Adhese a růst lidských kostních buněk v kulturách na vrstvách fullerenů C 60 Lucie Bačáková, Lubica Grausová Fyziologický ústav AVČR, Praha Jiří Vacík Ústav jaderné fyziky AVČR, Řež u Prahy Václav Švorčík Vysoká škola chemicko-technologická, Praha Alexander Kromka Fyzikální ústav AVČR
Fyziologický ústav Akademie věd ČR Odd. růstu a diferenciace buněčných populací Vídeňská 1083 142 20 Praha 4 - Krč Tel: +420 2 9644 2521, 2523, 2572 Fax: +420 2 4106 2488 E-mail: lucy@biomed.cas.cz
Laboratoř buněčných kultur Samostatná místnost pro přípravu buněčných kultur Box s laminárním prouděním vzduchu a UV světlem Nádobky na kultivaci buněk Inkubátor (37 o C, 5% CO 2 ) Kultivační médium Laminární box Cytosafe pro práci s nanočásticemi
Laboratoř buněčných kultur Horkovzdušný sterilizátor a autokláv Analyzátor počtu a životaschopnosti buněk Inverzní mikroskop s fluorescencí, digitální kamerou a analýzou obrazu
Metodika buněčných kultur Založení explantační metodou Založení enzymatickou disociací 2. den po nasazení (obj. 10x) 1. den po nasazení (obj. 10x) 7. den po nasazení: monolayer i multilayer, tzv. kopce a údolí (obj. 20x) 7. den po nasazení: konfluentní monolayer, dlaždicovitá morfologie (obj. 20x) Hladké svalové buňky aorty potkana Cévní endotelové buňky
Laboratoř imunocytochemie Imunofluorescenční barvení & Enzymatická imunosorbentní esej (ELISA) Imunofluorescence talinu, proteinu fokálních adhesí, jádra dobarvena propidium iodidem ELISA Reader Victor Absorbance (% of the value on PS) Imunofluorescence cytoskeletárního proteinu β-aktinu, jádra dobarvena barvivem Hoechst 33342 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 Vinculin PS TER 2S 4S 6S 8S ELISA vinkulinu, proteinu fokálních adhesí, v kostních buňkách na kompozitech polymeruhlíkové nanotuby *
Deposice vrstev fullerenů C 60 Kulatá mikroskopická krycí skla, Menzel Glaser, Německo Průměr 12 mm Vakuový deposiční systém Univex 300 ÚJF AVČR, Řež u Prahy Kontinuální vrstvy Tenká: 505 ± 43 nm Tlustá: 1090 ± 8 nm Mikrostrukturované vrstvy (deponované přes kovovou mřížku) Tloušťka pod oky mřížky: 484 ± 5 nm Tloušťka pod kovovými přepážkami: 158 ± 5 nm (Měřeno pomocí AFM na VŠCHT)
Morfologie mikrostrukturovaných vrstev fullerenů 100 µm Kovová mřížka a odpovídající měřítko, ÚJF AVČR Optická mikroskopie, VŠCHT Praha 484±5 nm 158±5 nm Světelná mikroskopie, FgÚ AVČR, Cca 125 x 105 mikrometrů = analysa obrazu Tescan Atlas 13 125 µm 2 16 000 ± 500 µm 2, vzdálenost 50 µm
Morfologie lidských kostních buněk na fullerenových vrstvách Kontinuální, 505±43 nm Polystyrenová kultivační miska Mikrostrukturovaná, 484 ± 5 a 158±5 nm Mikroskopické krycí sklo Kontinuální, 1090 ± 8 nm Buněčná linie MG 63 Nativní kultury v médiu DMEM+10% FTS 5. den po nasazení Inversní mikroskop Olympus IX 50, obj. 20x Digitální kamera DP 70
Kinetika růstu lidských kostních buněk na fullerenových vrstvách Log cell number / cm 2 100000 10000 1000 Growth curves of MG 63 cells 0 1 2 3 4 5 6 Days after seeding Polystyrene Glass Full_thin Full_domains Full_thick
Lidské kostní buňky na mikrostrukturovaných fullerenových vrstvách % of domain area or cell number 70 60 50 40 30 20 10 0 Colonization of fullerene domains by MG 63 cells Day 1 Day 3 Day 5
