Ontogenetický vývoj citlivosti na antagonisty excitačních aminokyselin Development of sensitivity to excitatory amino acid antagonists Pavel Mareš Fyziologický ústav Akademie věd České republiky Souhrn Nezralý mozek je citlivější na excitační aminokyseliny než mozek dospělý. Jako míru citlivosti v průběhu postnatálního vývoje laboratorního potkana jsme použili antikonvulzivní účinek antagonistů excitačních aminokyselin. Pokles účinků kompetitivních i nekompetitivních NMDA antagonistů v průběhu vývoje jsme demonstrovali pomocí dvou modelů epileptických záchvatů: generalizovaných tonicko-klonických záchvatů vyvolaných systémově podaným pentetrazolem a epileptických následných výbojů vyvolaných rytmickým elektrickým drážděním senzorimotorické oblasti mozkové kůry. Antagonisté AMPA receptorů vykazují podobné vývojové změny. Bohužel, nežádoucí vedlejší účinky mají stejný vývoj. Vyšší citlivost nezralého mozku jsme prokázali i pro antagonistu typu I metabotropních glutamátových receptorů MPEP. Tato látka nevykazuje závažné vedlejší účinky typické pro NMDA a AMPA antagonisty. Metabotropní glutamátové receptory tak představují slibný cíl pro terapii nejen epilepsií. Klíčová slova: excitační aminokyseliny, antagonisté, antikonvulzivní účinky, vývoj, laboratorní potkan Summary Immature brain is more sensitive to excitatory amino acids than an adult central nervous system. Anticonvulsant action of antagonists of excitatory amino acids was used as a measure of sensitivity during the postnatal development of laboratory rats. An ontogenetic decrease in efficacy of both noncompetitive and competitive NMDA antagonists was demonstrated in two models of epileptic seizures: generalized tonic-clonic seizures elicited by systemic administration of pentetrazol and epileptic afterdischarges induced by rhythmic electrical stimulation of sensorimotor cortical area. Antagonists of AMPA receptors exhibit a similar change during postnatal development. Unfortunately, unwanted side effects follow the same developmental course. Higher sensitivity of the immature brain was demonstrated also for an antagonist of type I metabotropic glutamate receptors MPEP. This drug is devoid of serious side effects connected with NMDA as well as AMPA antagonists. Metabotropic receptors may represent a promising therapeutic target not only for epilepsy. Key words: excitatory amino acids, antagonists, anticonvulsant action, ontogeny, rat Excitační aminokyseliny glutamát a aspartát jsou hlavními excitačními mediátory v mozku. Působí na dva základní typy receptorů ionotropní a metabotropní. Receptory ionotropní, tj. takové, které jsou přímo součástí iontových kanálů, jsou děleny na tři podtypy (Fagg a Massieu 1991). Ty jsou pojmenovány podle typických agonistů N-methyl-D-aspartátu (NMDA), á-amino-3-hydroxy- 5-metylisoxazole-4-propionátu (AMPA) a kyseliny kainové. Poslední dva jmenované podtypy jsou někdy slučovány a uváděny jako AMPA/kainátové nebo nonnmda receptory. Nejvíce poznatků máme k dispozici o NMDA receptorech, kde jsou detailně známy podjednotky, ze kterých se tyto receptory skládají. Druhou velkou skupinu receptorů pro excitační aminokyseliny tvoří receptory metabotropní, tj.
