Vybrané parametry neurodegenerace u animálních modelů i lidí. Psychiatrické centrum Praha

HTML
DOWNLOAD

Rozměr: px

Začít zobrazení ze stránky:

Download "Vybrané parametry neurodegenerace u animálních modelů i lidí. Psychiatrické centrum Praha"

Adéla Čechová
před 9 lety
Počet zobrazení:

1 Vybrané parametry neurodegenerace u animálních modelů i lidí Psychiatrické centrum Praha RNDr. Jan Říčný MUDr. Aleš Bartoš MUDr. Anna Kubešová Mgr. Michala Kolářová Mgr. Lenka Hromádková

2 MUDr. Anna Kubešová

3 Rozsah neurodegenerace způsobené intrahipokampální aplikací NMDA nebo hypoxickoischemickým poškozením mozku Role neuroaktivních steroidů při prevenci poškození

4 Stanovení rozsahu degenerace Histochemické barvení fluorescenčními barvami Fluoro-Jade B v kombinaci s Hoechst Imunochemická analýza aktivace mikroglie protilátkou anti-cd11b Měření objemu hipokampu Stanovení BDNF

Hoechst 33258 Imunochemická analýza aktivace mikroglie

5 Histochemické zpracování mozků Mozky nakrájeny na kryostatu na tloušťku řezu 40μm. Každý řez od rostrálního začátku mozku do konce hipokampu uchován ve 24-jamkové destičce v kryoprotektivním roztoku. Řezy skladovány při teplotě -40ºC.

Každý řez od rostrálního začátku mozku do konce hipokampu

6 Každý 6. řez od rostrálního začátku mozku po konec hipokampu natažen v PBS na želatinovaná sklíčka a přes noc sušen při 37 ºC, následně obarven v 0,001% Fluoro-Jade B v 0,1% kyselině octové a pak v 0,001% Hoechst Preparáty po obarvení opláchnuty v destilované vodě, přes noc usušeny a pak odvodněny v Neo-Clearu (Merck) a překryty krycími sklíčky.

sklíčka a přes noc sušen při 37 ºC, následně obarven v 0,001% Fluoro-Jade B v 0,1%

7 Řezy po nabarvení hodnoceny pomocí mikroskopu Zeiss Axio Imager Z1. Rozsah hipokampální léze analyzován v následujících oblastech: gyrus dentatus, CA1-2 a CA3. Závažnost poškození vyjádřena jako procento hodnocené hipokampální oblasti obsazené Fluoro-Jade B pozitivními buňkami. Pro porovnání rozsahu poškození hipokampu mezi jednotlivými skupinami použita škála 1-4 (v rozsahu 0-75%) podle Tsenova et al., 2003.

Závažnost poškození vyjádřena jako procento hodnocené hipokampální oblasti obsazené Fluoro-Jade B

8 Aktivace mikroglie Pro stanovení výskytu aktivované mikroglie vyvolaného intrahipokampální aplikací NMDA barvení řezů imunohistochemicky protilátkou anti-cd11b.

9 Řezy (každý 12.) inkubovány v 1% H 2 O 2, poté blokovány v 10% goat sérum s 0,2% Triton X v PBS, inkubovány s primární protilátkou (anti- CD11b, AbD Serotec) inkubovány s biotinylovanou sekundární protilátkou (Goat anti-mouse IgG, Jackson Immuno Research) a nakonec s avidin-biotin peroxidázovým komplexem (Vectastain ABC Elite Kit). Po obarvení diaminobenzidinem nataženy na želatinovaná sklíčka, odvodněny v Neo-Clearu (Merck) a překryty krycími sklíčky.

protilátkou (anti- CD11b, AbD Serotec) inkubovány s biotinylovanou sekundární protilátkou (Goat anti-mouse IgG,

10 Měření objemu hipokampu 13 řezů z každého hodnoceného mozku - každý 6.řez od objevení obou molekulárních vrstev gyrus dentatus, tj. cca 2,3 mm dorsálně od bregmy obarveno toluidinovou modří Objemy hipokampů měřeny pomocí softwaru Stereo Investigator (MBF Bioscience). Vkaždém řezu měřen průměrný objem gyrus dentatus, CA1-3 a celého hipokampu z obou hemisfér.

