Identifikace drog v pevném stavu pomocí spektrálních metod imunochemické diagnostické testy Identifikace drog v pevném stavu pomocí spektrálních metod infračervená spektrometrie Spektrální metody představují ve forenzní chemii jedny z hlavních a dynamicky se rozvíjejících metod. Umožňují objektivní identifikaci neznámé látky na základě různých fyzikálně-chemických principů. Jednou z metod, které se ve forenzních laboratořích běžně používají je infračervená spektrometrie (I). Infračerveným zářením rozumíme elektromagnetické záření v rozsahu přibližně 800 nm až 1000 µm. Na rozdíl od spektrometrie ve viditelné nebo UV oblasti, kdy je principem absorpce záření excitace valenčního elektronu na vyšší energetickou hladinu, využívá infračervená spektrometrie záření s nižší energií. Při absorpci infračerveného záření molekulou dochází ke změnám v jejich vibračních stavech, které jsou charakteristické pro určité vlnočty (namísto vlnové délky se v I používá jednotka vlnočet jde o reciprokou hodnotu vlnové délky vyjádřené v cm -1 ). Atomy v molekulách vibrují na určitých frekvencích. Je-li frekvence I záření shodná s frekvencí vibrace daného atomu, dojde k absorpci tohoto záření. Mnohé funkční skupiny jsou charakteristické svými vlnočty a tak lze kromě identifikace neznámé látky rovněž získat alespoň základní informace o její možné struktuře. Klasickou metodou infračervené spektroskopie je transmisní měření I spekter, při kterém dochází k absorpci I záření zkoumanou látkou. Výsledkem je tzv. infračervené spektrum, které poskytuje jak zmíněné informace o některých funkčních skupinách, tak v oblasti cca 200 1500 cm -1 také tzv. otisk prstu, který je pro každou individuální chemickou struktury charakteristický, a lze jej použít k identifikaci neznámé látky. Výhodou I je možnost měření vzorků jak v kapalném stavu (např. tenký film), tak ve stavu pevném (homogenizací a slisování tablety s KBr nebo tzv. nujolová metoda, při které je látka měřena v chemicky inertním minerálním oleji). Značnou nevýhodou infračervené spektroskopie je fakt, že voda (jakožto nejběžnější rozpouštědlo) vykazuje silnou absorpci I záření a je nutné analyzované vzorky, stejně jako veškerý použitý materiál důkladně vysušit. Infračervená spektrometrie se v analýze drog využívá především k rychlé identifikaci chemického složení pevné drogy, při záchytu drog (drogový dealeři, letiště, kontrola nelegálních skladů apod.). Vychází se z předpokladu, že hlavní substancí v zadržené látce je samotná droga. Postup práce je velice jednoduchý. Zadržená látka, která pravděpodobně obsahuje drogu se smíchá s pevným KBr (obvykle v poměru 1:100 ve prospěch KBr). Z této směsi se vylisuje tableta, která se proměří v I spektrometru. Následuje identifikace srovnáním získaného spektra neznámé látky s knihovou spekter, případně se proměří i standard. Tento jednoduchý postup se využívá v kriminalistických laboratořích ke konečné identifikaci hlavní substance v zadržených podezřelých látkách. Bohužel tento postu není vhodný pro rychlý předběžný průkaz přímo v terénu. Pro tyto účely jsou pak vhodné barevné reakce, které je možné udělat ihned po zadržení podezřelé látky.
