - 9 6400 4526- - - SCS = somatic cell score = skóre po tu somatických bun k; SCC = somatic cell count = po et somatických bun k v 1 ml Za limitní hodnotu pro rozlišení suspektn infikovaných dojnic se považuje po et bun k 200.10 3.ml -1, t.j. SCS 4. Bylo zjišt no, že však jedno vyšet ení neposkytuje dostate n p esnou informaci. Nicmén se udává, že z dojnic vykazujících SCS 5 a více, je 80 % infikovaných. Pokud hodnota SCS u p íslušné dojnice stoupá, lze p edpokládat, že vzr stá i po et infikovaných mlé ných žláz. Vzr st po tu dojnic s p ekro eným limitem SCS sv d í o vzr stu podílu infikovaných dojnic ve stád. Pro prvotelky platí limitní hodnota SCS 3, tedy po et bun k 100.10 3.ml -1. Signálem pro nezbytnost zlepšení programu tlumení mastitid je p ekro ení limitní hodnoty SCS u 25 % krav, respektive prvotelek ve stád. 5

Pro hodnocení zdravotního profilu mlé ných žláz dojnic za celou laktaci se skóre somatických bun k vyjad uje jako lakta ní skóre (LSCS), tedy aritmetický pr m r SCS za celou laktaci. Tyto diagnostické znaky se staly v USA základem systému Dairy Herd Improvement, tedy programu zlepšování mlé ných stád. Obdobný systém byl uplatn n i v ad dalších zemí (skandinávské zem, Francie, Estonsko). Následující tabulka uvádí zp soby využití po tu somatických bun k v individuálních vzorcích mléka farmá i v USA. Využití údaj o po tu somatických bun k v individuálních vzorcích farmá i Zp sob využití / P enos dat Po et farem % Identifikace infikovaných krav 158 21,0 Hodnocení ú innosti terapie 135 17,8 Výb r krav k brakaci 121 15,8 Výb r krav k bakteriologickému vyšet ení 89 11,7 Výb r krav k lé ení 81 10,6 Výb r krav k vylou ení mléka z dodávky do mlékárny 66 8,7 Výb r krav k p ed asnému zaprahnutí 49 6,4 Výb r krav ke zm n po adí dojení 45 5,9 Výb r krav k selektivní terapii v zaprahlosti 16 2,1 Následující graf p edstavuje distribuci etnosti stád podle t íd po tu somatických bun k v individuálních vzorcích mléka (IDF, 1997 ). 6

Po et somatických bun k v bazénových vzorcích mléka P vodn byl tento ukazatel považován v našich podmínkách, tak jako je tomu dosud v zahrani í, za parametr odrážející zdravotní stav mlé ných žláz dojnic ve stád. V sou asné dob však již v našich chovech tento parametr zdravotní stav dojnic neodráží, nebo se obecn rozší il postup vyt i ování sekret s vysokým obsahem somatických bun k za cenu výrazného snížení tržnosti syrového mléka. Po et somatických bun k v bazénových vzorcích mléka je významným jakostním znakem syrového mléka. Vyhodnocuje se výpo tem klouzavého geometrického pr m ru podle vztahu: n x g = x 1.x 2..... x n kde x 1...x n jsou prosté hodnoty po tu somatických bun k v jednotlivých odb rech n je po et hodnot zahrnutých do výpo tu Obvykle se geometrický pr m r po tu somatických bun k po ítá ze 6 stanovení v posledních t ech m sících. Závazná limitní hodnota [400. 