Příprava materiálu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253

Příprava materiálu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253 Část 8 Detektory Úvodní informace Detektor musí být schopen zaregistrovat okamžik průchodu analytu vystupujícího z kolony. Musí být tedy schopen nějakým způsobem registrovat změnu ve složení mobilní fáze, transformovat ji do formy elektrického signálu a prezentovat ji jako rozdíl oproti základní linii. Ideální detektor by: (a) neměl být závislý (míněna jeho odezva) na změně teploty nebo složení mobilní fáze; (b) měl být schopen detekovat malá množství látek (stopová analýza); (c) měl buď dávat stejný signál pro všechny eluované látky nebo jen pro látky, které jsou předmětem zájmu, měl by tedy být buď univerzální nebo selektivní; (d) neměl přispívat k rozmývání píků, měl by mít malý objem; (e) měl mít rychlou odezvu na analyt a tedy by měl být schopen registrovat úzké píky; (f) měl být jednoduchý na obsluhu, robustní a levný. Tyto požadavky jsou v plném rozsahu nedosažitelné prakticky a splnění některých z nich vylučuje splnění jiných požadavků. Takže je vhodnější se na detektory dívat spíše pomocí následujících hledisek. 1

Koncentrační nebo hmotnostní citlivost detektoru Koncentračně citlivé detektory poskytují signál, S, přímo úměrný koncentraci, c, analytu v mobilní fázi: Hmotnostně citlivé detektory dávají signál úměrný hmotnostnímu toku analtu detektorem, tj. číslu, n, analytu nebo iontů za jednotku času, t: Typ detektoru se dle tohoto kritéria pozná vypnutím průtoku na koloně v okamžiku maxima píku v detektoru; v případě koncentračně citlivého detektoru zůstane hodnota signálu bezezměny a pro hmotnostně citlivý detektor poklesne na základní hladinu. Kromě elektrochemického, rozptylového, vodivostního a fotovodivostního deteltkoru jsou všechny ostatní v Section 6.2-6.7 koncentračně citlivé. Selektivita Neselektivní detektory reagují na kolektivní vlastnosti roztoku procházejícího detektorem. Detektor na bázi měření indexu lomu měří index lomu mobilní fáze. Index lomu mobilní fáze je odlišný od indexu lomu mobilní fáze obsahující analyt. Detektor registruje uvedenou změnu a na jejím základě detekuje prakticky všechny analyty, proto se označuje jako neselektivní. Je to také důvodem toho, že tento detektor, podobně jako vodivostní detektor, se nedá použít v gradientové eluci. Naproti tomu UV detektor měří jen látky absorbující UV záření a patří mezi selektivní detektory. Šum Při zvětšení signálu detektoru je vidět, že základní linie vykazuje nepravidelnsoti, i když se neeluuje analyt. Vysokofrekvenční (krátkodobý) šum (obrázek níže (a)) bývá vyvolán nesprávným uzemněním detektoru nebo celého systému. Ale nízká úroveň šumu zůstane i po dobrém uzemnění. Nízkofrekvenční šum osciluje s pomalejší nízkou frekvencí (dlouhodobý) šum (obrázek níže (b)). 2

Obecně platí, že mobilní fáze je nejdůležitejším faktorem způsobujícím šum (nečistoty, bubliny, stacionární fáze, změny průtoku), ale i rychlé změny okolní teploty mohou mít vliv (když je detektor nevhodně umístěn). I poruchy vyvolané zdrojem při přepínání termostatu mohou být příčinou šumu a tehdy je vhodné aplikovat nízkofrekvenční filtr. Někdy je dobrým řešením zkonstruování Faradayovy klece z hliníkové fólie. Limit detekce Nejmenší detekovatelný signál nemůže být menší než dvojnásobek výšky největšího píku signálu šumu. Pokud je nastříknuté množství menší, je signál srovnatelný se šumem a není od něj rozlišitelný. Pro kvalitativní analýzu by poměr signál/šum (S/N) neměl být nižší než 3-5 a pro kvantitativní analýzu 10. Tvrzení typu, že detektor X je schopen detekovat i 1 ng benzenu je třeba přijímat opatrně. Uvedené množství může být ovlivněno mnoha limitními faktory a trvzení, že detekční limit je 1 ng ml -1 je správnější pro případ koncentračně citlivých detektorů. Drift základní linie Drift popisuje odchylku základní linie v času a projevuje se ve formě směrnice chromatogramu (obrázek níže). Drift je běžný při zapnutí detektoru. Ovšem po dosažení pracovní teploty elektroniky a optiky detektoru je základní linie rovnoběžná s osou x, pokud se nedějí následující věci: (a) gradientová eluce (mění se index lomu mobilní fáze a to mohou některé UV detektory registrovat); (b) předchozí mobilní fáze není dostatečně vymyta novou mobilní fází po změně jejího složení; (c) změna složení mobilní fáze (odpaření, příliš intenzivní odplyňování heliem); (d) změna okolní teploty. 3

