CMVIgAELA Test PKS medac Český 0123 112PKSVPCZ/010512
VÝROBCE: medac Gesellschaft für klinische Spezialpräparate mbh Fehlandtstraße 3 D20354 Hamburg MARKETING: medac Gesellschaft für klinische Spezialpräparate mbh Geschäftseinheit Diagnostika Theaterstraße 6 D22880 Wedel Tel.: ++49/ 4103/ 8006351 Fax: ++49/ 4103/ 8006359 ADRESA PRO PŘÍJEM OBJEDNÁVEK: Tel.: ++49/ 4103/ 8006111 Fax: ++49/ 4103/ 8006113 112PKSVPCZ/010512
CMVIgAELA Test PKS medac Enzymoimunologický test se systémem kontroly pipetování na průkaz protilátek IgA proti cytomegalovirus (CMV) Katalogové číslo: 112PKS POUZE PRO DIAGNOSTICKÉ POUŽITÍ IN VITRO ÚVOD Cytomegalovirus (CMV) patří do skupiny lidských patogenních herpetických vírů, které obsahují dvouprovazcový genom DNA. Pro tyhle viry je typické, že po proběhnutí primární infekce mohou zůstat latentně v organizmu. V důsledku toho může za určitých podmínek dojít k reaktivaci viru. Infekce cytomegalovirem probíhají u imunokompetentních osob obyčejně nenápadně. U imunosupresivních osob (např. pacienti po transplantaci, lidé infikovaní virem HIV, tumoroví pacienti nebo novorozenci) se však pozorují závažně symptomy nejrůznějšího druhu. Obyvlášť důležitý je CMV jako častý agens prenatálních infekcí. Tyto infekce mohou způsobit závažné poškození dítěte, přičemž nelze vyloučit pozdní poruchy také u dětí narozených bez symptomů. Specifické protilátky IgA proti CMV byli detekovány v sérech pacientů po transplantaci orgánů a korelovali s nálezem specifických protilátek IgM proti CMV. Protilátky IgA proti CMV mohou být z toho důvodu považovány za markry akutních infekcií. Kombinace detekce specifických protilátek IgA proti CMV společně s průkazem antigenu a průkazem specifických protilátek IgM proti CMV vedla u pacientů po transplantaci orgánů ke zvýšení specifity diagnózy infekce CMV. 112PKSVPCZ/010512 1
PRINCIP TESTU Mikrotitrační deštička je pokryta protihumánním IgA. Frakce IgA ze vzorek séra se váže na mikrotitrační deštičku. Protilátky proti anticmviga se vážou na peroxidázou konjugované CMVIgAELA (AG = antigen, P = peroxidáza). Inkubace se substrátem TMB (*). Reakce se zastaví přidáním kyseliny sírové. Absorpce se odčítá fotometricky. Výhody testu Žádné nespecifické reakce a žádné falešně pozitivní výsledky způsobené revmatoidními faktory. Nedochází k blokování protilátek IgA vysokým titrem IgG. Systém kontroly pipetování umožňuje vizuálně sledovat každý krok pipetování, při kterém dochází ke změnám barev. Lámací proužky s mikrojamkami umožňují efektivní využití testu. Testy lze automatizovat pro otevřené zařízení ELISA. 112PKSVPCZ/010512 2
OBSAH SOURAVY Katalogové číslo: 112PKS 1. MTP Mikrotitrační destička: 12 proužků po 8 jamkách (označená jako CMA, s desikantem v hliníkovém vakuovém balení), lámací proužky, dno tvaru písmena U, pokrytá kozími protilátkami proti IgA, BSA a indikátorem ph, připravená k použití. 2. CONTROL Negativní kontrola: 1 lahvička s obsahem 1,5 ml, lidské sérum, připravená k použití, obsahuje BSA, fenol, ProClin TM 300 a gentamycin sulfát. 3. CONTROL + Pozitivní kontrola: 1 lahvička s obsahem 1,5 ml, lidské sérum, připravená k použití, obsahuje BSA, fenol, ProClin TM 300 a gentamycin sulfát. 4. WB Promývací roztok: 1 lahvička s obsahem 100 ml, PBS/Tween (10x), ph 7,2 7,4, obsahuje ProClin TM 300. 5. VIRDIL Roztok na ředění vzorků: 1 láhev s obsahem 110 ml, PBS/Tween/BSA, ph 7,2 7,4, připravený k použití, obsahuje ProClin TM 300. 6. ANTIGEN CMVIgAELA (enzymem označený antigen): 4 lahvičky každá s obsahem po 5,0 ml, lyofilizovaný, zbarvený žlutě, obsahuje FKS, konjugovaný HRP. 7. TMB Substrát TMB: 1 lahvička s obsahem 10 ml, připravený k použití. 8. STOP Roztok na zastavení reakce: 2 lahvičky s obsahem každá po 11 ml, 0,5 M kyselina sírová (H 2 SO 4 ), připravený k použití. 112PKSVPCZ/010512 3