10 3. ml -1 ], jakož i zp sob jejího stanovení vyplývá z legislativy Evropské unie (COMMISSION REGULATION (EC) No 1662/2006): 3. (a) (i) Syrové kravské mléko: Kritéria pro syrové mléko Celkový po et mikroorganism 30 o C (v ml) 100 000 (*) Po et somatických bun k (v ml) 400 000 (**) (*) Klouzavý geometrický pr m r za období dvou m síc s nejmén 2 vzorky za m síc; (**) Klouzavý geometrický pr m r za období t í m síc s nejmén 1 vzorkem za m síc pokud kompetentní autorita nestanoví jiný metodický postup se z etelem na sezónní prom nlivost produkce. (ii) Syrové mléko jiných druh : Celkový po et mikroorganism 30 o C (v ml) 1 500 000 (*) (b) Pokud je toto mléko ur eno pro výrobu produkt ze syrového mléka: Celkový po et mikroorganism 30 o C (v ml) 500 000 (*) (*) Klouzavý geometrický pr m r za období dvou m síc s nejmén 2 vzorky za m síc. 4. S p ihlédnutím k Sm rnici 96/23/EC producenti a prodejci musí zajistit, aby syrové mléko nebylo obchodováno pokud: (a) obsahuje rezidua antibiotik a jiných látek uvád ných v Dodatku I a III (EEC) No 2377/90 (1), nebo Na ízení 7

(b) pokud celková rezidua antibiotických látek p ekra ují maximální povolené limity. 5. Jestliže syrové mléko nespl uje uvedená ustanovení, obchodující s mlékem musí informovat kompetentní autoritu a p ijmout opat ení k náprav. Následující graf demonstruje distribuci etnosti stád podle t íd po tu somatických bun k v bazénových vzorcích mléka (IDF, 1997). Graf vyzna uje nejen celostátní geometrický pr m r a aritmetický pr m r, nýbrž i aritmetický pr m r geometrických pr m r, tedy parametr, který se v souladu s doporu ením Mezinárodní mléka ské federace používá k mezinárodním statistickým analýzám. Po et somatických bun k v bazénových vzorcích mléka je významným jakostním znakem syrového mléka proto, že nep ímo odráží funk ní zp sobilost mlé ných žláz dojnic k produkci mléka k lidské výživ. S r stem po tu somatických bun k v syrovém mléce dochází k významným zm nám smyslových vlastností, chemického složení a fyzikálních vlastností mléka. Tím je narušena technologická zpracovatelnost syrového mléka (viz samostatná p ednáška). Doporu ení pro prezentaci hodnot po tu somatických bun k Jak vyplývá z p edešlých graf zobrazujících distribuci etnosti podle t íd po tu somatických bun k, je rozložení tohoto parametru pravostrann vychýlené, tedy nemá normální Gaussovo rozložení. To p ináší komplikace p i statistickém zpracování t chto dat, jakožto i p i vývoji algoritm zpracování t chto dat k operativnímu ízení. Proto Mezinárodní mléka ská federace (IDF, 1997) doporu uje logaritmickou transformaci t chto dat, nebo ta vykazuje normální rozložení. To demonstruje následující graf. 8

Tím se dosáhne lepší korelace k r zným prom nným, které jsou významné pro konstrukci algoritm operativního ízení chovatelské práce. Nap íklad ke stanovení ztrát v produkci mléka, k p edpov di procentického obsahu kaseinu, k p edpov di a pravd podobnosti pozitivních bakteriologických nález u dojnic ve stád, k opakovatelnosti v heritabilit a k p edpov di po tu somatických bun k v bazénových vzorcích. Proto se zavád jí následující parametry prezentace hodnot po tu somatických bun k: Geometrický pr m r nebo pr m r hodnot logaritmu po tu somatických bun k se sm rodatnou odchylkou. Pr m r a interval spolehlivosti logaritmicky transformovaných dat a jejich zp tná konverze na p vodní data. Procentuální vyjád ení distribuce etnosti v dekadicky volených t ídách po tu somatických bun k. Limity po tu somatických bun k pro percentuální dekadické t ídy. Metody stanovení po tu somatických bun k Tyto metody lze v zásad d lit na: Laboratorní: P ímé: Mikroskopické: Elektronické: Nep ímé: P ímá mikroskopická metoda Po íta e ástic Fluorescen ní po íta e Pr tokové cytometry DNA stanovení Viskozimetrie 9