Lineární dynamický rozsah Ideální detektor poskytuje signál přímo úměrný nastřikovanému množství analytu nezávisle na nastříknutém množství. V praxi je tento rozsah vždy omezený, ale čím je větší, tím je to výhodnější. Směrnice přímky v níže uvedeném frafu je známa jako odezva a představuje rozsah, ve kterém reaguje detektor na změnu koncentrace analytu. Lineární dynamický rozsah UV detektoru je větší než detektoru refraktometrického a je kolem 1: 10 000, to např. znamená, že horní limit 5 x 10-4 g ml -1 odpovídá dolnímu limitu 5 x 10-8 g ml -1. 4

Časová konstanta Časová konstanta, τ, má vztah k rychlosti sběru dat detektorem. Tento parametr je velmi důležitý. Časová konstanta by při velmi rychlé HPLC s úzkými píky neměla být větší než 0.3 s a pro UHPLC (UPLC) než 0.1 s. Příliš malá časová konstanta může zvětšovat šum detektoru, ale naopak příliš dlouhá časová konstanta vede k rozšíření a chvostování píků (obrázek níže). Kvalitní detektory mají časovou konstantu nastavitelnou. Objem cely detektoru Objem cely by měl jen minimálně přispívat k rozšiřování píku a prakticky by měl být menší než 10% elučního objemu nejužšího, tedy nejdříve eluovaného, píku. Objem standardní UV cely bývá kolem 8 µl. Na druhou stranu příliš malý objem cely zhoršuje detekční limit, protože jisté množství analytu je v cele potřebně, aby byla možná detekce. Pro mikrohplc cela musí být výrazně menší než 8 µl. Cela také musí mít vhodný tvar, protože analyt v cele nesmí být nijak zadržován při pruodění mobilní fáze. Tlak generovaný na koloně je za kolonou daleko nižší. Je tedy nebezpečí vytváření bublin v mobilní fázi a je třeba se s tím vypořádat. Proto je dobré za detektor zapojit nerezovou nebo PEEK kapiláru, aby se v detekční cele vytvořil malý tlak (1-2 bar), je ale současně nutné, aby tlak nepřekročil limit instrumentu. Na trhu jsou UV detektory, které snesou tlak až 150 bar. 5