1. SKLADOVÁNÍ A STABILITA Materiál/Reagencie Stav Skladování Stabilita Zkušební souprava neotevřená 2...8 C do uplynutí použitelnosti Mikrotitrační destička otevřená 2...8 C 6 týdnů v sáčku s desikantem Kontroly otevřené 2...8 C 6 týdnů Promývací roztok Zředěný 2...8 C 6 týdnů Roztok na ředění vzorků otevřený 2...8 C 6 týdnů CMVIgAELA rozpuštěný 2...8 C 5 dní Substrát TMB otevřený 2...8 C 6 týdnů Roztok na zastavení reakce otevřený 2...8 C do uplynutí použitelnosti Nepoužívejte reagencie po uplynutí data jejich použitelnosti. 2. DALŠÍ POŽADOVANÉ REAGENCIE A MATERIÁLY 2.1. Aqua ad iniectabilia (redestilovaná). Použití pouze deionizované vody může negativně ovlivnit výsledek testu. 2.2. Mikropipety pro potřebné objemy. 2.3. Čisté skleněné nádoby nebo nádoby z umělé hmoty na ředění promývacího roztoku. 2.4. Vhodné zařízení na promývání mikrotitračních destiček (např. multikanálová pipeta nebo promývačka na testy ELISA). 2.5. Inkubátor pro 37 o C. 2.6. Fotometr na mikrotitrační destičky s filtry na 450 nm a 620 650 nm. 3. PŘÍPRAVA REAGENCIÍ Před zahájením testu vytemperujte všechny komponenty na pokojovou teplotu, aby nedocházelo ke kondenzaci. Stanovte požadovaný počet mikrotitračních jamek. 112PKSVPCZ/010512 4
3.1. Mikrotitrační destička Hliníkový sáček se musí spolu s desikantem po každém otevření opět pevně uzavřít. Skladování a životnost nepoužitých mikrotitračních jamek jsou uvedeny pod bodem 1. Pokyn: Jamky mikrotitrační deštičky mají slabě zelený odstín. Rovněž se objevující zelenohnědé skvrny v jamkách jsou způsobené zpracováním deštičky a nemají negativní vliv na provedení a výsledek testu. 3.2. Promývací roztok Zmíchejte jednu objemovou část koncentrátu promývacího roztoku (10x) s devíti částmi aqua ad iniectabilia (např. 50 ml koncentrátu roztoku (10x) s 450 ml aqua ad iniectabilia). Na 8 jamek budete potřebovat 10 ml zředěného roztoku promývacího roztoku. Krystaly v promývacím roztoku (10x) se musí rozpustit zahřáním (max. na 37 C) nebo promícháním při pokojové teplotě. 3.3. CMVIgAELA Lyofilizát zřeďte s 5,0 ml roztoku na ředění vzorků. Uzavřená lahvička se musí lehce potřást, aby se částice z uzávěru dostali do roztoku. Po rozpuštění je CMVIgAELA zbarvený žlutě a hotový k použití. Reagencie jednoho testu (mikrotitrační destička, kontroly, CMVIgA ELA) se nesmí zaměňovat s reagenciemi jiných šarží. Oproti tomu se roztok na ředění vzorků, promývací roztok, substrát TMB a roztok na zastavení reakce u všech virologických testů firmy medac mohou principiálně zaměňovat. Reagencie jiných výrobců se obecně v tomto testu nesmí používat. Pouze při přesném dodržení pracovních předpisů obdržíte validní a reprodukovatelné výsledky. 4. VZORKY 4.1. Test je vhodný pro vzorky séra. Vzorky pacientů uchovávejte maximálně 7 dní při teplotě 2 8 C. Delší uchovávaní se musí provádět při teplotě 20 C. Vzorky se nesmí opakovaně zamrazovat a odmrazovat. 4.2. Před testem není potřebné provádět žádnou úpravu séra např. deaktivaci. Testované vzorky séra však nesmí být kontaminované mikroorganismami ani nesmí obsahovat lidské erytrocyty. 112PKSVPCZ/010512 5