Stájové: Whiteside test California mastitis test Mastitis test-nk Direct cell counter Uvedené schéma uvádí jen nejznám jší metody. V následujícím se omezíme pouze na uvedení principu jednotlivých metod a možností jejich využití. P ímá mikroskopická metoda ( SN EN ISO13366-1: 1998). Spo ívá v tom, že se konstantní mikroobjem mléka rovnom rn rozet e na konstantní plochu podložního skla. Po zaschnutí se nát r obarví a mikroskopuje. V požadovaném po tu zorných polí se stanoví po et bun k. Ten se pak p epo te na objem 1 ml mléka. K tomu je t eba znát faktor mikroskopu, který udává kolika bu kám v 1ml mléka odpovídá jedna bu ka zjišt ná v náhodn zvoleném zorném poli. P esto, že tato metoda byla navržena Precsottem a Breedem již v roce 1910, z stává dosud referen ní metodou pro standardizaci stanovení po tu somatických bun k na elektronických po íta ích (p i sdružených testech laborato í, p i výrob bun ných standard - EN ISO13366-2: 2006). Elektronické stanovení na po íta ích ástic ( SN EN ISO13366-2: 1998). P ed vlastním stanovením je t eba vzorek mléka fixovat, aby se zabránilo cytolýze p i dispergaci tukových kapének detergentem. Dispergace tukových kapének je nezbytná, protože by p i normální velikosti kapénky interferovaly se somatickými bu kami. Vlastní princip p ístroje spo ívá v tom, že konstantní objem mléka prochází kapilární tryskou napln nou a pono enou do elektrolytu. Uvnit a vn kapiláry jsou umíst ny elektrody, mezi kterými se vytvá í elektrické pole. Pr chod každé jednotlivé bu ky naruší proudov toto pole. Vzniklé impulzy se elektronicky ítají. Po et somatických bun k se zobrazuje na displeji. Tato metoda byla navržena v šedesátých letech minulého století. Používá se dosud, i když je vytla ována po íta i využívajícími fluorescen ní mikroskopii. Elektronické stanovení na elektronických po íta ích využívajících fluorescen ní mikroskopii (EN ISO13366-2: 1998). Tato metoda pracuje na principu fluorescen ního barvení jaderné DNA somatických bun k. Konstantní objem mléka se po automatickém obarvení a na ed ní nanáší kapilární tryskou na obvod rotujícího disku. Vzniká lineární nát r, který prochází pod objektivem a je p itom ozá en monochromatickým sv tlem. Záblesky emitované fluorescence se vracejí p es objektiv a fotobu kou m ní na elektrický impuls. Po automatickém p epo tu se výsledný po et zobrazuje na displeji p ístroje. Nát r po pr chodu pod objektivem se smývá a disk leští a suší, aby byl na n j znovu nanášen nát r. Metoda vznikla v sedmdesátých letech minulého století, doznala širokého uplatn ní. Pr toková cytometrie (EN ISO13366-2: 2006). V druhé polovin devadesátých let minulého století dochází k zavedení principu pr tokové cytometrie i do stanovení po tu somatických bun k. Vzorek mléka automaticky obarvený fluorescinem je vst ikován do laminárn proudícího transportního media. Proud unášející jednotlivé bu ky je ozá en paprskem koherentního monochromatického sv tla. Záblesky emitované fluorescence se fotobu kou m ní na elektrický impuls. Po automatickém p epo tu je po et bun k zobrazen na displeji. Metoda se rychle ší í. Je uznána Mezinárodní mléka skou federací (Standard IDF 148-2: 2006). Stanovení DNA. Vychází z faktu, že mezi po tem somatických bun k a množstvím DNA uvoln né po jejich lýze existuje vysoká pozitivní korelace. Stanovení DNA se provád lo bu to v plném mléce, nebo uvoln ním DNA ze somatických bun k zachycených filtrací na miliporfiltru. 10

