Algoritmus pro stanovení parametrů protilátkové a buněčné imunity u žen a mužů s poruchami plodnosti Algorithm to determine parameters of both humoral and cell-mediated immunity in women and men who failed to conceive MARCELA DRAHOŠOVÁ 1, IVANA JANATKOVÁ 2, KARIN MALÍČKOVÁ 2, MARIE HAVRANOVÁ 3, JINDŘICH MADAR 4, ZDENKA ULČOVÁ-GALLOVÁ 5 1 Ústav klinické imunologie a alergologie FN Hradec Králové 2 Ústav klinické biochemie a laboratorní diagnostiky laboratoř klinické imunologie a alergologie VFN a 1. LF UK Praha 3 Immunia s.r.o. Praha 4 Ústav péče o matku a dítě Praha 5 Gynekologicko-porodnická klinika LF UK a FN Plzeň SOUHRN V současné době je ve vyspělých zemích zjišťována porucha plodnosti přibližně u 20 % párů ve fertilním věku. Jednou z příčin u obou pohlaví jsou abnormality imunitního systému. Je popisována řada imunopatologií, které mohou vyústit v infertilitu, případně sterilitu. Vzhledem k těmto skutečnostem nabývá na významu zařazení imunologických laboratorních testů do standardních postupů péče o páry s poruchou plodnosti. Klíčová slova: neplodnost, reprodukční imunologie, opakované ztráty plodu, imunologické laboratorní markery SUMMARY The failure to conceive is now recognised in one fifth of fertile-aged couples in developed countries. One from the many possible reasons for infertility are abnormalities in the immune system. Numerous immunopathological mechanisms leading to infertility have already been identified. It is of value to integrate immunological laboratory testing into standard diagnostic procedures of infertile couples. Such procedure is suggested in this article. Key words: infertility, reproductive imunology, reccurent pregnancy loss, immunological laboratory markers Problém neplodnosti, zahrnující neschopnost otěhotnět nebo donosit plod, postihuje v naší zemi přibližně již každý pátý pár v reprodukčním věku, tedy zhruba 20 %. Ačkoliv to tak vzhledem k současnému baby boomu na první pohled nevypadá, párů, které pro neúspěch při snaze o početí vyhledají odbornou pomoc, neustále přibývá. K faktorům, které se podílejí na tomto nepříznivém stavu, lze zařadit faktory hormonální, genetické, zhoršování podmínek životního prostředí, pohlavní choroby, infekce, záněty, vrozené anatomické vady rozplozovací soustavy, endometriózu a stres. Nemalý podíl připadá na odsouvání početí do vyššího věku. Oddalování početí a těhotenství do druhé poloviny reprodukčního období ženy v kombinaci s dalšími negativními faktory a chorobami mohou vyústit v nejrůznější imunopatologické stavy, které reprodukční proces velmi významně ovlivňují již na jeho počátku. Abnormálně regulované funkce imunitního systému zasahují do reprodukčního procesu na mnoha úrovních. Negativně ovlivňují funkci endokrinních žláz, přímo poškozují zárodečné tkáně, negativně působí na kvalitu pohlavních buněk i vlastní proces fertilizace vajíčka, nidaci, vývoj embrya a placenty. Mohou mít za následek i ztrátu plodu. V současnosti jsou popisovány i takové poruchy imunity, které mohou vyústit ve sterilitu, případně infertilitu. Dříve byla neschopnost počít dítě vnímána pouze jako ženská záležitost. Výsledky z poslední doby však ukazují, že mužský faktor se na neplodnosti párů podílí minimálně stejným dílem. Neméně časté a komplikovanější jsou případy, u nichž se možné příčiny neplodnosti kombinují, nebo takové případy, kdy 285