Barevné reakce drog ( pill testing ) Vzhledem k tomu, že organických látek vč. kontrolovaných substancí (návykové látky, léčiva, prekurzory apod.) existují tisíce, před vlastní instrumentální analýzou je vhodné předběžnými kvalitativními metodami zúžit okruh možných látek nebo některé zcela vyloučit. Kromě základního fyzikálně-chemického popisu (vzhled, barva, krystalická struktura, rozpustnost, fluorescence, zápach, ph roztoku apod.) je lze některými předběžnými reakcemi prokázat nebo vyloučit přítomnost neznámé látky ve vzorku. Chemické reakce vedoucí k úplné či předběžné identifikaci podezřelé látky (návykové látky, psychofarmaka či jiného léčiva) představují širokou škálu metod založených na jednoduchých testech, které v ideálním případě vyloučí či přímo potvrdí přítomnost zkoumané látky ve vzorku. V mnoha případech se jedná o běžné chemické reakce využívané zejména v kvalitativní analýze organických sloučenin založených na více či méně selektivních reakcích různých funkčních skupin s určitým činidlem. Existuje celá řada postupů a metod, kterými lze prokázat hledanou látku ve vzorku. Obecně platí, že pro praktické aplikace je vhodné nalézt co nejvíce specifický test, který probíhá za běžných podmínek (laboratorní teplota, dostupná rozpouštědla, materiál apod.), využívají se při něm netoxické chemikálie a lze jej nejlépe provádět i mimo laboratoř (tzn. např. na místě činu, při policejních či celních kontrolách apod.) a jejichž použití a vyhodnocení zvládne i osoba bez odborného vzdělání v příslušeném oboru. Mnohé z těchto testovacích reakcí pak využívají i samotní konzumenti nebo distributoři návykových látek aby předešli možné nebo záměrné záměně za látku jinou, mnohdy podstatně nebezpečnější (tzv. pill testing ). Předběžný test je obvykle prováděn s několika činidly a to se vzorkem přímo v pevném stavu (např. krystalický metamfetamin) nebo po jeho převedení do roztoku v příslušném rozpouštědle (nejčastěji voda nebo polární organická rozpouštědla jako např. methanol nebo ethanol). Níže je uveden přehled nejběžněji používaných chemických činidel, která se v praxi využívají k detekci široké škály podezřelých látek. 1.) Marquisova reakce Jedná se o jednu z nejběžnějších předběžných reakcí při testování podezřelých látek. Využívá se jí nejen při analýze drog ale rovněž k identifikaci alkaloidů či běžně používaných léčiv, což výrazně snižuje její selektivitu. Nicméně její relativní jednoduchost a zejména kombinace s doplňujícími testy (viz níže) může vést k dostatečně věrohodnému průkazu hledané látky ve vzorku. Využívá se především při testování extáze (MDMA), drog odvozených od amfetaminů (deriváty fenylethylaminů) a opiátů. Marquisovou reakcí lze od sebe např. rozlišit nejčastěji zneužívané drogy MDMA a metamfetamin, které mnohými dalšími reakčními činidly odlišit nelze. Jako činidlo se využívá směs koncentrované kyseliny sírové a formaldehydu (100 ml 98 % kyseliny sírové se opatrně smíchá s 5 ml 38-40 % vodného roztoku formaldehydu). Mechanismus reakce je poměrně složitý, obecně lze říci, že je založen na polymerizaci molekul zkoumané látky a formaldehydu v prostředí kys. sírové, kdy vznikají nabité oxoniové nebo karboniové sloučeniny (obr. 1). Příklad reakce Marquisova činidla s látkami amfetaminového typu je uveden na obr. 2.