Poznámka: pokud je v mobilní fázi přídavek malého množství podstatně polárnějšího aditiva než je mobilní fáze (např. 1% ethanolu v hexanu), pak se v detekčním okénku může vytvořit film polární látky. Eluování polární látky z kolny při separaci vzorku může tento film uvolnit a vyvolat vznik falešného ghost píku v chromatogramu. Optické detektory a) UV detektory Jedná se o nejběžnějším detektor, protože je citlivý, má velký lineární dynamický rozsah, je málo ovlivňován fluktuacemi teploty a je kompatibilní s gradientovou chromatografií. Je schopen měřit látky absorbující ultrafialové a/nebo viditelné záření. Absorpce je pozorována pro záření nad 200 nm pokud molekula má alespoň: (a) dvojnou vazbu sousedící s atomem nesoucím volný elektronový pár, X=Y-ZŶ (např. vinyl ether); (b) brom, jod nebo síru; (c) karbonylovou skupinu, C=O; a nitro skupinu NO 2 ; (d) dvě konjugované dvojné vazby, X=X-X=X; (e) aromatický cyklus; (f) některé anorganické ionty: Br -, I -, NO 3 -, NO 2 -. Tyto skupiny absorbují záření různě a při odlišných vlnových délkách. Absorpce a vlnová délka v maximu absorpce je navíc závislá na sousedních skupinách v molekule. Molární absorpční koeficient, ε, je měřítkem míry absorpce záření látkou a tyto koeficienty mohou být nalezeny v mnoha tabulkách a příručkách. Např. aromáty mají obecně vyšší absorpční koeficienty než ketony. Množství absorbovaného záření je závislé na molárním absorpčním koeficientu, ε, dále na molární koncentraci analytu, c, a na rozměrech, délce, měrné cely, d. Součin poskytuje absorbanci, A: A = εcd A je bezrozměrné číslo a absorbance rovna 1 bývá (dosti nesprávně) vyjadřována jako 1 absorpční jednotka (AU). UV detektor měří absorbanci eluované mobilní fáze. Mobilní fáze by neměla absorbovat záření emitované lampou detektoru, nebo by je měla absorbovat jen co nejméně, aby bylo 6

možné elektronicky vykompenzovat základní linii. Podle výše uvedené rovnice je výška píku funkcí molárního absorpčního koeficientu a koncentrace eluovaného analytu procházejícího celou detektoru. Protože signál je funkcí délky cely, d, měla by cela být co nejdelší, bývá to ve skutečnosti kolem 10 mm. Na druhou stranu cela musí být co nejmenší kvůli snížení negativního vlivu na rozšiřování píku mimokolonovým objemem. Níže uvedený obrázek znázorňuje schematicky typické uspořádání UV-VIS detektoru. Požadovaná vlnová délka je vybrána pomocí mřížky. Křemenná destička je umístěna před celou a odráží část záření na referenční fotodiodu. Referenční dioda slouží k odstranění fluktuacích světelného toku, ke které může docházet. Detekční cela také musí mít vhodný tvar, aby signál byl pokud možno co nejméně ovlivněn změnou indexu lomu mobilní fáze při gradientové eluci. Nejčastěji se jako zdroj záření používají dvě lampy. Deuteriová lampa vyzařuje kontinuální spektrum (až do zhruba 340 nm, rozptýlené světlo do 600 nm). Použitá vlnová délka je vybrána tak, aby odpovídala maximální absorbanci detekované látky, vhodná volba vlnové délky může navíc někdy umožnovat poměrně selektivní detekci analytu za současné eliminace signálu interferující látky, pokud tato látka při vybrané vlnové délce neabsorbuje. Obrázek níže srovnává neselektivní (jsou detekovány všechny peptidy, 210 nm) a selektivní detekci (jsou detekovány jen aromatickou strukturu obsahující peptidy, 280 nm). 7

Wolframová-halogenová lampa emituje blízké-uv a viditelné záření (přibližně 340-850 nm) je ideální pro doplnění deutriové lampy pro pokrytí celé oblasti UV-VIS záření. Spektrální šíře bývá širší než u UV-VIS spektrometrů, v praxi kolem 10 nm (to znamená, že záření vstupující do cely detektoru není monochromatické, pokrývá například 280-290 nm, pokud je zvolena vlnová délka 285 nm). Výhoda spočíva ve větší intenzitě vstupujícího záření do cely a v důsledku vyšší detekční citlivosti. Spektrální šířka ale nesmí být přiliš velká, to by vedlo ke snížení lineárního dynamického rozsahu. Dnes se již téměř nesetkáme s detektory s fixní vlnovou délkou. Používaly rtuťové (254 nm), kadmiové (229 nm) a zinkové lampy (214 nm). b) Refraktometrické detektory Detektory založené na registraci indexu lomu eluentu, tedy refraktometrické detektory (RI), jsou neselektivní a často doplňují UV-VIS detektory. Tyto detektory registrují všechny eluující se zóny mající odlišný index lomu než mobilní fáze. Signál je tím větší, čím je větší odlišnost indexů lomu mobilní fáze a látky eluované. Detekční limit je tak možné zlepšit vhodnou volbou mobilní fáze. RI detektory jsou zhruba 1000x méně citlivé než UV detektory (detekční limit kolem 5 x 10-7 g analytu na mililitr za vhodných podmínek versus zhruba 5 x 10-10 g ml -1 v případě UV detektoru). Vzhledem k závislosti indexu lomu na teplotě, zněna asi o 5 x 10-4 jednotky na jeden C, je nutno detekční celu termostatovat, zejména při průtoku nad 1 ml min -1. Cela je proto umístěna do kovového bloku s velkou tepelnou kapacitou. Mobilní fáze z kolony nejprve prochází nerezovou kapilárou kde se kapalina temperuje na teplotu detektoru a následně vstupuje do měřící cely (je třeba ovšem současně omezit mimokolovové objemy). 8