K vlastnímu stanovení obvykle sloužila difenylaminová reakce a spektrofotometrické stanovení. Metody vznikly v padesátých a šedesátých letech minulého století. Pro nízkou citlivost a zna nou pracnost se k rutinní diagnostice již nepoužívají. Viskozimetrie. Podstatou je zjišt ní, které publikovali v r. 1957 Schalm a Noorlander. DNA uvoln ná ze somatických bun k vytvá í s detergenty viskózní reak ní sm s. Viskozita sm si je v pozitivní korelaci s po tem somatických bun k. K test m byla použita bu pr toková viskozimetrie, zavedená v šedesátých letech (Brabant mastitis test, Wisconsin mastitis test, nebo reoviskozimetrie (Ruakura test, kulové viskozimetry). V devadesátých letech minulého století dosáhly širšího uplatn ní zejména kulové viskozimetry. Používaly se v chovatelské diagnostické praxi. Whiteside test. Whiteside v roce 1939 popsal fenomén, který byl pozd ji ozna en jeho jménem. Jeho podstatou je vznik vlo ek v reak ní sm si mastitidou zm n ného mléka s 1M NaOH. Tento princip byl použit v rychlém testu, který však byl provád n p evážn v laboratorních podmínkách. Tím si lze vysv tlit fakt, že Whiteside fenomén je nejvýrazn jší u vzork skladovaných v chladu a jeho podstatou je agregace tukových kapének. Test doznal rozší ení hlavn v USA, kde se používal ješt v sedmdesátých letech minulého století. Podstatn jší však je, že na n j navázali Schalm s Noorlanderem (1957) v práci, jejímž výsledkem byl California mastitis test. California mastitis test (CMT). Jak již bylo uvedeno DNA uvoln ná ze somatických bun k vytvá í s detergenty viskózní reak ní sm s. Zmín ní auto i navrhli test jako klasický stájový (cow side) test. Mléko nejlépe oddojené po odstran ní prvních st ik se na diagnostické palet smíchá stejným dílem s reagens. To obsahuje detergent a barevný indikátor zm ny ph. Test se hodnotí semikvantitativn v p ti stupních podle stupn viskozity reak ní sm si. Byla navržena i kvantifikace tohoto testu výpo tem tzv. irita ního indexu stáda, což je sou et bodových hodnot stup pozitivity vyšet ených krav, d lený jejich po tem. M že nabývat hodnot 0 až 16. Test byl navržen v padesátých letech minulého století a doznal celosv tového rozší ení. Používá se široce dosud. 11

Stupn pozitivity CMT a rozp tí po tu somatických bun k ve tvr ových vzorcích mléka CMT Charakteristika Rozp tí po tu somatických bun k Bodová hodnota testu Reak ní sm s v diagnostické palet [.10 3. ml -1 ] 0 P i pohledu shora z stává tekutá. 0-200 0,5 P i nakláp ní od sebe a k sob je slab slizovitá 15-200 1 Výrazn slizovitá, netvo í však gel. P i pohybu s paletou m že reakce mizet 400-1500 2 Tvo i gel, který se shlukuje uprost ed. P i kroužení se udržuje p í okraji misky. 800-5000 Ustáním v pohybu se rozprost e po dnu. 3 Vytvo ený gel prominuje nad úrovní dna i po ustání krouživého pohybu. Obvykle nad 5000 4 Zjevn zm n ný sekret Schalm, et al.,1971 Shoda a neshoda výsledk CMT podle limitní hodnoty po tu somatických bun k Po et somatických CMT bun k Po et tvrtí [.10 3. ml -1 positivní ( 1) negativní (< 1) ] 100 Falešn pozitivní Pravdiv negativní 31,6 % 68,4 % 861 > 100 Pravdiv pozitivní Falešn pozitivní 95,2 % 4,8 8 565 Hanann, J. et al., 2005 Z tabulky je z ejmé, že diagnostická ú innost CMT pro rozlišení limitní hodnoty po tu somatických bun k (100. 