takové, které v buňce prostřednictvím G proteinů spouštějí metabolickou kaskádu, na jejímž konci může opět být změna prostupnosti membrány pro ionty. Podle reakce, kterou spouštějí, a farmakologické citlivosti jsou metabotropní receptory děleny do tří typů, označovaných římskými číslicemi (Conn a Pin, 1997; Schoepp et al., 1999). Typ I spouští hydrolýzu fosfotického inositolu, typy II a III inhibují adenylylcyklázu. Molekulární biologie stanovila osm různých bílkovin, jejichž homodiméry tvoří receptory. Pro farmakologické studie a možné budoucí využití látek ovlivňujících oba typy receptorů je důležité, že existují agonisté i antagonisté specifičtí jen pro určitý podtyp receptorů. Agonisté a antagonisté ionotropních receptorů jsou známí dlouho, vývojové studie se zaměřovaly hlavně na účinky agonistů byla studována jejich toxicita (McDonald et al., 1993); účinky in vitro (Tsumoto et al., 1987; Hamon a Heinemann, 1988). Tyto práce jasně prokázaly vyšší citlivost nezralého mozku k účinkům agonistů. O něco později začaly studie konvulzivních účinků agonistů excitačních aminokyselin. Série prací s kainátem opět demonstrovala vyšší citlivost vyvíjejícího se mozku ve srovnání s mozkem zralým (Cavalheiro et al., 1983; Cherubini et al., 1983; Albala et al., 1984; Ben-Ari et al., 1984; Berger et al., 1984; Nitecka et al., 1984; Tremblay et al., 1984). Provedli jsme detailní studii na pěti různých stadiích vývoje laboratorního potkana a nalezli jsme vývojový posun konvulzivní účinnosti kainátu, který nepřesahoval rámec jednoho řádu dávky vyvolávající dlouhotrvající epileptický záchvat u 7denních mláďat byly 8 nižší než dávky se stejným účinkem u dospělých zvířat (Velíšková et al.,1988). Jiná situace je u NMDA. Jeho konvulzivní účinek u mláďat laboratorního potkana prokázal Schoepp a spol. (1990), který konstatuje vyšší účinnost u mláďat než u dospělých. Naše systematická studie prokázala, že konvulzivní dávky u 7denních mláďat jsou stokrát nižší než u dospělých potkanů (Mareš a Velíšek, 1992). Údaje pro agonisty AMPA receptorů jsou sporé, jen Schoepp konstatuje vyšší citlivost u mláďat (Schoepp et al., 1990). V protikladu k bohaté literatuře o konvulzivních účincích agonistů, kde údaje pocházejí z několika laboratoří, nebyly antikonvulzivní účinky antagonistů častým námětem vývojových studií. Naše Laboratoř vývojové epileptologie se věnovala tomuto tématu systematicky od konce osmdesátých let. Antagonisté NMDA receptorů potlačují generalizované tonicko-klonické záchvaty vyvolané podkožním podáním pentetrazolu a nemění minimální, klonické záchvaty. Vyšší účinnost proti generalizovaným záchvatům byla prokázána jak pro nekompetitivní antagonisty (ketamin Velíšek et al., 1989, 1992; dizocilpin Velíšek et al., 1991; Velíšek a Mareš, 1992), tak i pro antagonisty kompetitivní (2-amino- 7-fosfonoheptanová kyselina Velíšek et al.,1990; CGP 39551 Velíšek et al., 1997; CGP 40116 Haugvicová a Mareš, 1998). Vyšší účinnost u mladších zvířat vykazuje i nekompetitivní antagonista memantin, avšak v protikladu k dalším antagonistům potencuje minimální klonické záchvaty (Mareš připravováno do tisku). Dizocilpin vykazuje na časných vývojových stadiích nejenom vyšší antikonvulzivní účinnost, ale i delší trvání účinku ve srovnání s dospělými potkany (Kubová et al. zasláno do tisku). Vyšší antikonvulzivní účinnost antagonistů NMDA receptorů jsme potvrdili i při studiu dalšího modelu korových epileptických následných výbojů. Dizocilpin nejenom nejvýrazněji zkracuje trvání těchto epileptických výbojů u nejmladší sledované skupiny, tj. 12denních potkanů (Mareš a Šlamberová zasláno do tisku), ale u této věkové skupiny zvyšuje práh pro vyvolání korových následných výbojů více než u mláďat 18 a 25denních (Mareš připravováno do tisku). Nejvyšší efekt proti korovým následným výbojům jsme popsali i pro kompetitivního antagonistu CGP 40116 (Mareš a Šlamberová zasláno do tisku). Z tohoto jednotného obrazu se vymykají dva výsledky téměř úplné chybění účinku ketaminu u 18denních mláďat při stabilním efektu u mladších i starších věkových skupin (Kubová a Mareš, 1995) a