KOMBINACE CHROMATOGRAFICKÝCH A SPEKTRÁLNÍCH METOD Spojení obou metod - nejúčinnější nástroj pro kvalitativní a kvantitativní analýzu složitých směsí # identifikace látek po předchozí separaci ze složité směsi # strukturní, případně elementární analýza složek směsi # zlepšení kvality a citlivosti kvantitativního stanovení Možnosti spojení OFF-LINE - starší metoda, eluát z kolony se jímá do frakcí a po úpravě (odpaření rozpouštědla apod.) se frakce analyzují spektrálními metodami ON-LINE # zvýšené požadavky zvl. na rychlost snímání spekter (řádově ms), možnost rekonstrukce celého chromatogramu a jeho spektrálního profilu. Při pomalém snímání spekter technika "stop flow" se zachycením eluované zóny v cele detektoru # dostatečná citlivost spektrometrů pro získání použitelných spekter. Kombinace vhodné konstrukce detektorové cely, principu detekce (FTdetektory) a zvýšení účinnosti separace pro minimální rozmývání zón látek # možnost provozovat detektor jako průtočný systém - konstrukce nových systémů speciálně pro použití jako deteční systémy (optické uspořádání, velikost cely, rotace kyvety při měření NMR spekter) # kompatibilita mobilní fáze pro separaci s použitou detekční metodou (nejméně problémů s LC-UV, LC-FL), nutnost odstranit přebytek nosného plynu nebo mobilní fáze (spojení s MS) Kritéria použitelnosti kombinovaných metod schůdnost (dostupnost) kombinace cena
informační hodnota výstupních dat:
identifikace: MS a IČ > NMR > UV-VIS > FL strukturní informace: NMR > IČ >UV-VIS, FL stanovení mol. h.: MS > NMR > UV-VIS element. složení, selekt. detekce: MS > AES > AAS Používanost jednotlivých spojení GC/MS identifikace, struktura, m. h., element. analýza, selektivní detekce, typová analýza rutinní, drahé LC/UV-VIS sel. analýza, čistota píků, (identifikace) rutinní, poměrně levné GC/FTIR identifikace (izomery), selektivní detekce (struktura), typová analýza rutinní, drahé LC/MS jako u GC/MS, polární látky, biopolymery začíná rutinní využití, poměrně drahé GC/AES selekt. detekce, typová analýza dosti drahé LC/IR, TLC/IR jako u GC/FTIR, málo těkavé látky; semikontinuální interface ve vývoji
Spojení plynové chromatografie s hmotnostní detekcí Problém: převod tlaku na koloně (atmosférický tlak) na tlakové poměry ve hmotnostním analyzátoru (cca 10-3 - 10-5 Pa podle typu) a redukce toku nosného plynu z kolony (náplňové kapilární) Hmotnostní spektrometry s magnetickým a elektrickým sektorem (dvojí fokusace) - vyšší vakuum, vyšší rozlišovací schopnost, delší doba snímání spektra (řádově s) Kvadrupólové hmotnostní filtry - nižší vakuum (10-3 Pa), rychlé měření spektra, nižší rozlišovací schopnost. Používají se častěji pro spojení s GC (rychlost, nižší cena, nižší vakuum, snadné spojení s kapilárním GC) Interface mezi GC a MS - slouží ke spojení výstupu z kolony a vstupu hmotnostního detektoru. Různé konstrukce podle typu kolon (náplňové, kapilární). Přímé spojení GC s MS - propojení krátkou kapilárou, pro kolony s malým průměrem (do 0.2 mm), nároky na vakuové pumpy, modifikací je zapojení s otevřeným děličem toku (open split interface, OSI) - vyrovnání tlakový poměrů mezi kolonou a detektorem
Molekulové separátory - pro odstranění většího množství nosného plynu (plněné kolony) nebo pro detektory s magnetickým ananalyzátorem Tryskový separátor podle Ryhage - separace na základě vyšší setrvačnosti molekul analytů než nosného plynu, který je odsáván. Konstruovány jako dvoustupňové. Až 80ti násobné obohacení při výtěžku až 70 % Efúzní separátor - porézní skleněnou trubicí difundují lehčí molekuly nosného plynu snáze ven než těžší molekuly analytů. Výtěžky a obohacovací faktory podle m.h. Obohac. faktory až 170 a výtěžky okolo 30 % při dvoustupňovém uspořádání Difúzní separátory - polopropustnou membránou difundují do iontového zdroje snáze molekuly organických látek než molekuly nosného plynu Diskriminace určitých iontů připoužití separátorů s výtěžky menšími než 100%.