původ potíží s koncepcí není možno současnými diagnostickými prostředky odhalit. V posledních letech dochází k prudkému rozvoji v oblasti výzkumu, diagnostiky a léčby neplodnosti z imunologické příčiny. Řada klinických a laboratorních pracovišť zařazuje dostupné laboratorní diagnostické metody do nabídky rutinně prováděných vyšetření. Vzhledem k výše uvedeným skutečnostem nabývá na významu zařazení metodik reprodukční imunologie do standardních postupů péče o neplodné páry. Účelem tohoto námi navrženého algoritmu vyšetření je pomoci pracovníkům klinických laboratoří a lékařům, klinickým imunologům, gynekologům a specialistům v oboru reprodukce orientovat se v racionálním využití parametrů humorální a buněčné imunity v rutinní klinické praxi. Schéma nemá nahradit uvážlivé rozhodování ošetřujícího lékaře a nemůže také postihnout všechny možné situace, jež mohou nastat v klinické praxi. Lékař a laboratorní specialista by však měli zodpovědně zajistit pacientovi v každém individuálním případě adekvátní dostupnou péči. Schéma bude průběžně revidováno v závislosti na vývoji nových poznatků a dostupnosti metodik v oblasti reprodukční imunologie. Indikace imunologického vyšetření párů s poruchami plodnosti: 1. Páry, kterým se nepodaří dosáhnout těhotenství po roce pravidelného nechráněného pohlavního styku. 2. Ženy s opakovanými spontánními ztrátami plodu (po 2 spontánních potratech bez rozdílu věku). 3. Po neúspěšných metodách asistované reprodukce (neotěhotnění, nedonošení životaschopného plodu). Indikace po 2 neúspěšných IVF. Technické a personální požadavky laboratoře: 1. Pracoviště musí disponovat příslušně kvalifikovaným personálem znalým problematiky. 2. Laboratoř musí být schopna stanovit imunologické parametry v séru, plné krvi (lymfocyty), ejakulátu, případně ovulačním sekretu. Podmínkou je schopnost zajistit výsledky pokud možno o stejné analytické nejistotě a vysoké reprodukovatelnosti. 3. Vyšetření indikuje ošetřující lékař na základě svých zkušeností a s ohledem na klinický stav pacienta. 4. Interpretace výsledků (případně s návrhem léčebného postupu) pro gynekology nebo specialisty v oboru reprodukce náleží do rukou klinického imunologa, který se zabývá poruchami reprodukce. Přehled navrhovaných indikací a metodických postupů k identifikaci imunologických příčin mužské neplodnosti Nezbytnou podmínkou imunologického vyšetření ejakulátu je předchozí vyšetření spermiogramu dle standardů WHO. Tato vyšetření jsou prováděna na různých pracovištích (urologie, gynekologie, genetika, biochemie, cytologie, sexuologie). Doporučená metoda: standard WHO (WHO Manual for Semen Analysis, 1999). Spermiogram nemusí povinně vyšetřovat imunologická laboratoř. 1. Kvalita ejakulátu: počet spermií počet leukocytů vitalita spermií (propidium jodid) integrita akrozomu spermií přítomnost intraakrozomálního proteinu Metoda: průtoková cytometrie (např. SpermFlow Kit, Exbio), případně klasická mikroskopie. Při zvýšeném počtu leukocytů (> 1 10 6 /ml) je vhodné indikovat mikrobiologické vyšetření ejakulátu k vyloučení infekční příčiny. 