4.3. Séra rozřeďte v poměru 1:100 roztokem na ředění vzorek. Pro určení titru se vzorky mohou dále libovolně ředit. 5.A. PRACOVNÍ POSTUP PŘI TESTU 5.1. Otevřete obal mikrotitrační deštičky a vyberte požadovaný počet mikrotitračních proužků (viz 3.1.). Mikrotitrační deštičky jsou připraveny k použití a nemusí se promývat. 5.2. Jamku A1 nechte prázdnou (viz 6.A.) pro určení pozadí. Do jamek na destičce napipetujte 50 µl zředěných vzorek, v duplikátech negativní kontrolu a pozitivní kontrolu. Po napipetování se vzorky (neutrální nebo bazické kapaliny) v jamkách zbarví modře. Pokud se roztok v některé jamce nezbarví, znamená to, že do ni nebyl napipetován vzorek nebo kontroly. V případě potřeby se může mikrotitrační deštička před zpracováním ponechat ve vlhké komoře maximálně 30 minut při pokojové teplotě nebo při 2 8 C maximálně po dobu 60 minut. 5.3. Inkubujte deštičku 60 minut ( 5 minuty) při 37 o C (± 1 o C) (vlhká komora nebo inkubační fólie). 5.4. Rozpusťte CMVIgAELA (viz 3.3). 5.5. Po inkubaci promyjte každou mikrotitrační jamku třikrát 200 μl promývacího roztoku. Po dobu promývaní dbejte na to, aby se jamky pořádně naplnily. Po promytí vyklepete mikrotitrační deštičku na filtračním papíru. Jamky nenechte vyschnout! Pokračujte v práci okamžitě! 5.6. Do každé jamky napipetujte (kromě A1) CMVIgAELA (zbarvený žlutě). Při manuálním zpracování testu napipetuje do každé jamky 50 μl konjugátu. Upozornění: Při práci na automatizovaných přístrojích je potřebné naprogramovat 60 μl pro každou jamku, protože v inkubačních komorách těchto zařízení dochází k intenzivnímu vypařování. 112PKSVPCZ/010512 6
V rámci validace testu pro automatické zpracování se ukázalo, že tento test je v podstatě vhodný také pro automatické zpracování. Nicméně doporučujeme verifikovat jeho kompatibilitu s přístrojem, na kterém se bude pracovat. 5.7. Znovu inkubujte 60 minut ( 5 minuty) při 37 komora nebo inkubační fólie). o C (± 1 o C) (vlhká 5.8. Po inkubaci promyjte mikrotitrační jamky znovu (viz 5.5.). 5.9. Do všech jamek (včetně A1) přidejte 50 µl substrátu TMB a inkubujte 30 minut ( 2 minuty) ve tmě při teplotě 37 C (± 1 o C) vlhká komora nebo inkubační fólie). Pozitivní vzorky se zbarví modře. 5.10.Přidáním 100 µl roztoku na zastavení reakce do každé jamky (včetně A1) se reakce zastaví. Modré zbarvení vzorek se změní na žluté. Před fotometrickým měřením vyčistěte ze spodu mikrotitrační deštičku a zkontrolujte, zdali v jamkách nejsou žádné bublinky vzduchu. Odečtení je nutno provádět během 15 minut po přidání roztoku na zastavení reakce. 112PKSVPCZ/010512 7
5.B. TABULKA ZNÁZORŇUJÍCÍ PRACOVNÍ POSTUP PŘI TESTU Prázdná jamka (A1) Negativní kontrola Pozitivní kontrola Vzorky Negativní kontrola Pozitivní kontrola Vzorky 50 μl 50 μl 50 μl Inkubujte 60 minut při teplotě 37 C, 3 x promyjte 200 μl promývacího roztoku CMVIgAELA 50/60 μl*) 50/60 μl*) 50/60 μl*) Inkubujte 60 minut při teplotě 37 C, 3 x promyjte 200 μl promývacího roztoku Substrát TMB 50 μl 50 μl 50 μl 50 μl Inkubujte ve tmě 30 minut při teplotě 37 C Roztok na zastavení reakce 100 μl 100 μl 100 μl 100 μl Fotometrické odečtení optické density při 450 nm (ref. vln. délka 620 650 nm) *) manuální/automatický postup (viz 5.6.) 6.A. HODNOCENÍ TESTU (VALIDITA) Fotometrické vyhodnocení se provází při vlnové délce 450 nm (referenční vlnová délka 620 650 nm). Od všech hodnot OD odečtěte OD pozadí (A1 jamka). Kritéria validity Střední hodnota OD negativní kontroly musí být < 0,150. Střední hodnota OD pozitivní kontroly musí být > 0,600. Pokud kriteriá validity najsou splnena, musí se test opakovat. Cutoff = Střední hodnota OD negativní kontroly + 0,140 Šedá zóna = cutoff 10 %. 112PKSVPCZ/010512 8
