Stanovení kyseliny mravenčí a citronové v kávě pomocí kapilární izotachoforézy Úkol: Proveďte extrakci kyseliny mravenčí a citronové z reálného vzorku (káva). Pomocí kapilární izotachoforézy stanovte, zda jsou látky v reálném vzorku obsaženy. 1. Teoretická část 1.1. Kyselina mravenčí a citronová v kávě Kyselost (acidita) kávy je jedním z charakteristických parametrů používaným při jejím senzorickém hodnocení. V případě senzorického hodnocení kávy se jedná o určitý pocit suchosti či trpkosti a je cítit především pod okrajem jazyka a na zadní straně patra. Kyselost kávy je závislá především na stupni jejího pražení. Podle stupně pražení se také mění poměr jednotlivých kyselin, které její kyselost způsobují. Jedná se např. o kyselinu citronovou, jablečnou, chlorogenovou, mravenčí a octovou. Kyselina mravenčí a citronová (chemická struktura viz Obr. 1) jsou látky, které se v kávě (v kávových zrnech) přirozeně vyskytují. Kyselina citronová je spolu s kyselinou jablečnou obsažena v zrnech zelené kávy. Obsah kyseliny mravenčí v kávě se zvyšuje během samotného pražení kávy. Obr. 1 Chemická struktura kyseliny citronové a mravenčí 1.2. Kapilární izotachoforéza Kapilární izotachoforéza (CITP) je elektromigrační separační technika umožňující analýzu nabitých látek (kationtů či aniontů) při vloženém konstantním proudu (gradientu
napětí). Vzorek je dávkován mezi dva základní elektrolyty vedoucí a koncový obsahující ionty mající rozdílné hodnoty pohyblivostí (mobilit). Vedoucí elektrolyt obsahuje ionty se stejným znaménkem jako separované analyty (koionty) mající nejvyšší mobilitu v daném elektrolytovém systému. Koncový elektrolyt obsahuje koionty mající nejnižší mobilitu v daném elektrolytovém systému. Separované látky (analyty) jsou poté rozděleny mezi vedoucí a koncový elektrolyt na základě jejich rozdílných pohyblivostí. Každý separovaný analyt vytváří během CITP analýzy vlastní oddělenou zónu. Výsledkem analýzy je při použití univerzálního vodivostního detektoru schodovitý záznam tzv. izotachoforegram. Z výšky schodu usuzujeme kvalitu a délka zóny je přímo úměrná kvantitě (viz Obr. 2). Obr. 2 Izotachoforegram znázorňující CITP analýzu vzorku obsahující analyt A a B U elektromigračních metod se můžeme setkat s nízkou opakovatelností migračních časů, což je způsobeno především elektroosmotickým a hydrodynamickým tokem uvnitř separační kapiláry. V případě izotachoforetického analyzátoru je možné elektroosmotický tok potlačit, a to použitím kapilár (kolon) z inertního materiálu (např. z kopolymeru fluorovaného ethylenu a propylenu FEP) a/nebo přídavkem vhodného aditiva do pracovního elektrolytu (např. hydroxyethylcelulóza - HEC). Hydrodynamický tok je v tomto případě potlačen použitím hydrodynamicky uzavřeného systému (použitím semipermeabilních celofánových membrán oddělujících elektrolytové nádobky od elektrolytu, kterým je naplněna separační kapilára).
Při použití dvoukolonového izotachoforetického analyzátoru je využívána tzv. technika spojených kolon umožňující dvoudimenzionální CITP (2D-CITP). První kolona (kapilára) v níž dochází k odstranění nežádoucích interferentů a zakoncentrování cílových analytů je tzv. předseparační kolona. V druhé koloně analytické dochází k separaci zakoncentrovaných analytů. 2. Praktická část 2.1. Přístroje Dvoukolonový izotachoforetický analyzátor s vodivostní detekcí vybavený autosamplerem Aparatura potřebná pro SPE extrakci Elektrický vařič Ultrazvuková lázeň ph metr Analytické váhy 2.2. Pomůcky Plastové kádinky, plastové nádobky, elektrolytové nádobky, plastové odměrné baňky, SPE kolonky, jednorázové navažovací lodičky, špachtle, lžička, pipety, balónek, vatové tampony, stříkačkové mikrofiltry, injekční stříkačka, viálky, eppendorfky. 2.3. Chemikálie Standard kyseliny mravenčí a citronové, reálný vzorek (káva), kyselina chlorovodíková, histidin, TRIS, methanol, hydroxyethylcelulóza (HEC), deionizovaná voda, kalibrační roztoky pro kalibraci ph metru.