Velmi podstatná je i referenční cela naplněná čistou mobilní fází. RI detektory nejsou vhodné pro gradientovou eluci, nicméně případně je možné je i v tomto režimu aplikovat, ale za předpokladu, že v referenční cele se mnění složení mobilní fáze přesně tak, jako v měrné cele. Také je nutné se rozhodně vyhnout kolísání průtoku v cele, protože zhoršuje podstatně šum. Cely v komerčních RI detektorech nesnesou vyšší tlaky a při vystavení zvýšenému tlaku dojde k prasknutí cely. Bylo popsáno několik různých typů RI detektorů, dva jsou nejběžnější. Deflekční (výchylkový) refraktometrický detektor Jeho cela (obrázek níže) je rozdělena přepážkou na dvě části. Jedna část obsahuje referenční kapalinu a druhou prochází efluent z kolony. Směr paprsku světla vycházejícího z cely se změní, pokud se změní složení kapalin (a tím index lomu) v celách. Záření prochází přes masku, dvakrát přes čočku (tam a zpět) a dvakrát dvojitou celou. Když je v měrné cele čistá mobilní fáze, je možno nastavit optickou nulu tak, že paprsek dopadá na štěrbinu před fotocelou. Jakákoliv změna složení roztoku v měrné cele způsobí odchýlení paprsku mimo štěrbinu. Fotodioda změní odpor a vhodný elektrický obvod změní napětí a poskytne odpovídající signál. Interferometrický detektor Světlo prochází přes dělič paprsku kde dojde k rozdělení paprsku na dva paprsky stejné intenzity, jeden pak prochází přes referenční celu a druhý přes měrnou celu a potom jsou oba paprsky na sebe superponovány druhým děličem paprsku za celami a dojde tedy k interferenci paprsků. Jestliže se indexy lomu kapalin v měrné a referenční cele liší, 9

pohybuje se světlo v celách odlišnou rychlostí a dojde k jeho částečnému potlačení ve druhém děliči. Průchod analytu detektorem se tedy projeví jako zeslabení zářivého toku podobně jako u jiných RI detektorů. Interferometr (obrázek níže) je 10 x citlivější než jiné RI detektory. Vysoká citlivost může být i nevýhodná, protože tento detektor je citlivější na fluktuace průtoku a neúplnou kondicionaci kolony. Je nutno pracovat s velkou pečlivostí, pokud má být citlivost detektoru využita. Nejcitlivější cela má objem asi 15 µl a nejmenší cela, méně citlivá, 1.5 µl. c) Fluorescenční detektory Látky fluoreskující nebo látky derivatizované zavedením fluoreskující funkční skupiny jsou velmi selektivně měřeny fluorescenčním detektorem. Citlivost může být až přibližně 1000 x vyšší než pro detekci UV detektorem. Záření o vybrané vlnové délce vstupuje do měrné cely a fluorescenčí záření o vyšší vlnové délce je snímáno v pravém úhlu vzhledem ke vstupnímu záření. Citlivost je zvýšena použitím větší cely (>20 µl). Jednoduché přístroje, jako na obrázku níže, mají pevnou excitační vlnovou délku a pevný rozsah vlnových délek emitovaného záření sbíraného detektorem. Nejpokročilejší modely jsou vybaveny monochromátory, a lze tak nastavit vlnovou délku jak vstupujícího paprsku, tak emitovaného záření. 10