2. Stanovení přítomnosti autoprotilátek třídy IgG a IgA navázaných na spermie v ejakulátu Indikace: poruchy motility, aglutinace spermií, inhibice akrozomální reakce, oligospermie, neuspokojivé oplození oocytů při IVF, idiopatická sterilita, abnormální postkoitální test, abnormální Kremerův test, abnormální spermiogram. Autoprotilátky vznikají zpravidla jako následek traumatu či infekce. Metoda: přímý MAR test (Mixed Antiglobulin Reaction) 3. Stanovení autoprotilátek v seminální tekutině Indikace: oligospermie, případně azoospermie, abnormální postkoitální test, abnormální Kremerův test, abnormální spermiogram. Mohou být přítomny i u normospermika. Metoda: nepřímý MAR test (Mixed Antiglobulin Reaction) 4. Stanovení autoprotilátek proti spermiím v séru Indikace: v případě vysoké pozitivity MAR testu provést stanovení hladiny protilátek v séru Metoda: ELISA, Fribergův tray-aglutinační test, nepřímý MAR test 5. Stanovení funkční aktivity NK buněk Indikace: oligospermia Metoda: stimulace vlastními spermiemi, průtoková cytometrie Tab. 1: Souhrnné doporučení pro vyšetření imunologických příčin neplodnosti muže metody I. volby metody II. volby spermiogram kvalita ejakulátu protilátky proti spermiím v ejakulátu ( navázané na spermie, v seminální tekutině) protilátky proti spermiím v séru funkční aktivita NK buněk, MIF screening systémového imunopatologického onemocnění (ATTG, EMA v IgA, GL, ANA) dle potřeby provést další vyšetření 286
Obr. 1: Algoritmus pro stanovení parametrů protilátkové a buněčné imunity u mužů s poruchami plodnosti 6. Test inhibice migrace leukocytů pod agarózou (MIF) Indikace: oligospermia Metoda: stimulace vlastními spermiemi 7. Protilátky proti tkáňové transglutamináze (ATTG), endomysiu (EMA) ve třídě IgA, gliadinu (GL) Metoda: ELISA, nepřímá imunofluorescence 8. Screening systémového imunopatologického onemocnění Indikace: stanovení antinukleárních faktorů (ANA) Metoda: nepřímá imunofluorescence Přehled navrhovaných indikací a metodických postupů k vyšetření příčin ženské sterility 1. Protilátky proti zona pellucida (screening) Indikace: idiopatická sterilita, neuspokojivé oplození oocytů získaných po stimulaci ovarií, především po opakovaném selhání IVF Metoda: hemaglutinace, popř. ELISA 2. Protilátky proti spermiím v séru Indikace: idiopatická sterilita, abnormální postkoitální test, abnormální Kremerův test Metoda: ELISA, Fribergův tray-aglutinační test, nepřímý MAR test 3. Protilátky proti tyreoperoxidáze (ATPO), tyreoglobulinu (ATG) Indikace: idiopatická sterilita, poruchy ovulace, oligomenorea, amenorea, opakované potrácení, selhání IFF Metoda: RIA, ELISA, LEIA 4. Protilátky proti spermiím v cervikálním hlenu Indikace: idiopatická sterilita, abnormální postkoitální test, abnormální Kremerův test Metoda: nepřímý MAR test 5. Stanovení funkční aktivity NK buněk Indikace: spontánní potraty, opakovaně neúspěšné IVF, pozitivita antifosfolipidových protilátek (APLA), endometrióza stimulace buňkami trofoblastu (JAR, JEG3) stimulace spermiemi Metoda: průtoková cytometrie, MIF 287
Obr. 2: Algoritmus pro stanovení parametrů protilátkové a buněčné imunity u žen s poruchami plodnosti primární sterilita 6. Antiovariální protilátky Indikace: předčasné ovariální selhání, špatná odpověď na stimulaci gonadotropiny, idiopatická sterilita, syndrom polycystických ovarií Metoda: nepřímá imunofluorescence, hemaglutinace, ELISA 7. protilátky proti tkáňové transglutamináze (ATTG), endomysiu (EMA) ve třídě IgA, gliadinu (GL) Metoda: ELISA, nepřímá imunofluorescence Tab. 2: Souhrnné doporučení pro vyšetření imunologických příčin sterility ženy metody I. volby primární sterilita protilátky proti zona pellucida protilátky proti spermiím v séru ATG, ATPO, ATTG, EMA, GL protilátky proti spermiím v cervikálním hlenu 8. Screening systémového imunopatologického onemocnění stanovení antinukleárních faktorů (ANA) Metoda: nepřímá imunofluorescence 9. Antifosfolipidové protilátky APLA profil IgG, IgM (fosfatidylserin, kyselina fosfatidová, fosfatidylinositol, fosfatidyletanolamin, kardiolipin + beta2gp1) Metoda: ELISA (beta2gp1 dependentní), minimálně tři cílové antigeny, (kardiolipin, fosfatidylserin, fosfatidylinositol + beta2gp1) Pozitivní nález opakovat po 6 12 týdnech. Přehled navrhovaných indikací a metodických postupů k vyšetření imunologických příčin infertility žen opakované ztráty plodu metody II. volby funkční aktivita NK buněk APLA, beta2gp1 ANA protilátky proti ovariím autoprotilátky u DM1 deficience imunoglobulinů Indikace: časné opakované ztráty plodu, dále předčasné porody morfologicky normálních novorozenců před 34. týdnem těhotenství. 288
Obr. 3: Algoritmus pro stanovení parametrů protilátkové a buněčné imunity u žen poruchami plodnosti opakované ztráty plodu 1. Protilátky proti kardiolipinu (ACLA) ve třídách IgG, IgM Metoda: ELISA (beta2gp1 dependentní), kalibrace na Harrisovy standardy, pozitivní nález opakovat po 6 12 týdnech 2. Protilátky proti β2 glykoproteinu-1 (beta2gp1) ve třídách IgG, IgM Metoda: ELISA, pozitivní nález opakovat po cca 6 12 týdnech 3. Antifosfolipidové protilátky APLA profil ve třídách IgG, IgM (fosfatidylserin, kyselina fosfatidová, fosfatidylinositol, fosfatidyletanolamin, kardiolipin + beta2gp1) Metoda: ELISA (beta2gp1 dependentní), pozitivní nález opakovat po 6 12 týdnech 4. Stanovení protilátek proti annexinu V ve třídách IgG, IgM Metoda: ELISA 5. Stanovení protilátek proti protrombinu ve třídách IgG, IgM Metoda: ELISA 6. Funkční aktivita NK buněk Metoda: průtoková cytometrie, MIF, stimulace buňkami trofoblastu, stimulace spermiemi Tab. 3: Souhrnné doporučení pro vyšetření imunologických příčin infertility ženy opakované ztráty plodu metody I. volby metody II. volby opakované ztráty plodu ACLA, APLA profil, včetně protilátek proti annexinu V anti β2 glykoprotein-1 (beta2gpi), anti protrombin funkční aktivita NK buněk ATTG a EMA v IgA, GL ANA ATG, ATPO imunofenotypizace 289
7. protilátky proti tkáňové transglutamináze (ATTG), endomysiu (EMA) ve třídě IgA, gliadinu (GL) Metoda: ELISA, nepřímá imunofluorescence 8. Screening systémového imunopatologického onemocnění stanovení antinukleárních faktorů (ANA) Metoda: nepřímá imunofluorescence 9. protilátky proti tyreoperoxidáze (ATPO), tyreoglobulinu (ATG) Metoda: RIA, ELISA, LEIA 10. Imunofenotypizace lymfocytů periferní krve Realizovat v přísně indikovaných případech. Metoda: průtoková cytometrie Výběrové testy Stanovení embryotoxických cytokinů Vyšetření folikulární tekutiny Vyšetření peritoneální tekutiny (např. protilátky proti lamininu) Stanovení produkce cytokinů po stimulaci antigeny spermií a trofoblastu Kontrola kvality práce laboratoře reprodukční imunologie Systém interní kontroly kvality (IQA) K dispozici nejsou, až na výjimky, referenční séra. Laboratoř musí implementovat vlastní interní kontroly, které zařazuje do každé série vyšetření. Systém externí kontroly kvality (EQA) Až na výjimky (APLA, ATG, ATPO, ATTG, EMA, ANA, GL, Ig) není pro ostatní parametry k dispozici. Jednou z možností je pravidelná mezilaboratorní kontrola (výměna vzorků) mezi laboratořemi po vzájemné dohodě. Poznámka: Kvalita diagnostických souprav je velmi rozdílná. Nutno vyzkoušet a konzultovat! Závěr Na základě současných poznatků lze konstatovat, že podíl imunopatologických mechanismů na snížení