O + O C C + Obr. 1: Oxoniový resp. karboniový ion. N H H N N H C + Obr. 2 : Marquisova reakce amfetaminu ( = H) nebo metamfetaminu ( = ). Marquisovo činidlo je vhodné zejména pro opiáty, se kterými poskytuje tmavě fialové nebo červenofialové produkty. Naopak častá náhražka nebo ředidlo drog na bázi opiátů (heroin, morfin, kodein atp.), dextrometorfan (DXM) poskytuje s tímto činidlem temně černou sraženinu. Lze tak snadno odlišit DXM od jiných opiátů nebo opioidů. S látkami amfetaminového typu vznikají produkty červené až hnědé barvy, které postupem času tmavnou. Obsahuje-li molekula methylendioxidový skelet (např. MDMA) pak je zbarvení fialové. Marquisovo činidlo však reaguje i s mnoha běžnými látkami (z nichž se některé mohou vyskytovat jako ředidla pro fiktivní zvětšení dávky drogy). Mezi tyto látky patří např. cukry (sacharóza, glukóza), které mají charakteristickou tmavě hnědou barvu. Typická je pak reakce s kyselinou acetylsalicylovou (aspirin), které poskytuje červený nebo oranžový produkt (avšak až po delší době cca 2-3 min) a může tak vést k falešně pozitivnímu závěru na přítomnost amfetaminů. 2.) Simonovo činidlo Simonovo činidlo je relativně selektivním činidlem pro aromatické sekundární aminy (jeho modifikace známá jako obadopovo činidlo pak také pro aminy primární). Pozitivní reakce se projeví jako světle či tmavě modré zbarvení, při nižší koncentraci zkoumané látky často až po několika minutách. Jedná se o reakci sekundárního aminu s acetaldehydem za vzniku enaminu, který následně reaguje s nitroprussidem sodným za vzniku immoniové soli, která je následně hydrolyzována na tzv. Simon-Aweův komplex (Obr. 3). Ten je charakteristický svým modrým zbarvením.
Obr. 3: Simonova reakce s metamfetaminem za vzniku barevného Simon-Aweova komplexu s nitroprussidem sodným. eakce je poměrně selektivní, avšak reaguje s mnoha jinými sekundárními aminy a proto je nutné potvrdit přítomnost hledané látky i dalším testem. 3.) Chen-Kaovo činidlo Některé látky, které jsou samy považovány za drogy nebo jejich prekurzory nereagují s žádným běžným činidlem. Typickým příkladem je efedrin a jeho deriváty (vč. enantiomerů). Ačkoli je efedrin rovněž sekundární amin, obsahuje ve své molekule hydroxylovou skupinu a díky tomu poskytuje negativní reakci se Simonovým činidlem. Vzhledem k tomu, že efedrin a jeho deriváty (pseudoefedrin, chloroefedrin, chloropseudoefedrin apod.) jsou důležitými výchozími látkami při syntéze metamfetaminu (obr. 4), je činidlo na tento typ látek velice důležité. A) B) Obr. 4: Syntéza metamfetaminu z efedrinu (resp. chloroefedrinu, A) a stereoselektivní syntéza z (+) nebo (-) pseudoefedrinu redukcí kyselinou jodovodíkovou za katalýzy fosforem (nejčastější ilegální metoda).
Chen-Kaova reakce využívá vznik fialového nebo modrého komplexu s ionty mědi (obr. 5) a je více méně selektivní pro fenylalkylaminy s vicinálními amino a hydroxy skupinami. S látkami amfetaminového typu reakce neprobíhá. eakce však může probíhat také s norefedrinem nebo chloroderiváty efedrinu. Zbarvení pak bývá tmavě modré. Vzniklý komplex je možné extrahovat do nepolárního rozpouštědla, např. diethyl etheru nebo n-butanolu. Obr. 5: Chen-Kaova reakce s efedrinem (resp. norefedrinem) za vzniku komplexu s měďnatými ionty. 4.) Detekce THC pomocí diazoniových solí řady Fast Tzv. Fast soli jsou diazoniové sloučeniny využívané v analytické chemii a biochemii především jako barviva nebo derivatizační činidla. Několik látek z této řady však umožňují značně selektivní detekci THC v marihuaně a produktech z ní. Jednou z nejpoužívanějších je Fast Blue B (nebo také BB, obr. 6). Obr. 6: Struktura soli Fast Blue B Tato látka reaguje v bazickém prostředí se dvěma molekulami THC za vzniku charakteristicky zbarvené sloučeniny (obr. 7). Barva a rychlost reakce záleží na typu barviva, v praxi se nejčastěji používá zmíněná Fast Blue B (pozitivní reakce se projeví jasně červenou barvou) a dále pak Fast Garnet GC (výsledná barva je oranžová), Fast Blue (výsledná barva je růžová) nebo Fast Corinth V (výsledná barva je fialová). Nejběžnější metodou detekce je provedení extrakce podezřelé látky (např. sušené marihuany nebo hašiše) do etanolu s následným přídavkem zvolené Fast soli (obvykle smíchané s bezvodým síranem sodným v poměru 1:100). Bazické prostředí je zajištěno přidáním několika kapek 2-5 % roztoku uhličitanu sodného. Pokud barva extraktu znemožňuje pozorovat barevnou změnu, lze barevný produkt vyextrahovat do nepolárního rozpouštědla (např. chloroform).