Je třeba se vyhnout přítomnosti nečistot v mobilní fázi, použití nevhodné mobilní fáze nebo přítomnost kyslíku v mobilní fázi, vedou k možnosti zhášení fluorescence. Fluorescenční detektor má lineární dynamický rozsah závislý na konkrétních podmínkách, tzn. složení mobilní fáze, typu vzorku, nečistotách ve vzorku, může být ale obecně poměrně malý. Níže prezentovaný obrázek ukazuje chromatogram, kde je využita fluorescence a UV detekce. d) Rozptylové detektory Odpařovací rozptylový detektor (ELSD) je instrument pro univerzální detekci netěkavých látek. Efluent z kolny je nebulizován proudem inertního plynu za zvýšené teploty. Kapičky jsou sušeny a vznikají pevné částice analytu procházející paprskem laseru (LED) nebo polychromatického světla. Výsledné rozptýlené světlo je detekováno fotodiodou nebo fotonásobičem (obrázek níže). Popis principu ukazuje na to, že mobilní fáze musí být relativně těkavá, včetně pufrů a dalších aditiv, ve srovnání s detekovaným analytem. Těkavé pufry je možno připravit na základě kyseliny octové, mravenčí nebo případně trifluoroctové; musí být ale vysoké čistoty. Gradient grade v tomto případě může být nedostačující. Nebulizační plyn je většinou dusík, případně tlakový vzduch. 11

Odezva detektoru je složitou funkcí nadávkovaného množství analytu a téměř nezávisí na jeho chemickém složení a funkčních skupinách. Základní linie není ovlivňována UV vlastnostmi mobilní fáze, jejím indexem lomu, ani změnami složení mobilní fáze, takže detektor je vhodný pro gradientové separace. Lineární dynamický rozsah je výrazně menší než dynamický rozsah, proto jsou často při reálných měřeních používány nelineální kalibrační závislosti. Detekční limit je asi 10-100x lepší než u RI detektorů, v závislosti na analytu. 12

Elektrochemické (amperometrické) detektory Elektrochemie poskytuje dobré možnosti detekce stopových množství látek snadno oxidovatelných nebo redukovatelných. Detekční limity mohou být až mimořádně nízké a detektory jsou jednoduché a levné. Detekční cela, kde probíhá elektrochemická reakce má tři elektrody (obrázek níže). Mezi pracovní a referenční elektrodou je možno nastavit vhodný rozdíl potenciálů. Proud související s elektrochemickou reakcí je odváděn pomocnou elektrodou, takže neovlivňuje potenciál referenční elektrody. Pracovní elektroda je tvořena skelným uhlíkem, uhlíkovou pastou nebo amalgámovým zlatem. Běžně se jako referenční elektroda používá argent-chloridová elektroda Ag/AgCl. Pomocná elektroda je většinou ocelová. 13

Cyklická voltametrie je schopna odhalit, jaká látka může být detekována elektrochemicky a při jakém nejvhodnějším potenciálu. Aromatické hydroxy- látky, aromatické aminy, indoly, fenothiaziny, thioly lze detekovat oxidativně (při kladném potenciálu). Na druhou staranu reduktivní detekce (při záporném potenciálu) se využívá zřídka, a to z toho důvodu, že těžké kovy (například z ocelových kapilár) a rozpuštěný kyslík mohou vést k problémům. Metoda může být užita pro detekci nitrosaminů a řady polutantů. Mobilní fáze musí být vhodně vybrána, aby podporovala elektrochemický proces. Mobilní fáze musí být vodivá, ale ne nutně vodná; nepolární solventy a adsorpční chromatografie není kompatibilní s elektrochemickou detekcí. Mobilní fáze nesmí obsahovat chloridy nebo hydroxykarboxylové kyseliny. Elektrochemický výtěžek není větší než 1-10%, tj. většina látky odchází z cely nezměněna. 100% konverze je dosažena v tzv. coulometrickém detektoru, ale nemusí být citlivější než amperometrický detektor. Speciální technika je pulzní amperometrická detekce, vhodná pro COH látky a zvlášť pro sacharidy. Uvedené analyty mohou být oxidovány na stříbrné nebo zlaté pracovní elektrodě při vysoké hodnotě ph, ale vznikající produkty otravují povrch elektrody. Proto není potenciál neměnný, naopak mění se v přesně definovaných krocích po 0.1 až 1.0 s. Jeden tento krok je aplikován pro detekci analytu (např. 200 ms) a druhý zase pro očištění povrchu. Pracovní a referenční elektrody jsou náchylné ke kontaminaci a jejich životnost je omezená. Referenční elektroda se vyměňuje po 3 až 12 měsících. Pracovní elektroda se musí čas od času čistit suspenzí aluminy, aby se zbavila kontamintů. 14

