Diagnostika mastitid

Transkript

1 Diagnostika mastitid Jak vyplývá z uznávané kategorizace zdravotního stavu mlé né žlázy (viz následující tabulka), základními prost edky diagnostiky mastitid jsou bakteriologické vyšet ení a stanovení po tu somatických bun k ve tvr ových vzorcích mléka odebraných p ísn asepticky bezprost edn p ed dojením (po oddojení a odstran ní prvních st ik mléka). Kategorizace zdravotního stavu mlé né žlázy Po et somatických bun k Patogen [ ml -1 ] nevykultivován vykultivován < 250 (100) zdravá žláza latentní infekce > 250 (100) aseptická mastitida subklinická mastitida Klinická mastitida nespecifická infek ní International Dairy Federation Bulletin 211, 1987, 24 s; DVG,1994 Metody mikrobiologické diagnostiky Metody mikrobiologické diagnostiky mastitid byly doporu eny Mezinárodní mléka skou federací již po átkem 80. let 20. století (IDF, 1981). I když základní principy této diagnostiky z stávají i nadále platné (viz nap. NMC, 1999), stále více se za ínají uplat ovat molekulárn biologické metody, založené na detekci jednotlivých genetických marker bakteriálních p vodc mastitid simultánními postupy (nap. Gillespie a Oliver, 2005). Metody stanovení po tu somatických bun k mléka Metody stanovení po tu somatických bun k mléka zahrnují: P ímé mikroskopické stanovení po tu somatických bun k mléka ( SN EN ISO , 1998). Tato metoda se nepoužívá k rutinnímu stanovení po tu bun k, nýbrž jako referen ní metoda. Stanovení po tu somatických bun k mléka na elektronických po íta ích ástic ( SN EN ISO , 1998). Tato metoda je na ústupu a je nahrazována elektronickým stanovením s využitím principu fluorescen ní mikroskopie. Stanovení s využitím principu fluorescen ní mikroskopie, a to jak p i nanášení vzorku na rotující disk, tak p i použití princip pr tokové cytometrie. Tyto metody byly rekodifikovány (EN ISO , 2006). Fluorescen ního zobrazení somatických bun k využívají i po íta e bun k, pracující na principu.analýzy obrazu. Umož ují stanovení po tu bun k v terénních podmínkách (nap. to jsou NucleoCounter SCC-100; Direct Cell Counter). Uvedené p ístroje a jejich použití nebylo dosud mezinárodn kodifikováno. Direct Cell Counter (DCC) Je p enosný, bateriemi napájený p ístroj. Mlé ný vzorek ur ený k analýze je odebírán do speciální kazety. Zma knutím pístu je do kazety nasát definovaný objem vzorku, p i emž každá kazeta má kalibra ní kód, který p ístroj p i m ení rozlišuje. Mléko je protla eno systémem kanálk a tak promícháno se speciálním reagens, které obarví jádro každé somatické bu ky. Takto zpracovaný vzorek je pak vystaven excita nímu sv tlu. Dochází k emisi fluorescen ních signál, jejichž obraz je zaznamenáván kamerou. Objem 1