10 3. ml -1 ) iní pouze 63,2 %. Tato ú innost CMT byla zjišt na i jinými autory. Shoda a neshoda výsledk CMT podle kategorií zdravotního stavu mlé ných žláz Po et somatických Patogeny mlé né žlázy bun k [.10 3. ml -1 ] zjišt ny nezjišt ny Normální sekrece Latentní infekce 100 1 = 24,9 %; < 1 = 75,0 % 1 = 51,1 %; < 1 = 48,9 % Nespecifický zán t Subklinická mastitida > 100 1 = 93,2 %; < 1 = 6,8 % 1 = 96,3 %; < 1 = 3,7 % Hanann, J. et al., 2005 Z tabulky je z ejmé, že CMT diagnostikuje s vysoce ú inn zán tlivý proces mlé né žlázy, nicmén jeho velkou nevýhodou je vysoké procento falešných pozitivit u vzork ze zdravých mlé ných žláz. Proto se v posledních letech uplat uje jako kritérium hodnocení zdravotního stavu mlé ných žláz dojnic více po et somatických bun k v individuálních (konvových) vzorcích mléka krav. 12

Prvotní úsp ch a široké rozší ení CMT vedly adu autor a výrobc k modifikacím CMT. Jednou z takových je Mastitis test - NK, navržený v šedesátých letech minulého století Neumanem a Kud lkou. Mastitis test - NK. Funguje na stejném principu jako (CMT). Jeho složení i zp sob hodnocení byly modifikovány. Pro kvalitní provedení testu je t eba dodržovat optimální termín vyšet ení. Jak již bylo uvedeno, nejlépe v regulérním ase dojení, ze vzork odebraných bezprost edn po oddojení prvních st ik mléka. Pokud se test provádí mimo tuto optimální dobu, je možné k n mu p istoupit až 5 hodin po skon eném dojení. Jinak dochází k nespecificky vyšším pozitivitám. Vyšet ení v kolostrálním období a v období zaprahování, kdy sekret obsahuje zvýšený po et bun k, má tento test orienta ní význam. Vyšet ení má být provedeno komparací nález na jednotlivých tvrtích. Na základ poznání mechanismu vzniku stup pozitivity jsme navrhli klí k posuzování MT-NK (Ryšánek a Renda, 1971). Stupn pozitivity MT-NK a rozp tí po tu somatických bun k ve tvr ových vzorcích mléka MT-NK Charakteristika Rozp tí po tu somatických bun k Bodová hodnota testu Reak ní sm s v diagnostické palet [.10 3. ml -1 ] * 0 Žádný zvln ný film na dn misky p i nakláp ní v šikmém pohledu. 38-140 0,5 Zvln ný film na dn misky p i nakláp ní v šikmém pohledu. 56-360 Reakce m že mizet. 1 Závojovitý film na dn misky p i nakláp ní misky v šikmém 112-1112 pohledu. 2 P i kroužení se reak ní sm s sbaluje uprost ed. Ustáním v pohybu se 422-5972 rozprost e po dnu. 3 Reak ní sm s tvo í na dn misky reliéf, který se shlukuje uprost ed a prominuje nad úrove dna i po ustání 1422-9300 krouživého pohybu. 4 Zjevn zm n ný sekret Ryšánek a Renda, 1971; * Delogaritmovaná data. Z dosud uvedených údaj je z ejmé, že v laboratorní diagnostice se užívají metody p ímého stanovení po tu somatických bun k v mléce, ve stájových podmínkách p evážn nep ímé metody. Výjimku tvo í p ímé po íta e bun k, pracující na novém principu. Tyto po íta e byly zavedeny po átkem 21. století. Nový princip popíšeme na základ dostupné firemní literatury (ChemoMetec A/S, Dánsko). NucleoCounter SCC-100 je fluorescen ním mikroskopem integrovaným s ástí ur enou pro analýzu obrazu, která je novou aplikací analýzy obrazu, ur enou v tomto p ípad pro po ítání somatických bun k v mléce. P ístroj je vybaven portem pro tiskárnu, USB portem, portem pro napájení stejnosm rným proudem, klávesnicí a displejem.. Na elné ploše p ístroje je místo pro zasunutí speciální kazety. Kazeta je klí ovou sou ástí p ístroje. Má n kolik unikátních rys. Fluorescen ní barvivo - propidium iodid - je fixováno na vnit ek pr to ných kanálk kazety. 13