Vodivostní detektory Jedná se o typický detektor v iontové chromatografii (IC) měřící vodivost efluentu, ta je úměrná koncentraci detekovaného iontu. Citlivost detekce klesá s nárůstem vodivosti mobilní fáze. Objem cely je velmi malý, asi 2 µl. Dobré vodivostní detektory jsou vybaveny teplotní kompenzací (protože vodivost je silně závislá na teplotě) a elektronickým potlačením vodivosti. Lineální dynamický rozsah není velký. Infračervené detektory Každá organická molekula absorbuje při určité vlnové délce infračervené záření. Pokud je pro detekci využit princip IČ nesmí mobilní fáze při příslušné vybrané vhodné vlnové délce absorbovat IČ záření. Hexan, dichlormethan a acetonitril jsou vhodné mobilní fáze pro detekci esterů, na druhou stranu, ethyl acetát vhodný není. Citlivost není lepší ve srovnání s RI detektory. Nejběžnější vlnové délky jsou shrnuty v tabulce. Laserem-indukovaná fluorescence, LIF Fluorescenci lze vyvolat také zářením laseru. Poměr signál/šum je velmi příznivý, a proto jsou meze detekce velmi dobré. Nicméně, existuje jen několik použitelných vlnových délek, nejnižší je 325 nm (poměrně vysoká). Proto analyt musí být derivatizován vhodnou funkční skupinou (značka). 15

Detektor měřící radioaktivitu 1 Jsou aplikovány především pro β-zářiče 3 H, 14 C, 32 P, 35 S a 131 I. Potřebný scintilátor pro tyto poměrně slabé zářiče je buď v kapalné formě za kolonou a před detektorem míchán do efluentu nebo je aplikován v pevné formě v měrné cele. Spřažené metody a násobná detekce Detektor s diodovým polem může měřit absorbanci efluentu při mnoha vlnových délkách současně. Získává více informací než UV detektor a poskytuje důležitá data pro kvalitativní analýzu neznámých vzorků. Podobně jsou také dostupné elektrochemické detektory pracující při dvou a více různých potenciálech. Dva detektory pracující na různých principech mohou být zapojeny za sebou (obrázek níže), jedním takovým příkladem může být analýza toxických aminů, které se mohou nacházet v potravinách. Ale jen některé aminy vykazují fluorescenci; poměr UV absorpce a fluorescence lze využít pro pozitivní identifikaci píků. 1 A.C. Veltkamp, H.A. Das, R.W. Frei and U.A.T. Brinkman, Eur. Chromatogr. News, 1(2), 16 (1987). For an example see Figure 11.6 with radioactive 14 C. 16

Efluent by měl nejprve procházet přes detektor s menší celou a pak s celou větší, to ale neplatí v případě elektrochemických detektorů, kde dojde k reakci, tam by měl být takový detektor zařazen jako poslední v sérii. Ve speciálních případech mohou být detektory řazeny paralelně za využití děliče toku. Paralelní trojitá detekce katecholaminů je dobrým příkladem, elektrochemický proces je doprovázen dvěma odlišnými derivatizačními metodami a následnou fluorescenční detekcí. Nepřímá detekce Nepřímá detekce je možná všude, kde mobilní fáze sama o sobě má vlastnost selektivně měřenou detektorem. Nejjednodušším případem je nepřímá UV detekce. V tomto případě je užita mobilní fáze absorbující UV záření. Neabsorbující látka procházející detektorem je detekována jako negativní pík, protože celková absorpce bude v okamžiku průchodu látky detektorem menší než samotné mobilní fáze. Mobilní fáze by měla mít absorpci 0.4 pro danou vlnovou délku, pokud má být dosažena maximální správnost při kvantitativní analýze. Pokud je absorbance příliš vysoká (nad 0.8, v závislosti na instrumentu), detektor nepracuje 17