Možnost použít běžné hmotnostní detektory s vhodným interface, nebo detektory speciálně konstruované pro spojení s GC (MSD) - zjednodušené, levnější, menší (na stůl), rychlé získání spektra. Možnost pracovat v režimu TIC (total ion current) - zvýšení citlivosti proti módu se záznamem spekter, nebo v módu SIM (selected ion monitoring) - detekce pouze vybraných několika m/z, charakterizujících určité látky, ještě vyšší citlivost než TIC. Detektor na principu iontové pasti (ion trap) Vychází z principu kvadrupólového analyzátoru, uvnitř je vytvořeno hyperbilické elektrické pole. Ionizované fragmenty jsou uchovávány ve střední dutině a postupně jsou z dutiny vymrťšovány podle rostoucí hmotnosti na sběrnou elektrodu násobiče elektronů. Citlivost pro snímání spekter stejná jako u kvadrupólového detektoru v režimi SIM, rychlé snímání spektra.
Spojení vysokoúčinné kapalinové chromatografie s hmotnostní detekcí Větší technické potíže při spojení LC/MS než u GC/MS - podstatně větší přebytek mobilní fáze, který je nutno odstranit Různé konstrukce interface mezi kapalinovým chromatografem a hmotnostním detektorem Přímý vstup eluátu (DLI) - celý objem eluátu nebo jeho část se zavádí do iontového zdroje kvadrupólového spektrometru. Přímé napojení lze použít poze pro náplňové mikrokolony a kapilární kolony s průtokem 10 µl/min a méně, jinak je nutný dělič toku, např. diafragma s malým otvorem 5-15 µm (využije se je okolo 1% eluátu z kolony). Spojení s transportním převodníkem na principu nekonečného drátu. Na vyhřívaný drátek je kontinuálně nanášen eluát z kolony, po odpaření rozpouštědla je látka transportována do do iontového zdroje, kde po ohřátí na 200-300 C se látka odpaří a je ionizována. Drátek je schopen přijmout asi 10 µl/min eluátu z kolony. Modifikací je náhrada drátku nekonečným páskem, vyšší výtěžek převodu vzorku (40 %) a možnost zpracovávat až 1 ml/min m.f. z kolony, nebo použití zmlžovače pro dokonalejší pokrytí pásu eluátem.
Techniky využívající ionizaci za atmosférického tlaku Ionizace reakčním plynem za atm. tlaku (APCI) - k ionizaci reakčního plynu (amoniak) se používá fólie 63 Ni jako zdroje elektronů nebo koróna na pomocné elektrodě. Elekrosprejová ionizace (ESI) - eluát z kolony je veden do pneumatického zmlžovače, na který je přivedeno vysoké napětí. Kapičky se nabíjejí a při odpařování roste hustota náboje na jejich povrchu a dochází k ionizaci. Ionty procházejí tryskou do vstupu hmotnostního detektoru (kvadrupól). Získá se hl. molekulový pík, fragmentace velmi malá. Šetrná ionizace hl. pro termolabilní látky.
Termosprejová ionizace (TSI) - eluát z kolony je veden do vyhřívané trysky, kde se určitý podíl m.f. odpaří. Vzniklá mlha je vedena do vyhřívaného iontového zdroje, kde se odpaří zbytek m.f. a na kapičkách vzroste povrchový náboj a dochází k ionizaci a ionty jsou vypuzovány odpuzovací elektrodou do hmotnostního detektoru. Možnost analyzovat termolabilní, netěkavé a silně polární látky. Možnost přidávat vhodný elektrolyt do m.f. k ionizaci těžko ionizovatelných látek (octan amonný, acetonitril) Particle beam (PB) - základem je spojení monodisperzního zmlžovače s dvoustupňovým separátorem. Kapičky (10 µm) aerosolu s heliem vstupují do desolvatační komory kde se odpaří rozpouštědlo. Ve dvoustupňovém separátoru se oddělí molekuly analytu od helia a mobilní fáze a jsou transportovány do iontového zdroje (ionizace EI nebo CI). Možnost použít všech běžných m.f. Možnost analyzovat tepelně nestálé a málo těkavé látky (cukry, steroly, aflatoxiny).