Imunofluorescenceβ 1 -integrinových adhesních receptorů Lidské kostní buňky linie MG 63 3. den po nasazení Fixace 70% etanolem Kontinuální, 505 ± 43 nm Kontinuální, 1090 ± 8 nm Inversní mikroskop Olympus IX 50 Obj. 20x Digitální kamera DP 70 Mikrostrukturovaná, 484 ± 5 a 158±5 nm Mikroskopické krycí sklo
Imunofluorescence cytoskeletárního proteinu β-aktinu v lidských kostních buňkách linie MG 63 Kontinuální, 505 ± 43 nm (obj. 20x) Mikrostrukturovaná, 484 ± 5 a 158 ± 5 nm Kontinuální, 1090 ± 8 nm Mikrostrukturovaná vrstva, obj. 100x
Imunofluorescence osteopontinu, markeru osteogenní diferenciace Lidské kostní buňky linie MG 63 3. den po nasazení Fixace 70% etanolem Kontinuální, 505 ± 43 nm Kontinuální, 1090 ± 8 nm Inversní mikroskop Olympus IX 50 Obj. 10x Digitální kamera DP 70 Mikrostrukturovaná, 484 ± 5 a 158±5 nm Mikroskopické krycí sklo
Smáčivost fullerenových vrstev Kontaktní úhel vodní kapky: Kontinuální vrstva tenká (505 ± 43 nm): 100,6 ± 6,8 Kontinuální vrstva tlustá: (1090 ± 8 nm): 96,7 ± 1,7 Mikrostrukturovaná vrstva (484 ± 5 a 158 ± 5 nm): 95,3 ± 3,1 (Měřeno na Fyzikálním ústavu AVČR, dr. A. Kromka) Surface Energy Evaluation System (SEE System), vyroben na Masarykově universitě, Brno, máme na FgÚ AVČR
Shrnutí Vrstvy fullerenů C 60 podporovaly adhesi a růst lidských kostních buněk linie MG 63 v míře podobné jako na standardních kultivačních površích (sklo, polystyren) Bylo tomu tak i přes relativně vysokou hydrofobicitu povrchu Zřejmě se příznivě uplatnila nanostruktura povrchu i jeho určitá pohyblivost způsobená migrací fullerenů Postupné mizení mikrostruktury povrchu titititititiititititititititititititititititititititititi titititititititititititititititititititititititititititit ititititititititititititiitiitititititititititititittitii ttiittiitititittitiittitiiititititititititiiiitittiitititi iitiiitittitititititititititititititititititititititititi titititititititititititititititititititititititititititit it
The papers presented at NanoSMat07 will be selected to publish in a special issue of JOURNAL OF NANOSCIENCE AND NANOTECHNOLOGY (American Scientific Publishers). Impact factor 1.932
Dynamický průtokový kultivační systém Pumpa Reservoáry média Firma Oligene GmbH (nyní Provitro GmbH), Berlin Manipulace se systémem v laminárním boxu Komora se vzorkem materiálu a buněk Tube chamber pro tubulární struktury (cévní náhrady) Pumpa a Flow chamber pro planární vzorky
Dynamický průtokový kultivační systém, Oligene, Německo - pokračování Perfusion chamber pro 3D porézní vzorky či vzorky ve formě prostorových sítí ( scaffolds ) Dynamický rotační kultivační systém, Synthecon, Lucembursko
Dynamická kultivace a konfokální mikroskopie Lidské kostní buňky linie MG 63 na: PLGA scaffold vláknitý PLGA scaffold porézní PLGA scaffold porézní Cévní endotelové buňky na klinicky užívaných cévních náhradách Laserový konfokální mikroskop Leica
Tým Oddělení růstu a diferenciace buněčných populací Doc. MUDr. Vladislav Mareš, DrSc. Mgr. Martin Pařízek Mgr. Elena Filová Věra Lisá, prom. biol. MUDr. Jaroslav Chlupáč Doc. MUDr. Vladislav Mareš, DrSc. MUDr. Lucie Bačáková, CSc. Barbora Vagaská MUDr. Jaroslav Chlupáč Ivana Zajanová Ľubica Ľubica Grausová Grausová Mgr. Elena Filová Ivana Zajanová Mgr. Martin Pařízek Věra Lisá, prom biol. MUDr. Lucie Bačáková, CSc.
(Králík Šešulka, náš maskot)