Když se kazeta plní nasáváním 50 µl sm si mléka a reagens, fluorescen ní barvivo se rozpouští a barví jádra somatických bun k. Jakmile se kazeta zasune do p ístroje, vzorek o objemu 2 µl je automaticky p emíst n do m ící kom rky, ve které je zaznamenán obraz fluoreskujících bun k. Po analýze z stává vzorek mléka i fluorescen ní barvivo uvnit kazet, což umož uje neškodnou likvidaci. V kazet je obsažen jak pr to ný systém, tak m ící komora, proto p ístroj nevyžaduje žádné išt ní, ani údržbu, ani kalibraci po celou dobu životnosti. Je tomu tak rovn ž proto, že zdrojem excita ního sv tla jsou diody (LED) s extrémní stabilitou zá ení, prokazateln po dobu životnosti p ístroje. Mikroskopická ást p ístroje je vybavena zeleným excita ním a erveným emisním filtrem. Emitované fluorescen ní sv tlo je zaost eno do detektoru, CCD kamery. Další klí ovou vlastností p ístroje je velmi malé mikroskopické zv tšení, které umož uje obraz velkého pole mnohokrát p esahujícího zorné pole b žného mikroskopu. Tak jsou po ítány všechny bu ky v analyzovaném mikroobjemu vzorku. Jedinou nevýhodou p ístroje je limitované rozp tí pro stanovení po tu bun k, které iní 10.10 3 až 2000. 10 3 bun k v ml mléka. P ístroj prokázal vynikající p esnost a vyhovující opakovatelnost stanovení. Na obdobném principu pracují i další p ístroje, jiné firemní provenience. Direct Cell Counter (DCC) Je p enosný, bateriemi napájený p ístroj. Mlé ný vzorek ur ený k analýze je odebírán do speciální kazety. Zma knutím pístu je do kazety nasát definovaný objem vzorku, p i emž každá kazeta má kalibra ní kód, který p ístroj p i m ení rozlišuje. Mléko je protla eno systémem kanálk a tak promícháno se speciálním reagens, které obarví jádro každé somatické bu ky. Takto zpracovaný vzorek je pak vystaven excita nímu sv tlu. Dochází k emisi fluorescen ních signál, jejichž obraz je zaznamenáván kamerou. Objem vzorku iní p ibližn 60 µl, m í se 1 µl obarveného vzorku. P ístroj detekuje po et bun k na displeji v rozp tí bun k od 10 do 4 000 v µl. P esnost p ístroje odpovídá p esnosti p ístroj Fossomatic (r² = 0,988). Opakovatelnost vyjád ená koeficientem variability iní 8 % na hladin 400. 10 3 v ml mléka, 12 % na hladin 100. 10 3 v ml mléka. Analýza trvá 45 sekund. Popsaný princip p ímého stanovení po tu somatických bun k dosáhl uplatn ní v systému robotizovaného dojení (2007 DeLaval VMS milking robot): DeLaval online cell counter OCC umož uje stanovit po et somatických bun k u každé z dojnic, b hem každého dojení. Získávají se tak v reálném ase data, odrážející zdravotní stav mlé ných žláz. Proto výrobce integroval tento diagnostický prost edek do nového programového vybavení k operativnímu ízení produkce mléka v etn managementu zdraví (2007 version of the DeLaval dairy management software). Za necelých 100 let se tak dovršila cesta od p ímého stanovení po tu somatických bun k na mikroskopickém podložním skle k on-line stanovení po tu v dopravní cest mléka p i robotizovaném dojení. Výzkum a vývoj nových princip stanovení po tu somatických bun k se nezastavuje, naopak. V r. 2007 byl publikován nový princip stanovení založený na kapilárním proud ní v mikrofluidní kom rce s hydrofiln modifikovaným povrchem. Mikrofluidní technologie s mikro ipy k jednorázovému použití umož uje extrémn snížit