Ionizace svazkem neutrálních atomů (FAB) - ionizace svazkem atomů xenonu, ionizace probíhá ve viskózním kapalném prostředí (glycerol, thioglycerol, 3-25 %), které se účastní procesu ionizace a stabilizuje vzniklé ionty. Nevýhodou vysoké pozadí z matrice - potlačení uspořádáním LC/FAB-MS-MS. Možnost snímat spektra labilních biomolekul - fosfolipidy, nukleotidy, peptidy. Vhodnost různých technik LC/MS podle požadavků typ LOD vhodnost různá málo netěkavé/ rozsah LC/MS pro LC rozpouš- těkavé termolab. mol. hm. průtok tědla látky látky DLI ** * *** **** ** ** pás ** ***** ***** ***** * *(*) TSP **(**) ***** **** ***** ***(*) ***(*) LC/FAB **(**) * *** **** ***** **** PB ** ***(*) **** ***** *(*) *(*) ESI ****(*) * **(*) **** ***** *****
Spojení plynové chromatografie s FTIR Získání informací o přítomnosti funkčních skupin v molekulách separovaných látek - struktura i identifikace. Nutnost použít IČ detektor s Fourierovou transformací - rychlé sejmutí spektra na základě měření interference paprsků (450 rychlejší než klasické techniky). Získaný interferogram se FT převede do souřadnic T (A) na λ (ν). Použití vysoce citlivých detektorů na bázi deuterovaného glycinsulfátu nebo teluridu rtuťnato-kademnatého. Počítačové zpracování signálu. Nedestruktivní detektor. Možnost tandemového uspořádání GC/FTIR/MS - největší zdroj informací o analyzovaných látkách.
Spojení HPLC s FTIR Problémem interference mobilní fáze při snímání spekter - nutnost (až na výjimky - měření při konkrétní vlnové délce) jejího odstranění. Některé přístroje už komerčně dostupné. Interface - dva druhy - převodníky na bázi kontinuálního průtočného extraktoru. Silné rozmývání zón - transportní převodníky ve spojení s FTIR v úpravě pro reflexní měření. Uspořádání pro zachycování eluátu na disk nebo na nekonečný pás. Po odpaření rozpouštědla snímání IČ spekter reflexní technikou. Možnost použít různé mobilní fáze vodné i nevodné Možnost reflexní technikou snímat i spektra látek separovaných na tenké vrstv ě. Spojení HPLC s UV/VIS Poměrně málo informací ze spekter, porovnávání s knihovnou standardů. Podstatně levnější než kombinace LC/MS nebo LC/FTIR 2 typy detektorů: - rapid scannig detektor - s rotující mřížkou monochromátoru, rychlost snímání spektra okolo 0.1 s, není nutné zastavovat průtok m.f. - diode array detektor - nemá monochromátor, po průchodu celou detektoru se záření rozkládá holografickou mřížkou a dopadá na pás fortodiod (až 500 i více), pokrývající celou UV, příp. VIS oblast. V každém okamžiku se sejme celé spektrum. Výhodou proti předch. typu nezkreslená spektra pohybem mřížky. Nevýhodou poněkud menší citlivost než u detektorů s monochromátorem. Možnost využít poměru absorbancí při dvou vlnových délkách pro zjištění čistoty píků.
Spojení HPLC s FL Některé látky samy fluoreskují, u jiných příprava předkolonových nebo postkolonových derivátů. Monochromátory pro excitační i emisní záření - získání emisních a excitačních spekter. Vedle deuteriové výbojky k buzení fluorescence se používá lampa s xenonovým obloukem a ve spec. případech laser. Spojení GC s AED Získání kvalitativních a semikvantitativních údajů o struktuře molekuly analytu. Plazmové zdroje atomizace a excitace - mikrovlnně vázané plazma. Emitované záření se rozkládá buď hranolovým nebo mřížkovým monochromátorem - možnost měření pouze při jedné vlnové délce. Lepší rozklad emitovaného záření holografickou mřížkou a detekce diodovým polem - možnost paralelní detekce na více vlnovách délkách pro různé prvky (až čtyři naráz, každý na více vlnových délkách) Celkem možno detegovat asi 15 prvků. Použití pro analýzy polutantů v ž. p. - Cl, Hg, S, P. Spojení LC/AAS K selektivní detekci sloučenin s určitým prvkem, nejčastěji organokovové sloučeniny. M.f. se vede přímo do zmlžovače AAS. Hlavně stanovení Hg, Sn v organokovových sloučeninách a lécích.