2.4. Pracovní postup 2.4.1. Úprava reálného vzorku na elektrickém vařiči převaříme cca 100 ml deionizované vody do kádinky navážíme 2,5 g reálného vzorku (káva) a přidáme 50 ml vroucí vody připravíme si aparaturu potřebnou pro SPE extrakci provedeme kondicionaci SPE kolonky (SAX) kolonku pomalu promyjeme 3 ml methanolu a 3 ml deionizované vody následně kolonku promyjeme 3 ml vzorku a 5 ml deionizované vody provedeme eluci analytů pomocí 2,5 ml 1 M HCl získaný vzorek přefiltrujeme přes stříkačkový mikrofiltr (0,45 µm) a převedeme do viálky viálku umístíme do autosampleru připojeného k izotachoforetickému analyzátoru 2.4.2. Příprava elektrolytů podle tabulky složení elektrolytového systému (viz Tab. 1) navážíme nebo odměříme do odměrné baňky vypočtené množství množství (V = 250 ml) a doplníme deionizovanou vodou po rysku roztok vložíme na cca 10 minut do ultrazvukové lázně pomocí ph metru (předem nakalibrovaného) upravíme ph elektrolytu na potřebnou hodnotu připravené elektrolyty převedeme do elektrolytových nádobek a umístíme do analyzátoru 2.4.3. Příprava standardního roztoku do eppendorfky navážíme 5 mg standardu kyseliny mravenčí a citronové a rozpustíme v 1 ml deionizované vody připravené roztoky zředíme 20 x deionizovanou vodou a převedeme do viálky
2.4.4. ITP analýza izotachoforetický analyzátor postupně naplníme elektrolytovým systémem (dle pokynů vedoucího cvičení) dále nastavíme metodu (časový průběh separace, hodnoty hnacích proudů, přepnutí kolon, volba módu) pomocí návodu k přístroji a vedoucího laboratorního cvičení provedeme v aniontovém módu ITP-ITP analýzu: 1. Slepého vzorku (koncový elektrolyt) 2. Připraveného reálného vzorku 3. Reálného vzorku s přídavkem standardního roztoku kyseliny mravenčí a citronové Tab. 1 Složení elektrolytového systému Předseparační kolona (90x0.8 mm) Analytická kolona (90x0.3 mm) Vedoucí elektrolyt 10 mm HCl + 0,1 % HEC pomocí histidinu upravit ph hodnotu na 6,0 Koncový elektrolyt 5 mm MES + 0,05 % HEC pomocí TRISu upravit ph hodnotu na 6,2 Použitý hnací proud 200 µa 25 µa při detekci 10 µa 3. Vyhodnocení S použitím naměřených dat (izotachoforegramů) určete, zda je v předloženém reálném vzorku (káva) obsaženy kyselina citronová a mravenčí. Výsledek zdůvodněte. 4. Otázky k prozkoušení 1. Zjistěte hodnoty pka kyseliny mravenčí a citronové a uveďte v jakém rozmezí ph budou disociovány. Odpověď zdůvodněte. 2. Na čem závisí kyselost kávy? Uveďte další vlastnosti kávy, které se využívají u senzorické analýzy.
3. Navrhněte jinou analytickou metodu, kterou by bylo možné stanovit obsah kyseliny mravenčí a citronové. 4. Vysvětlete princip extrakce pevnou fází (SPE). Jaké typy běžně používaných SPE kolonek znáte? 5. Je možné během jedné izotachoforetické analýzy stanovit jak kationty, tak anionty? 6. Popište základní rozdíly mezi kapilární elektroforézou a kapilární izotachoforézou. 7. Jaké jiné elektromigrační metody znáte? 8. Které elektromigrační metody je možno použít pro separaci nenabitých analytů? 9. Vysvětlete rozdíl mezi univerzálním a selektivním detektorem. Ke každé skupině uveďte alespoň jeden typ detektoru. 10. Vysvětlete pojem Jouleovo teplo a samozaostřovací efekt (ve spojení s CITP). 5. Doporučená literatura 1. Boček P. a kol.: Analytická kapilární izotachoforéza, Pokroky chemie. Academia, Praha 1987. 2. Everaerts F. M. a kol.: Isotachophoresis: theory, instrumentation, and applications. Elsevier, Amsterdam 1976. 3. Šťulík K.: Analytické separační metody. Karolinum, Praha 2004. 4. Baker D.R., Capillary electrophoresis: Techniques in analytical chemistry. John Wiley and Sons Ltd, New York 1995. 5. Coultate T. P.: Food: The chemistry of its components. RSC Publishing, Cambridge 2009. 6. Ötleş S.: Handbook of food analysis instruments. CRC Press, Boca Raton 2008. 7. Velíšek J.: Chemie potravin. OSSIS, Tábor 2002.