2 vzorku iní p ibližn 60 µl, m í se 1 µl obarveného vzorku. P ístroj detekuje po et bun k na displeji v rozp tí bun k od 10 do v 1 µl. P esnost p ístroje odpovídá p esnosti p ístroj Fossomatic (r² = 0,988). Opakovatelnost stanovení vyjád ená koeficientem variability iní 8 % na hladin / ml mléka, 12 % na hladin / ml mléka. Analýza trvá 45 sekund. Významnou zm nu doznal i názor na limitní hodnotu po tu somatických bun k ve tvr ových vzorcích mléka, která má rozlišit zdravou a zán tem stiženou mlé nou žlázu. Zatímco se d íve uznávala limitní hodnota po tu bun k / ml (IDF, 1987), v sou asnosti se stále více prosazuje limitní hodnota / ml mléka (DVG,1994). Nep ímé metody diagnostiky mastitid Nejrozší en jší nep ímou metodou pro diagnostiku projev zán t se stalo koncem 20. století m ení elektrické vodivosti mléka. Stanovení elektrické vodivosti mléka (VM) se využívalo pro screening subklinických mastitid. Byla navržena ada p ístroj, které umož ovaly m ení ve stáji. Princip m ení vycházel z faktu, že mléko je elektrolyt, nebo obsahuje disociované ionty jejichž obsah v mléce p i zán tlivém procesu vzr stá. To se zejména týká iont Cl - a Na +. Údaje o kritické hodnot pro diagnostiku mastitid se velmi r zní. VM se udává absolutní hodnotou (AV) nebo rozdílem nejvyšší a nejnižší hodnoty ve vzorcích mléka tvrtí téhož vemene (RV). Byly odvozeny diagnostické algoritmy využívající kombinaci obou vyjád ení (MIX). N kte í auto i použili p i konstrukci diagnostického algoritmu i nejvyšších hodnot AV a RV z opakovaných m ení. Tento p ístup ovšem vyžaduje dopln ní prostého stanovení VM programovou podporou technologického procesoru. D je se tak proto, že prosté stanovení VM má velmi nízkou diagnostickou ú innost (pod 60 % shody s referen ními diagnostickými metodami). P íklad diagnostické ú innosti p i použití algoritmu s programovou podporou a p i kritických hodnotách AV 0,57 S. m -1, RV 0,07 S. m -1 pro subklinickou mastitidu a AV 0,66 S. m -1, RV 0,16 S. m -1 pro klinickou mastitidu dokumentuje následující tabulka. Z tabulky je z ejmé, že leze s programovou podporou dosáhnout vysoké diagnostické ú innosti. Nicmén je t eba mít na z eteli, že VM je ovliv ována adou interferujících initel, zejména plemennou p íslušností zví at a sezónními vlivy (Ryšánek et al., 1984). Je rovn ž vhodné zmínit fakt, že MV indikuje zm ny v iontovém složení mléka d íve, než jsou patrné smyslové zm ny mléka a dokonce d íve, než je zaznamenán nár st po tu somatických bun k v mléce. Diagnostická ú innost m ení elektrické vodivosti mléka s programovou podporou (aritmetický pr m r 2 maximálních hodnot v 7 denním cyklu) Status AV RV MIX F - Shoda F + F - Shoda F + F - Shoda F + Mastitida 12,2 86,8 1,0 0,9 94,4 4,7 0,0 95,3 4,7 (F - falešn negativní nález F + falešn pozitivní nález) Ryšánek, D.: Vet.Med. Praha, 35,1990,

3 Diagnostické p ístroje pracující s programovou podporou jsou nákladná za ízení. Proto se tento sofistikovaný p ístup uplat uje v sou asné dob pouze v systémech automatického sb ru dat v procesu dojení a v návazných systémech procesního ízení chovatelských inností. V takových systémech je m ení VM obvykle kombinováno se snímáním spot eby jadrného krmiva, s automatickým m ením hmotnosti výdojku a s m ením pohybové aktivity dojnic krokom ry. Vzniká tak komplexní diagnostický signál umož ující automatický screening nemocných dojnic. Posoudit diagnostický význam VM a n kterých dalších zm n látkového složení mléka umož ují následující tabulky. T snost vztahu po tu somatických bun k mléka a vybraných znak látkového složení mléka ( tvr ové vzorky p ed dojením) Nezávisle prom nná Závisle prom nná Vícenásobní regrese Ukazatel n Pr m r Ukazatel n Pr m r r S Determinace [%] Chloridy ,09 0, ,55 Po et somatických bun k [10 3 /ml] ,0 [mmol/l] Laktóza [mmol/l] Chlorcukrové íslo Titra ní Kyselost [ SH] Elektrická vodivost [S/m] ,3-0, , ,1 0, , ,96-0, , ,543 0, ,84 Nezávisle prom nná Závisle prom nná Vícenásobní regrese Ukazatel n Pr m r Ukazatel n Pr m r r S Determinace [%] Laktóza [mmol/l] ,3-0, ,93 Chlorcukrové 196 3,1 0, ,50 Chloridy [mmol/l] ,09 íslo Titra ní Kyselost [ SH] 196 6,96-0, ,61 Elektrická 196 0,543 0, ,70 vodivost [S/m] r regresní koeficient; r (0,001) = 3,39 ; S Významnost; +++ P < 0,001 Ryšánek, D., Olejník, P. 1980: Vet. Med Czech., 25 (8): Czech 3