spot ebu reagencií a zavádí tak reagencie k okamžitému použití (ready-to-use reagents). Otevírají se tak dosud neznámé možnosti (Moon et al. 2007). Princip byl aplikován v p ístroji ozna eném C-reader system. C-reader system Na základ testování 875 sm sných vzork mléka C-reader vykázal vysokou korelaci (R 2 = 0.935 to 0.964) a nízkou pr m rnou diferenci logaritmicky transformovaných dat po tu somatických bun k ( 0.088 až 0.004) ve srovnání se t emi komer n dostupnými p ístroji (Fossomatic 4000, Somacount 150, Somascope). 14

Lze proto p edpokládat, že v budoucnu budou nabývat uplatn ní metody automatického, p ímého stanovení po tu somatických bun k, metody nep ímého stanovení budou na ústupu. Vybrané literární prameny Concha C. Cell types and their immunological function in bovine mammary tissues and secretions A review. Nort Ve. Med 1986;38:257-272. Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft (DVG): Leitlinien zur Bekämpfung der Mastitis des Rindes als Bestandsproblem. 3. Aufl., Gießen, 1994 IDF Internationa Dairy Federation: Fecommendation for presenattion of mastitis related data. Part 1: Somatic cell count. Bulletin of International Dairy Federation No 321. 1997. s. 10-15. Moon JS, Koo HC, Joo YS, Jeon SH, Hur DS, Chung CI, Jo HS, Park YH.: Application of a new portable microscopic somatic cell counter with disposable plastic chip for milk analysis. J. Dairy Sci. 2007 90, 2253-2259. NMC, National Mastitis Council: The Value and Use of Dairy Herd Improvement Somatic Cell Count. Verona, WI, USA, 2004. http://www.nmconline.org/dhiscc.htm Hamann, J.: Definition of the Physiological cell count treshold based on changes in milk composition. Mastitis Newsletter 25, 2003, 9-12. Hamann, J., Redetzky, R., Grabowski, N.Th.: Diagnostic Potential of the California Mastitis Test to Detect Subclinical Mastitis. Mastitis Newsletter 26, 2005, 15-21. Lee Ch. S., Wooding F.B.P., Kemp P. Identification, properties, and differential counts of cell populations using electron microscopy of dry cows secretions, colostrum and milk from normal cows. J Dairy Res 1980, 48, 39-50. Miller RH, Paape MJ, Fulton LA.: Variation in milk somatic cells of heifers at first calving. J Dairy Sci., 1991, 74, 3782-3790. Paape, M.J., Bannermann, D.D., Zhao, X., Lee, J.W.: The bovine neutrophil: Structure and function in blood and milk. Vet. Res.,34, 2003, 597-627. Ryšánek, D., Renda, V.: Mechanismus reakce Mastitis testu NK a zp sob posuzování jeho pozitivity. Vet. Med Praha, 16, 1971, 405-414. Schalm, O.W., Carroll, I.G., Jain, E.C.: Bovine mastitis. Philladelphia 1971. s. 139. Tolle, A.: Mastitis The disease in relation to control methods. In: Eds: Dodd, F.H., Griffin, T.K., Kingwill, R.G.: Proceeding of the IDF Semina on Mastitis control, 1975. International Dairy Federation, Bruxelles. s. 3-15. 15

Vybrané odborné lánky autora k tématu Ryšánek, D., Renda, V., Pospíšil, J.: Mastitis test - NK a jeho posuzování. Veteriná ství 22, 1972, 488-489. Ryšánek,D., Babák, V., Šedivá, I.: Využití po tu somatických bun k k chovatelské prevenci mastitid. In Problematika Prvovýroby mléka XX. Pod brady 1997. s. 79-88. Ryšánek, D.:Po et somatických bun k mléka jako prost edek monitoringu a tlumení mastitid. Veteriná ství 55, 2005, 349-354. Poslední aktualizace: Kv ten 2007 Copyright (c) Dušan Ryšánek. All rights reserved. 16