cca 2,3 mm dorsálně od bregmy obarveno toluidinovou modří Objemy hipokampů měřeny pomocí

11 Stanovení BDNF Preparace prefrontálního kortexu a hipokampu Homogenizace tkáně, extrakce extrakčním pufrem, centrifugace Stanovení koncentrace BDNF ELISA kitem

12 Mgr. Michala Kolářová Mgr. Lenka Hromádková

13 Tauprotein andad Tau protein stabilizuje mikrotubulovou síť v axonech a přispívá k správné funkci neuronů Patologický tau protein (modifikovaný hyperfosforylací, zkrácením, oligomerizací...) se odděluje od mikrotubulů a agreguje do NFT => dochází k narušení funkce neuronů až jejich zániku Oddělený tau protein může procházet do MMM, kde dochází k dalším modifikacím

14 Příprava tau proteinu V bakteriích E. coli s transformovanou c-dna kódující lidský tau protein Extrakce z bakterií sonikací Purifikace: afinitní chromatografie;iontová chromatografie; gelová chromatografie Máme k dispozici c-dna pro "full-lenght" a 2 zkrácené formy

z bakterií sonikací Purifikace: afinitní chromatografie;iontová

15 Varianty tau proteinu Tau se vyskytuje v mozku lidí s AD v různých formách: Zkrácené Nadměrně fosforylované Oligomerizované, agregované K dispozici máme c-dna pro 2 zkrácené formy tau. Hyperfosforylované a oligomerizované formy tau se dají připravit "in vitro"; navázána spolupráce s Univerzitou v Pardubicích (Mgr. Lenka Procházková) pro jejich přípravu (s použitím imobilizovaných enzymů na magnetických mikročásticích).

Hyperfosforylované a oligomerizované formy tau se dají připravit "in vitro"; navázána spolupráce s

16 Aplikace (animální modely) Imunizace králíků suspenzí tau proteinu Imunopurifikace polyklonálních králičích protilátek pro stanovení tau v mozko-míšním moku Aplikace různých forem tau potkanům - simulace AD Měření kognitivních funkcí, změn exprese a aktivity machr, nachr, AChE, ChAT

v mozko-míšním moku Aplikace různých forem tau potkanům - simulace AD

17 Aplikace (biochemický marker) Pacienti s AN zvýšené hladiny tau v MMM Přítomnost modifikovaných forem tau u pacientů s AN/zdravých subjektů??? Výskyt specifických protilátek v séru proti tau proteinu u pacientů s AN???

18 Doc. MUDr. Aleš Bartoš, PhD

19 Spolupráce s AD centrem PCP, FNKV a 3LF UK Databáze cca 400 seniorů Repozitorium MMM a krevního séra

20 Databáze pacientů AD centra Cca 400 seniorů,různá neuropatologie nebo zdraví, z toho cca 20% s diagnózou AD Psychologická vyšetření (celková kognitivní výkonnost, paměťové schopnosti, řečové schopnosti a další symbolické funkce, vizuospaciální funkce, exekutivní funkce Zobrazovací metody (SPECT, EEG, MR) Biochemická vyšetření MMM (amyloid, tau, fosfo-tau) Post-mortem pitevní nálezy

schopnosti a další symbolické funkce, vizuospaciální funkce, exekutivní funkce Zobrazovací

21 Imunochemická vyšetření (auto)protilátek Zvýšený rozpad nervových buněk u AD vede ke změnám v koncentraci některých proteinů možná autoimunitní odpověď tau protein lehké řetězce neurofilamentů těžké řetězce neurofilamentů amyloid

22 Intrathekální syntéza IgG

Podobné dokumenty

Modul IB. Histochemie. CBO Odd. histologie a embryologie. MUDr. Martin Špaček

Modul IB. Histochemie. CBO Odd. histologie a embryologie. MUDr. Martin Špaček Modul IB Histochemie CBO Odd. histologie a embryologie MUDr. Martin Špaček Histochemie Histologická metoda užívaná k průkazu různých látek přímo v tkáních a buňkách Histochemie Katalytická histochemie