4 Z tabulek je z ejmé, že elektrická vodivost mléka koreluje t sn ji s obsahem chloridových iont v mléce než s po tem somatických bun k. Obdobn se chová i laktóza v mléce. Nicmén lze konstatovat, že všechny testované znaky tím, že statisticky významn korelují s po tem somatických bun k, mohou být použity jako nep ímé ukazatele poruchy sekre ní funkce mlé né žlázy, která provází zán tlivý proces. V ad experimentálních prací byly tyto znaky takto použity. K b žné diagnostice se však nepoužívají. Obdobn je tomu i u dalších zm n látkového složení mléka, jek je charakterizují následující graf a tabulky. Tolle, A., Heeschen, W., Reichmuth, J., Zeidler, H.: Dairy Sci. Abstract 33 (1971) Chemické zm ny mléka v d sledku mastitid :Složka Normální hladina Koeficient zm ny laktóza [g. l -1 ] 4,85 0,93 S1 -kasein [mg. ml -1 ] 13,3 0,50 -laktalbumin [mg. ml -1 ] 1,03-1,22 0,50 ß-laktoglobulin [mg. ml -1 ] 4,0 0,74 imunoglobuliny [mg. ml-1] 0,25-0,30 10,0 serumalbumin [mg. ml-1] 0,24 2,7 Hamann, J., Krömker, V., : Livest. Prod. Sci., 48, 1997,

5 Fyzikáln chemické zm ny mléka v d sledku mastitid Složka Normální hladina Koeficient zm ny celkový Ca 2+ [µmol. l -1 ] 22,94 0,43 celkový Mg 2+ [µmol. l -1 ] 8,32 0,31 celkový P [µmol. l -1 ] 17,2 0,75 citrát [mmol. l -1 ] 11,2 0,72 K + [mmol. l -1 ] 44,1 0,85 Cl - [mmol. l -1 ] 22,6-39,05 1,2-2,0 Na + [mmol. l -1 ] 24,9 2,0 chlorcukrové íslo 2,05-3,2 2,8 titra ní kyselost [ SH] 6,2-8,0 0,8-0,6 ph 6,65 1,15 elektrická vodivost [S. m -1 ] 0,480 1,1-2,2 bod mrznutí [- C] 0,57-0,53 <1,0 Hamann, J., Krömker, V., : Livest. Prod. Sci., 48, 1997, Z dalších zm n látkového složení mléka mají diagnostický význam tyto: Stanovení bovinního serumalbuminu (BSA). Vychází z faktu, že p i zán tlivém procesu mlé né žlázy se zvyšuje pr chodnost hemato-alveolární bariéry a z krve do mléka pronikají i vysokomolekulární látky, krom jiných i sérumalbumin. Principem stanovení v komer ních testech byla prostá radiální difúze v agarovém gelu obsahujícím monospecifické protilátky proti BSA. Vyhodnocení se provád lo stanovením pr m ru precipita ní zóny. Test vznikl na p elomu sedmdesátých a osmdesátých let minulého století. V sou asnosti se již diagnosticky tém nepoužívá. Antitrypsinový test. Neutrofilní granulocyty migrující b hem zán tu do mlé né žlázy uvol ují proteolytické enzymy, které jsou histotoxické a poškozují tkán mlé né žlázy. Mastitidní sekret však obsahuje i inhibitory proteináz. Aktivita t chto inhibitor je v pozitivní korelaci s po tem somatických bun k, jakož i s obsahem sérum albuminu v mléce. P esto, že tyto inhibitory vykazují elektroforetickou hetergenitu, jsou považovány za analog lidského 1 anti-trypsinu. Vzorky mléka se istí koprecipitátem a centrifugací, aby se odstranily interferující komponenty. Supernatanty se p enesou do jamek mikrotitra ních desti ek. P idá se trypsin a substrát. Reak ní sm s se inkubuje a pak spektrofotometricky m í absorbance chromogenu uvoln ného trypsinem. Systém readeru a PC umož uje provést s programovou podporou korekci turbidity a interpolaci hodnot podle nulových a 100% kontrolních vzork a stanovení antitrypsinové aktivity vyšet ovaných vzork mléka. Tento test, vyvinutý v osmdesátých letech minulého století, poskytuje vysokou produktivitu stanovení. Je však proti p ímému stanovení po tu somatických bun k mnohanásobn dražší. Proto nedoznal širšího uplatn ní krom experimentálních prací. NAGASE test. Zán tlivé sekrety mlé né žlázy obsahují enzym N-acetyl-ß-Dglukozaminidázu, pocházející z rozpadlých neutrofilních granulocyt, z v tší ásti však z poškozených epiteliálních bun k. Princip metody stanovení spo ívá v tom, že se vzorky mléka smíchají se substrátem a v kyselém prost edí inkubují. Dojde k hydrolýze, kterou se ze substrátu uvolní št p, jenž se stane silnou alkalizací sm si vysoce fluorescentní. Reakce probíhá v titra ních mikroplotnách. Výsledná fluorescence se m í fluorometrem. P ístroj má 5