reprodukčních schopností člověka může být významný. Využití stávajících diagnostických metod a ovlivnění funkcí imunitního systému má své nezastupitelné místo v péči o neplodné páry. Věříme, že tento nastíněný algoritmus umožní zdravotníkům imunologické vyšetřovací metody cíleně indikovat a interpretovat jejich výsledky ve prospěch svých pacientů. Práce byla realizována s podporou výzkumného záměru FN Hradec Králové č. MZO 00179906. LITERATURA 1. Drahošová M, Madar J, Janatková I, Lochman I. Diagnostic of infertility algorithm of immunological laboratory testing. 13th Symposium of Czech Reproductive Immunologists with International Participation, May 2007. Abstract book p. 35. 2. Drahošová M, Madar J, Janatková I, Jankovičová K. Diagnostic of infertility immunological laboratory markers (poster). J Reproductive Immunol, 2009;81(2):168-169. 3. Drahošová M, Madar J, Janatková I. Diagnostics of infertilityautoimmune markers in immunological testing (poster). 6th International Congress on Autoimmunity. Porto, Portugalsko, 10.-14.9.2008. 4. Drahošová M. Autoimunita a reprodukce. XXV. Sjezd ČSAKI a SSAKI, Praha, 30.10.2008. 5. Gruberová J, Biková S, Ulcová-Gallová Z, Reischig J, Rokyta Z. Ovulatory mucus and its ph, arborization and spermagglutination antibodies in women with fertility disorder. Ceska Gynekol. 2006 Jan;71(1):36-40. 6. Gruberová J, Ulcová-Gallová Z, Bibková K, Micanová Z, Králícková M, Novotný Z, Rokyta Z.Are the antibodies against laminin-1 the signifikant marker of decreased fertility in women? Ceska Gynekol. 2007 Aug;72(4):284-6. 7. Chládek D, Pěknicová J, Čapková J, Geussová G, Teplá O, Madar J. Využití monoklonálních protilátek proti proteinům lidských spermií k diagnostice patologie spermií a výběru vhodné metody fertilizace v asistované reprodukci Čes. Gynek. 65, 2000, č. 1 s. 28 32. 8. Jankovičová K, Drahošová M, Vokurková D, Burešová E. Cell mediated immunity testing in women with recurrent pregnancy loss and infertility of unknown aetiology-the first experience with two parallel assays (poster). J Reproductive Immunol., 2009;81(2):148-149. (IF=2.778) 9. Krizanovská K, Ulcová-Gallová Z, Bouse V, Svábek L, Rokyta P, Suchá R, Rokyta Z. Analysis of the zona pellucida in human oocytes and embryos in an assisted reproduction program] Ceska Gynekol. 2002 Jul;67(4):197-202. 10. Luborsky JL, Vinsintin I, Boyers S, Asari T, Caldwell B, De- Cherney A. Ovarian antibodies detected by immobilized antigen immunoassay in patients with premature ovarian failure. J Clin Endocrinol Metab 1990;70:69-75. 11. Madar J, Urbánek V, Chaloupková A, Nouza K, Kinský R. role protilátkové a buněčné autoimunity proti spermiím v patogenezi mužské neplodnosti. Čes Gynek 67, 2002, No. 1, p. 3-7. 12. Madar J, Pěknicová J, Šůla K, Tolarová M, Nováková D, Kinský R. Anti-trophoblast and anti cardiolipin imunity in repeated miscarriages-diagnosis and treatment. J Reprod Immunol 2003;58(2): 179. 13. Madar J, Nouza K, Nováková D. Imunologické aspekty habituálního potrácení: Mod gynekol porodn 2002; 11(4), 621-627 14. Mardesic T, Ulcova-Gallova Z, Huttelova R, Muller P, Voboril J, Mikova M, Hulvert J. The influence of different types of antibodies on in vitro fertilization results. Am J Reprod Immunol. 2000 Jan;43(1):1-5. 15. Meroni PL, Gerosa M, Raschi E, Scurati S, Grossi C, Borghi MO. Updating on the pathogenic mechanisms 5 of the antiphospholipid antibodies-associated pregnancy loss. Clin Rev Allergy Immunol. 2008 Jun;34(3):332-7. 16. Mettler L, Bachmann J, Schmutzler A. High prevalence of markers for immunological disorders in IVF patients. Int J Gynaecol Obstet. 2004 Jul;86(1):59-60. 290