nejvýraznější efekt kompetitivního antagonisty CGP 40116 u 25denních mláďat (Mareš a Šlamberová zasláno do tisku). V obou případech jsou tyto výsledky v rozporu s účinky proti generalizovaným tonicko-klonickým záchvatům vyvolaným pentetrazolem (Velíšek et al., 1989, 1991) a v případě ketaminu i s účinky proti epileptickým následným výbojům vyvolaným drážděním hipokampu (Mikolášová et al., 1994). Bohužel se vyšší citlivost nezralého mozku na antagonisty NMDA receptorů projevuje nejenom v účincích žádoucích, ale i nežádoucích (Mikulecká a Mareš, 2002). Antagonisté AMPA receptorů nemají tak silné antikonvulzivní účinky jako antagonisté NMDA receptorů. Nicméně i zde jsme prokázali vyšší citlivost nezralého mozku jak v testu motorických záchvatů
vyvolaných pentetrazolem (Velíšek et al., 1995), tak i při použití modelu korových epileptických následných výbojů (Kubová et al., 1997; Mareš et al., 1997). I pro AMPA antagonisty platí snadnější vyvolání nežádoucích účinků (vliv na motoriku) u mladších věkových skupin (nekompetitivní antagonista GYKI 52466 Kubová et al., 1997; kompetitivní antagonista NBQX Mareš et al., 1997). V posledních letech bylo také prokázáno, že nezralý mozek je citlivý na velmi závažný nežádoucí efekt dizocilpinu. Tento nekompetitivní NMDA antagonista vyvolává neuronální smrt ve vyvíjejícím se mozku (Ikonomidu et al., 1999; Mareš et al., 2004). Výskyt dosud prokázaných nežádoucích účinků u mláďat hlodavců je jistě hlavní příčinou toho, že látky uvedené v tomto přehledu nejsou a nebudou uvedeny do klinické praxe a slouží jen jako látky výzkumné. Naděje je v současné době vkládána do antagonistů specifických pro takové NMDA receptory, které obsahují určité podjednotky. Pozornost je zaměřena na látky blokující NMDA receptory, ve kterých se vyskytuje podjednotka NR2B. Prohlubující se znalost metabotropních glutamátových receptorů vedla k tomu, že i v této oblasti se začala hledat potenciální antiepileptika (Moldrich et al., 2003). Pro ontogenetický výzkum byl důležitý nález McDonalda a spol. (1993), kteří prokázali u mláďat laboratorního potkana konvulzivní účinky agonisty typu I. V našich pokusech jsme ukázali, že antagonista typu I (mglur5) MPEP má antikonvulzivní efekt proti pentetrazolu ve všech třech věkových skupinách (12, 18 a 25 dnů po narození), které jsme studovali. Účinnost je nejvyšší v nejmladší věkové skupině (12denní potkani) a s věkem mírně klesá. Přitom MPEP na rozdíl od antagonistů NMDA a AMPA receptorů nemá zřetelné nežádoucí účinky na motoriku mláďat (Mareš a Mikulecká, 2004). MPEP je účinný i proti korovým následným výbojům (i v tomto modelu jsou 12denní mláďata citlivější než 18denní a zvláště než 25denní), nemá však efekt na epizody rytmu hrot-vlna vyvolané malými dávkami pentetrazolu (Lojková a Mareš připravováno do tisku). MPEP se liší od antagonistů NMDA také v tom, že antikonvulzivní dávky nevyvolávají neurodegeneraci v kůře, talamu a hipokampu prokazovanou pomocí fluorescenčního barviva Fluoro Jade B (Lojková a spol. připravováno do tisku). Z těchto našich výsledků můžeme vyvodit, že nezralý mozek je citlivější i na účinky antagonisty typu I metabotropních glutamátových receptorů. Z uvedených výsledků je možno jednoznačně uzavřít, že vyvíjející se mozek je citlivější na účinky antagonistů glutamátových receptorů. U ionotropních receptorů je to dáno jednak vyšší hustotou těchto receptorů v nezralém mozku (Insel et al., 1990; Miller et al., 1990), jednak i jejich odlišnými vlastnostmi. Prof. MUDr. Pavel Mareš, DrSc. Fyziologický ústav Akademie věd ČR Vídeňská 1083 142 20 Praha 4 e-mail: maresp@biomed.cas.cz Literatura: Albala BJ, Moshé SL, Okada R. Kainic acid-induced seizures: A developmental study. Dev Brain Res 1984.;13:139 148. Ben-Ari Y, Tremblay E, Berger M, Nitecka L. Kainic acid seizure syndrome and binding sites in developing rats. Dev Brain Res 1984;14: 284 288. Berger ML, Tremblay E, Nitecka L, Ben-Ari Y. Maturation of kainic acid seizure-brain damage syndrome in the rat. III. Postnatal development of kainic acid binding sites in the limbic system. Neuroscience 1984;13:1095 1104.