6 vysokou opera ní kapacitu. Princip reakce byl navržen již za átkem šedesátých let minulého století. Popsanou podobu však test získal v osmdesátých letech. V devadesátých letech byl použit v ad výzkumných prací. V sériové diagnostice nedoznal v tšího uplatn ní, krom zem svého p vodu - Finska a dalších skandinávských zemí. C-reaktivní protein pat í stejn tak jako haptoglobulin (Hp) a sérum amyloid A (SAA) k protein m akutní fáze zán tu. Bylo prokázáno, že p i mastitid skotu se zvyšuje zejména koncentrace Hp a na mlé nou žlázu vázaného SAA (M-SAA3). M ením exprese gen na mrna bylo zjišt no, že oba proteiny jsou produkovány i ve tkáni mlé né žlázy, M-SAA3 více než Hb. V játrech jsou produkovány v opa ném po adí významnosti. Protein m akutní fáze se v mlé né žláze skotu v nuje výzkumná pozornost. K diagnostice mastitid se však zatím jejich stanovení v mléce ani exprese gen kódujících jejich produkci b žn nepoužívají. Vý et metod použitých v experimentálních pracích by mohl a v budoucnu jist bude pokra ovat. Nicmén jejich širší uplatn ní v rutinní diagnostice mastitid nelze o ekávat. Mikrobiologické vyšet ení a stanovení po tu somatických bun k mléka budou jist i nadále esenciálními metodami v diagnostice mastitid. 6

7 Vybraná literatura CSN EN ISO : 1998 Mléko Stanovení po tu somatických bun k. ást 1. Mikroskopická metoda. CSN EN ISO : 1998 Mléko Stanovení po tu somatických bun k. ást 2. Metoda elektronického po ítání ástic. CSN EN ISO : 1998 Mléko Stanovení po tu somatických bun k. ást 3. Fluoroopto-elektronická metoda. EN ISO : Milk Enumeration of somatic cells Part 2: Guidance on the operation of fluoro-opto-electronic counters. Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft (DVG): Leitlinien zur Bekämpfung der Mastitis des Rindes als Bestandsproblem. 3. Aufl., Gießen, Gillespie B.E, Oliver S.P. 2005: Simultaneous detection of mastitis pathogens, Staphylococcus aureus, Streptococcus uberis, and Streptococcus agalactiae by multiplex realtime polymerase chain reaction. J Dairy Sci. 88(10): Hamann, J., Krömker, V.1997: Potential of specific milk composition variables for cow health management, Livest. Prod. Sci., 48: IDF 1981: Laboratory methods for use in mastitis work. International Dairy Federation Bulletin, Document pp. IDF 1987: Bovine mastitis. Definition and guidelines for diagnosis. Bulletin of International Dairy Federation No pp. NMC 1999: National Mastitis Council. Laboratory Handbook on Bovine Mastitis. National Mastitis Council. Walton Commons West, Madison, USA. 222 pp. Rysanek, D., Olejnik, P.: Diagnostic effectiveness of the measurement of electric conductivity in milk. Vet. Med. Czech., 25 (8), 1980, Czech Ryšánek, D., Olejník, P., Sokol, J., Opletal, A., Picka, F., Majbová, J., Krej í, J. 1984:Analysis of factors underlying the electric conductance of cow s milk Breed, locality, year season. Vet. Med. Czech., 29 (2): Czech Rysanek, D. 1990: Algorithms of evaluation of milk electric-conductivity for mastitis screening. Vet. Med. Czech., 35 (3): Tolle, A., Heeschen, W., Reichmuth, J., Zeidler, H.: Dairy Sci. Abstract 33 (1971) Poslední aktualizace: erven 2007 Copyright (c) Dušan Ryšánek. All rights reserved. 7