17. Nouza K, Madar J, Nouza M. Imunologie a imunopatologie reprodukčního procesu. Alergie 2007; č. 2:135-141. 18. Peknicova J, Chladek D, Hozak P. Monoclonal antibodies against sperm intra-acrosomal antigens as markers for male infertility diagnostics and estimation of spermatogenesis. Am J Reprod Immunol. 2005 Jan;53(1):42-9. 19. Pribylova P, Malickova K. Peripheral Blood Natural Killer Cell Assay in Infertile Women. Prague Med Rep. 2008;108(4):298-304. 20. Purvis MT, Kaider BD, Roussev RG, Coulam CB. Antinuclear antibody prevalence in patients with reproductive failure. Am J Reprod Immunol 1996; 35:463. 21. Stagnaro-Green A, Roman SH, Cabin RH, El-Harazy E, Alvarez-Marfany M, Davies TF. Detection of at-risk pregnancy by means of highly sensitive assays for thyroid antibodies. JAMA 1990;264:1422-1425. 22. Subrt I, Ulcova-Gallova Z, Bibkova K, Micanova Z, Hejnalova M, Cerna M, Hradecky L, Novotny Z. Recurrent pregnancy loss and frequency of eight antiphospholipid antibodies and genetic thrombophilic factors in Czech women. Am J Reprod Immunol. 2008 Mar;59(3):193-200. 23. Suchá R, Ulcová-Gallová Z. Follicular fluid and its properties. Ceska Gynekol. 2000 May;65(3):181-8. 24. Szekeres-Bartho J. Regulation of NK cell cytotoxicity during pregnancy. Reprod Biomed Online. 2008 Feb;16(2):211-7. 25. Ulcová-Gallová Z, Babcová K, Nováková P, Micanová Z, Rokyta Z.Antizonal antibodies in ovulatory cervical mucus and in serum of patients with fertility disorders. Ceska Gynekol. 2004 May;69(3):215-8. 26. Ulcová-Gallová Z, Bouse V, Krizanovská K, Balvín M, Rokyta Z, Netrvalová L. Beta 2-glycoprotein I is a good indicator of certain adverse pregnancy conditions. Int J Fertil Womens Med. 2001 Nov-Dec;46(6):304-8. 27. Ulcova-Gallova Z, Krauz V, Novakova P, Milichovska L, Micanova Z, Bibkova K, Sucha R, Turek J, Balvin M, Rokyta Z.Anti-phospholipid antibodies against phosphatidylinositol, and phosphatidylserine are more signifiant in reproductive failure than antibodies against cardiolipin only. Am J Reprod Immunol. 2005;54(2):112-7. 28. Ulcova-Gallova Z, Krauz V, Rokyta Z. Six kinds of anti-phospholipid antibodies (apls) in ovulatory mucus and seminal plasma from couples with repeated miscarriages. Int J Fertil Womens Med. 2000 Jul-Aug;45(4):292-6. 29. Ulcová-Gallová Z, Turek J, Bibková K, Micanová Z, Panzner P, Balvín M, Rokyta Z. Serum antibodies against annexin V and other phospholipids in women with fertility failure. Ceska Gynekol. 2006 May;71(3):200-3. 30. Ulcova-Gallova Z. Antiphospholipid antibodies and reproductive failure. Chem Immunol Allergy. 2005;88:139-49. 31. Ulcová-Gallová Z. Mixed antiglobulin reaction and tray agglutination test for detection of spermantibodies. Int J Fertil Menopausal Stud. 1994;39(3):185-91. 32. Vanciková Z, Chlumecký V, Sokol D, Horáková D, Hamsíková E, et al. The serologic screening for celiac disease in the general population (blood donors) and in some high-risk groups of adults (patients with autoimmune diseases, osteoporosis and infertility) in the Czech republic. Folia Microbiol (Praha). 2002;47(6):753-8. RNDr. Marcela Drahošová Ústav klinické imunologie a alergologie FN Hradec Králové Sokolská 581 500 05 Hradec Králové e-mail: drahosova@fnhk.cz 291