Cavalheiro EA, Defeo MR, Mecarelli O, Ricci GF. Intracortical and intrahippocampal injections of kainic acid in developing rats: an electrographic study. Electroenceph clin Neurophysiol 1983;56:480 486. Cherubini E, Defeo MR, Mecarelli O, Ricci GF. Behavioral and electrographic patterns induced by systemic administration of kainic acid in developing rats. Dev Brain Res 1983;9:69 77. Conn PJ, Pin J-P. Pharmacology and functions of metabotropic glutamate receptors. Annu Rev Pharmacol Toxicol 1997;37:205 237. Fagg GE, Massieu L. Excitatory amino acid receptor subtypes. In: Meldrum BS, ed. Excitatory Amino Acid Antagonists. Oxford: Blackwell, 1991;39 63. Hamon B, Heinemann U. Developmental changes in neuronal sensitivity to excitatory amino acids in area CA1 of the rat hippocampus. Dev Brain Res 1988;38:286 290. Haugvicová R, Mareš P. Anticonvulsant action of a NMDA receptor antagonist CGP 40116 varies only quantitatively during ontogeny in rats. Fundam Clin Pharmacol 1998;12:521 525. Ikonomidou C, Bosch F, Miksa M, Bittigau P, Vockler J, Dikranian K, Tenkova TI, Stefovska V, Turski L, Olney JW. Blockade of NMDA receptors and apoptotic neurodegeneration in the developing brain. Science 1999;283:70 74. Insel TR, Miller LP, Gelhard RE. The ontogeny of excitatory amino acid receptors in rat forebrain. I. N-methyl-D-aspartate and quisqualate receptors. Neuroscience 1990;35:31 43. Kubová H, Mareš P. Suppression of cortical epileptic afterdischarges by ketamine is not stable during ontogenesis in rats. Pharmacol Biochem Behav 1995;52:489 492. Kubová H, Világi I, Mikulecká A, Mareš P. Non-NMDA receptor antagonist GYKI 52466 suppresses cortical afterdischarges in immature rats. Eur J Pharmacol 1997;333:17 26. Mareš P, Folbergrová J, Kubová H. Excitatory aminoacids and epileptic seizures in immature brain. Physiol Res 2004;53 (Suppl1):S115 S124. Mareš P, Haugvicová R, Kubová H: Interaction of excitatory amino acid antagonists with cortical afterdischarges in developing rats. Epilepsia 2002;43 (Suppl 5):61 67. Mareš P, Mikulecká A. MPEP, an antagonist of metabotropic glutamate receptors, exhibits anticonvulsant action in immature rats without a serious impairment of motor performance. Epilepsy Res 2004; 60:17 26. Mareš P, Mikulecká A, Pometlová M. Anticonvulsant action of 2,3-dihydroxy-6-nitro-7-sulfamoylbenzo(f)quinoxaline in immature rats: comparison with the effects on motor performance. J Pharmacol Exp Ther 1997;281:1120 1126. Mareš P, Velíšek L. N-Methyl-D-aspartate (NMDA)-induced seizures in developing rats. Dev Brain Res 1992;65:185 189. McDonald JW, Fix AS, Tizzano JP, Schoepp DD: Seizures and brain injury in neonatal rats induced by 1S,3R-ACPD, a metabotropic glutamate receptor agonist. J Neurosci 1993;13:4445 4455. Mikolášová R, Velíšek L, Vorlíček J, Mareš P. Developmental changes of ketamine action against epileptic afterdischarges induced by hippocampal stimulation in rats. Develop Brain Res 1994;81:105 112. Mikulecká A, Mareš P. NMDA receptor antagonists impair motor performance in immature rats. Psychopharmacology 2002;162:364 372.