6.B. INTERPRETACE VÝSLEDKŮ Vzorky s hodnotami OD pod spodní hranicí šedé zóny se hodnotí jako NEGATIVNÍ. Vzorky s hodnotami OD v oblasti šedé zóny se hodnotí jako HRANIČNÍ. Tyhle séra se musí opět zkontrolovat po 14 dnech společně s nověodebraným vzorkem, aby se zjistil pohyb titru. Vzorky s hodnotami OD nad horní hranicí šedé zóny se hodnotí jako POZITIVNÍ. Výsledky testu se musí interpretovat vždycky společně s klinickým obrazem pacienta a dalšími diagnostickými parametry. Bylo sledovaných 59 potenciálně křížově reaktivních sér. Žádné z nich nebylo reaktivní v testu IgA. Velmi vysoké hodnoty lipidů mohou v jednotlivých případech výsledky zkreslit. Vysoké hodnoty hemoglobinu a bilirubinu neovlivňují výsledky testu. 7. CHARAKTERISTICKÉ VLASTNOSTI TESTU Při diagnostické evaluaci jsme zjistili následující charakteristické vlastnosti testu. 7.A. SPECIFITA Z celkově 300 sér od dárců krve bylo testem CMVIgAELA Test PKS medac 296 sér detekovaných jako negativní. Zbývající čtyři séra tři z nich hraniční a jedno slabě pozitivní v testu IgA ukazovali všechny vysoké titry CMVIgG, jedno sérum dokonce pozitivní CMVIgM. V jiném porovnávacím referenčním testu bylo z těch samých 300 sér 284 negativních, 2 hraničních a 14 pozitivních. 112PKSVPCZ/010512 9
7.B. CITLIVOST Z celkově 105 sér, které byli uvedeným referenčním testem určené jako CMVIgA pozitivní, detekoval test CMVIgAELA PKS medac 101 sér jako pozitivní, 2 jako hraniční a 2 jako negativní. To odpovědá relativní citlivosti 96,2 %. 7.C. PŘESNOST Vzorky Variace intraassay (n = 24) Vzorky Variace interassay (n = 11) střední OD SP CV (%) střední OD SP CV (%) NK 0,047 0,007 15 NK 0,044 0,005 11 SP 0,341 0,014 4 SP 0,276 0,034 12 PK 1,601 0,047 3 PK 1,391 0,119 8 Č. 1 0,047 0,006 13 Č. 1 0,052 0,008 15 Č. 2 0,223 0,010 4 Č. 2 0,201 0,020 10 Č. 3 2,473 0,052 2 Č. 3 2,184 0,187 9 NK = negativní kontrola; SP = slabě pozitivní kontrola (není obsáhnutá v soupravě); PK = pozitivní kontrola VŠEOBECNÉ RADY TÝKAJÍCI SE MANIPULACE Aby se předešlo vzájemné kontaminaci jednotlivých reagencií, nezaměňujte lahvičky a jejich šroubové uzávěry. Reagencie je potřebné ihned po použití uzavřít, aby nedošlo k jejich vypařování a mikrobiální kontaminaci. Po skončení testu se musí reagencie uložit tak, jak je uvedené v pokynech, aby se zachovala jejich garantovaná životnost. Aby se předešlo záměně reagencií různých testovacích systémů nebo šarží, musí se všechny komponenty jednoho setu po použití skladovat spolu v původním balení (viz také 3.). 112PKSVPCZ/010512 10
INFORMACE TÝKAJÍCI SE BEZPEČNOSTI A OCHRANY ZDRAVÍ Je nevyhnutné dodržovat místní předpisy týkající se bezpečnosti práce. Reagencie lidského původu byli testovány na HBsAg, na protilátky proti HIV 1/2 a protilátky proti HCV a bylo zjištěno, že nejsou reaktivní. Přesto se musí s těmito reagenciemi a také s těmi, které obsahují součásti zvířecího původu, (viz obsah soupravy), pracovat jako s potencielně nákažlivými, aby se předešlo riziku nákazy. RADY TÝKAJÍCÍ SE LIKVIDACIE Zbytky chemikálií a preparátů jsou všeobecně považovány za speciální odpad. Likvidace tohoto druhu odpadu se řídí národními a regionálními zákony a předpisy. Obraťte se na orgány místní správy nebo na organizace zabývající se odpady, které vám podají informace, jak tyhle nebezpečné odpady likvidovat. Datum vydání: 01.05.2012 112PKSVPCZ/010512 11