v lineární oblasti a kvantifikace je vyloučena. Existují návody pro volbu činidel pro dané separační problémy. Nepřímá detekce je možná pro všechny selektivní detekční principy, např. fluorescenční detekci (pokud mobilní fáze poskytuje fluorescenci) nebo elektrochemickou detekci (když se mobilní faze účastní elektochemické reakce). Dokonce byla popsána nepřímá detekce na bázi atomové absorpční spektormetrie, kde mobilní fáze obsahovala lithium nebo měď a spektrometr využíval lithiovou nebo měděnou lampu. Pří technice nepřímé detekce jsou vždy pozorovány tzv. systémové píky a ty vyžadují příslušnou pozornost a komplikují interpretaci chromatogramu. Pro kvantitativní analýzu je dobré uvést, že plocha píku je závislá nejen na hmotnosti analytu, ale také na jeho retenčním faktoru, k, (ve vztahu ke k systémového píku) a koncentraci detekovatelné složky mobilní fáze. Detekce využívající spektroskopické a spektrometrické metody HPLC může být kombinována s mnoha analytickými technikami, ale nejdůležitější je spojení s technikami spektroskopickými. Chromatografie a spektroskopie jsou ortogonální techniky, tj. informace, které poskytují jsou vzájemně velmi odlišné a doplňující se. Chromatografie je separační technika a spektroskopie je technika poskytující fingerprint (otisk prstu) molekuly. Spojení s atomovou spektrometrií je málokdy používané, i když umožňuje detekci kovů ve vzorcích ze životního prostředí nebo metaloproteinů. Čtyři další techniky, HPLC- UV, HPLC-FTIR, HPLC-MS a HPLC-NMR jsou významnější, protože pomocí nich jsou získávána spektra umožňující zjištění struktury analytu. HPLC-UV: Detektor s diodovým polem Ve srovnání s konvenčními UV detektory je detektor s diodovým polem založen na inverzní optice. Obrázek níže znázorňuje princip instrumentu. Plné záření nejprve prochází detekční celou a teprve za celou je spektrálně rozděleno na mřížce na jednotlivé paprsky odlišných vlnových délek. Následně paprsky dopadají na diodové pole, které je na čipu a má velký počet (512, 1024) na záření citlivých diod distribuovaných vedle sebe, takže paprsky jednotlivých vlnových délek dopadají na jednotlivé fotodiody. Elektronicky je zpracována informace z celého čipu a je měřeno celé UV-VIS spektrum efluentu současně. 18

Tento detektor poskytuje velké množství informací a možnosti jeho využití jsou různorodé (obrázek níže): (a) Lze získat a uložit spektra jednotlivých píků během chromatografie. Tento proces nezabere více než 0,1 sekundy, takže je možné dostat několik spekter i pro úzké rychle se eluující píky. Spektra mohou být uložena do knihovny a použita při identifikaci analytů. Pro zlepšení porovnání knihovních a měřených spekter se často aplikuje druhá derivace, kde je více maxim a minim než v původním spektru. (b) Znalost spekter měřených látek pomáhá při volbě vhodných vlnových délek pro jejich detekci. Někdy je tak možné eliminovat interferující píky. Volbou vhodných vlnových délek se často dá dosáhnout správné kvantifikace i tehdy, kdy je dělící schopnost systému malá a neumožňuje úplné rozdělení všech složek vzorku. Detekční vlnová délka může být měněna během chromatografie. (c) Současné měření při dvou vlnových délkách se schopno poskytovat poměr absorbancí na těchto dvou vybraných vlnových délkách. Pokud je poměr konstantní přes celý pík, je možno předpokládat, že pík obsahuje jen jednu složku. Pokud poměr konstantní není, je pravděpodobné, že pík obsahuje dvě nebo více složek. (Tento princip rozpoznání případné kontaminace píku nefunguje za předpokladu přesné koeluce nečistoty se složkou a také v případě velmi podobných spekter složky a interferující nečistoty). 19