Miller JP, Johnson AE, Gelhard RE, Insel TR. The ontogeny of excitatory amino acid receptors in rat forebrain. II. Kainic acid receptors. Neuroscience 1990;35:45 51. Moldrich RX, Chapman AG, De Sarro G, Meldrum BS: Glutamate metabotropic receptors as targets for drug therapy in epilepsy. Eur J Pharmacol 2003;476:1 16. Nitecka L, Tremblay E, Charton G, Bouillot JP, Berger ML, Ben-Ari Y: Maturation of kainic acid seizure-brain damage syndrome in the rat. II. Histopathological sequelae. Neuroscience 1984;13:1073 1094. Schoepp DD, Gamble AY, Salhoff CR, Johnson BG, Ornstein PL: Excitatory amino acid-induced convulsions in neonatal rats mediated by distinct receptor subtypes. Eur J Pharmacol 1990;182:421 427. Schoepp DD, Jane DE, Monn JA: Pharmacological agents acting at subtypes of metabotropic glutamate receptors. Neuropharmacology 1999;38:1431 1476. Tremblay E, Nitecka L, Berger M, Ben-Ari Y: Maturation of kainic acid seizure brain damage syndrome in the rat. I. Clinical, electrographic and metabolic observations. Neuroscience 1984;13:1051 1072. Tsumoto T, Hagihara K, Sato H, Hata Y. NMDA receptors in the visual cortex of young kittens are more effective than those of adult cats. Nature 1987;327: 513 514. Velíšek L, Kubová H, Mareš P, Vachová D: Kainate/AMPA receptor antagonists are anticonvulsant against the tonic hindlimb component of pentylenetetrazol-induced seizures in developing rats. Pharmacol Biochem Behav 1995;51:153 158. Velíšek L, Kusá R, Kulovaná M, Mareš P. Excitatory amino acid antagonists and pentylenetetrazoleinduced seizures during ontogenesis: 1. The effects of 2-amino-7-phosphonoheptanoate. Life Sci 1990;46:1349 1357. Velíšek L, Mareš P. Developmental aspects of the anticonvulsant action of MK-801. In: Kamenko J-M, Domino EF, eds. NPP Books. Ann Arbor,1992; 779 795. Velíšek L, Mareš P, Brabcová, R, Vaňková S, Lanštiaková M, Kubová H. Ketamine as an anticonvulsant drug. In: Kamenko J-M, Domino EF, eds. NPP Books, Ann Arbor, 1992, 797 800. Velíšek L, Mikolášová R, Blanková-Vaňková S, Mareš P. Effects of ketamine on metrazol-induced seizures during ontogenesis in rats. Pharmacol Biochem Behav 1989;32:405 410. Velíšek L, Vachová D, Mareš P. Excitatory amino acid antagonists and pentylenetetrazol-induced seizures during ontogenesis. IV. Effect of CGP 39551. Pharmacol Biochem Behav 1997;56:493 498. Velíšek L, Verešová S, Pôbišová H, Mareš P. Excitatory amino acid antagonists and pentylenetetrazolinduced seizures during ontogenesis. 2. The effects of MK-801. Psychopharmacology 1991;14: 510 514. Velíšková J, Velíšek L, Mareš P. Epileptic phenomena produced by kainic acid in laboratory rats during ontogenesis. Physiol Res 1988;37:395 405.