LITERATURA Braun, W., Hehr, B., Rabenau, H., Doerr, H. W.: Serologische Diagnostik der Zytomegalie bei immunsupprimierten Patienten. AIDSForschung (AIFO), Heft 11, 634638 (1987). Braun, W., Weber, B., Moell, U., Hamann, A., Doerr, H. W.: Immunoglobulin A and M patterns to human cytomegalovirus during recurrent infection in patients with AIDS using a modified Western blot. J. Virol. Methods 43, 6576 (1993). Delacroix, D. L.: The human immunoglobulin A system, its vascular compartment. Thesis European Medical Press (1985). Doerr, H. W., Rentschler, M., Schleifer, G.: Serologic detection of active infections with human herpes viruses (CMV, EBV, HSV, VZV) diagnostic potential of IgA class and IgG subclassspecific antibodies. Infection 15, 9398 (1987). Engelhard, D., Weinberg, M., Or, R., Shaked, O., Naparstek, E., Haikin, H., Slavin, S., Sarov, I.: Immunoglobulins A, G and M to cytomegalovirus during recurrent infection in recipients of allogenic bone marrow transplantation. J. Infect. Dis. 163, 628630 (1991). Levy, E., Margalith, M., Sarov, B., Sarov, I., Rinaldo, C. R., Detels, R., Phair, J., Kaslow, R., Ginzburg, H., Saah, A. J.: Cytomegalovirus IgG and IgA serum antibodies in a study of HIV infection and HIV related diseases in homosexual men. J. Med. Virol. 35, 174179 (1991). Linde, G. A., Hammarström, L., Persson, M. A. et al.: Virusspecific antibody activity of different subclasses of immunoglobulins G and A in cytomegalovirus infections. Infect. Immun. 42, 237244 (1983). Merlino, C., Angeretti, A., Segoloni, G. P., Giacchino, F., Rossetti, M., Negro Ponzi, A.: CMVspecific polymeric and monomeric IgA antibodies in serum of renal transplant patients. Panminerva Med., Vol. 33, Nr. 4, 173179 (1991). Nielsen, L. N., Sorensen, I., Andersen, H. K.: Kinetics of specific immunoglobulins M, E, A, and G in congenital primary, and secondary cytomegalovirus infection studied by antibodycaptured enzymelinked immunosorbent assay. J. Clin. Microbiol. 26, 654661 (1988). Porath, A., Hanuka, N., Keynan, A., Sarov, I.: Virusspecific IgG, IgM, and IgA antibodies in cytomegalovirus mononucleosis patients as determined by immunoblotting technique. J. Med. Virol. 22, 223230 (1987). 112PKSVPCZ/010512 12
Rautenberg, P., Fischer, L., Tönnies, R., Franke, D.: Evaluation of a novel immunoglobulin A capture enzyme immunoassay for diagnosis of cytomegalovirus infection in renal and heart transplant recipients. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 16, 653659 (1997). Sarov, I., SiqueiraLinhares, M., Chardonnet, Y., Levy, E., Aymard, M., Bosshard, S., Nord, E., Revillard, J. P.: Detection of specific IgA antibodies in serum of kidney transplant patients with recurrent cytomegalovirus infection. Intervirology 15, 228234 (1981). Sarov, I., Haikin, H.: Human cytomegalovirus specific IgA antibodies detected by immunoperoxidase assay in serum of patients with cytomegalovirus infections. J. Virol. Methods 6, 161169 (1983). Strand, O. A., Hoddewick, G. M.: The diagnostic significance of specific serum IgA detection in cytomegalovirus infections. Arch. Virol. 82, 173180 (1984). Tönnies, R., Flik, J., Franke, D., Metzger, C., Daiminger, A., Bäder, U., Enders, G.: Comparison of three methods used to differentiate between primary and recurrent or longterm human cytomegalovirus infections in pregnant women. Poster presented at the 6th International Cytomegalovirus Workshop, Orange Beach, AL, USA (1997). Torfason, E. G., Källänder, C. and Halonen, P.: Solidphase radioimmunoassay of serum IgG, IgM and IgA antibody to cytomegalovirus. J. Med. Virol. 7, 8596 (1981). Weber, B., Hamann, A., Ritt, B., Rabenau, H., Braun, W., Doerr, H. W. : Comparison of shell viral culture and serology for the diagnosis of human cytomegalovirus infection in neonates and immunocompromised subjects. Clin. Investig. 70, 503507 (1992). Weber, B., Klinghardt, U., Lux, A., Braun, W., Rabenau, H., Doerr, H. W.: Detection of neutralizing antibodies against human cytomegalovirus: influence of strain variation. J. Med. Virol. 40, 2834 (1993). 112PKSVPCZ/010512 13