(d) Odečtení dvou vlnových délek umožňuje dosažení snížení driftu a šumu v gradientové separaci. Referenční vlnová délka je zvolena tak, že při ní žádná měřená složka neabsorbuje. HPLC-FTIR Spojení s infračervenou spektroskopií s Fourierovou transformací poskytuje možnost získání spekter. Detekční limity jsou ale poměrně špatné při průtokovém uspořádání. Uspořádání, kdy je odečítán signál mobilní fáze je přínosnější a vede i k možnosti detekce a naměření 20

spekter stopových koncentrací analytů, ale technicky je tento systém náročný. Musí být použity těkavé mobilní fáze, přitom mohou být i vodné. HPLC-MS Hmotnostní spektrometry pro HPLC sestávají z tří odlišných částí: iontového zdroje, kde eluent z kolny vstupuje do hmotnostního spektrometru a je ionizován, hmotnostního analyzátoru a detektoru, elektronového násobiče detekujícího intenzitu svazku iontů. V současnosti se pro spojení HPLC s MS využívají především techniky ionizace za atmosférického tlaku. Z nich dvě nejdůležitější techniky jsou ESI a APCI. ESI: ionizace elektrosprejem: (a) Ionty jsou generovány coulombickou explozí elektricky nabitých kapiček. (b) Poskytuje ionty jednou nebo mnohonásobě nabité; v posledně zmíněném případě jsou výsledkem spektra obsahující mnoho píků, ty nesmí být zaměňovány za fragmenty v klasických spektrech. (c) Vhodná technika pro polární, termolabilní analyty a makromolekuly včetně biopolymerů. (d) Vhodná technika pro vodné mobilní fáze; vhodné pro mikro HPLC. (e) Pro ionizaci v kladném modu je příhodné ph kolem 5, aditiva jsou kyselina mravenčí a octová, případně octan ammoný: Analyt + HA -> AnalytH + + A - (f) Pro ionizaci v záporném modu je vhodné ph kolem 9, aditivem může být amoniak, triethylamin a diethylamin, případně octan ammoný: AnalytH + B -> Analyt - + HB + (g) Koncentračně-citlivý detektor. 21

APCI: Chemická ionizace za atmosférického tlaku: (a) Ionty jsou generovány koronovým výbojem (3-6 kv). (b) Vznikají především ionty typu (M+H) + (často žádná fragmenty), vznik negativních iontů je také možný. (c) Technika je vhodná pro nízkomolekulární středně polární látky. (d) Technika není vhodná pro termolabilní látky. (e) Průtok mobilní fáze musí být dostatečně velký, bývá kolem 1 mlmin -1. (f) Pro nevodné mobilní fáze není třeba přidávat aditiva, jsou možné reakce se solventem při ionizaci. (g) Pro vodné mobilní fáze může být nutné dodávat aditiva pro lepší ionizaci. (h) Hmotnostně-závislý signál. Kvadrupóly a iontové pasti jsou nejběžnější analyzátory. Tyto systémy jsou relativně levné robustní, ale mají nízké rozlišení, tzv, jednotkové roylišení, bývá kolem 0,7 Da. Ionty mohou procházet několika analyzátory, kde může dojít k jejich fragmentaci, a tím může být získána další informace o detailní struktuře analytu. Tyto techniky jsou známy jako MS/MS (dva stupně) nebo MS n (n supňů). 22

HPLC-NMR Techniku měření jaderné magnetické rezonance je možno spojit s HPLC za předpokladu výběru vhodné mobilní fáze (signál jednoho solventu lze potlačit, další solventy musí být deuterované) a koncentrace analytu nesmí být příliš nízká. Detekční limit závisí na radiofrekvenci, je tedy vhodné užívat instrumenty typu 500-800 MHz. Když je koncentrace analytu vysoká je možné měřit on-line, pokud je menší, a je to častá situace, je analyt navzorkován do smyčky během separace a měřen následně off-line. LC-UV, LC-MS a LC-NMR lze kombinovat, jak je prezentováno na obrázku níže v případě zjišťování složek v rostlinném extraktu. 23