Obr. 7 Výsledný produkt reakce THC s diazoniovým barvivem Fast Blue B. Imunochemické testy pro detekci drog Zatímco barevné reakce spolu s infračervenou spektrometrií umožňují identifikovat přímo drogu ve zdrojovém materiálu (zadržený prášek, tablety apod.), není možné tyto metody využít pro přímou orientační identifikaci zneužití drog a dalších omamných a psychotropních látek. Je také potřebné vzít do úvahy, že po požití a absorpci drogy dochází v drtivé většině případů k její metabolizaci a koncentrace původní formy v biologickém materiál postupně klesá. V tomto případě lze využit imunochemické diagnostické testy. Imunochemické metody jsou založeny na specifické reakci antigenu (resp. analytu) s přítomnou protilátkou. Podmínkou je existence specifické protilátky, která je citlivá na přítomnost analytu ve vzorku. Tyto metody pracují na principu kompetice mezi analytem a značeným analytem (nejčastěji radioaktivně, fluorescenčně, enzymaticky atd.) o přítomnou protilátku. Detekce analytu je poté založena na jeho schopnosti vytěsnit značený analyt z vazby na protilátku. Jedná se o technicky nenáročné metody, které jsou však často nedostatečně specifické, a proto je nutné potvrdit pozitivní výsledek jinou objektivní analytickou metodou. V současné době pracují specializované laboratoře s automatickými imunoanalyzátory, které jsou schopny rychle analyzovat především biologické vzorky. Pro rychlou orientační analýzu nebo potvrzení však existují i jednorázové imunochromatografické testy, které pracují na obdobném principu s vizuálním vyhodnocením výsledku (obr. 8). Obr. 8: Imunochromatografický test s naznačeným vyhodnocením výsledku. Imunochromatografické testy fungují na principu chromatografického vzlínání vzorku podobně jako třeba papírová chromatografie nebo TLC. Testovaný vzorek vzlíná do oblasti,
kde je umístěna značená protilátka (v těchto případech obvykle barevně). Pokud testovaný vzorek neobsahuje hledanou látku (nebo je její obsah nižší než je detekční limit daného testu), nedojde k navázání protilátky (tedy ani ke kompetici) a v určité oblasti testu se protilátka naváže na tzv. drogový protein (který je imobilizovaný v testu). Negativní výsledek se potom projeví jako dvě viditelné barevné zóny (viz obrázek 8). V opačném případě přítomný analyt zamezuje navázání protilátky na drogový protein a sám s ním vytvoří komplex. To se projeví jako chybějící barevná zóna v testu. Pro ověření funkčnosti testu musí být druhá (tzv. kontrolní) zóna vždy pozitivní bez ohledu na přítomnost hledané látky. Imunochemické testy mohou být vysoce specifické (např. test na THC, resp. jeho metabolit), na druhou stranu však mohou reagovat neselektivně s celou řadou podobných látek včetně metabolitů. Tento fakt je nutno brát v potaz při vyhodnocení výsledku a imunochemický test by měl vždy sloužit spíše jako rychlá a orientační metoda k potvrzení nebo vyloučení hledaných látek. Úkol: 1) Proveďte identifikace neznámého prášku s pomocí barevných reakcí na drogy a dále s pomocí infračervené spektrometrie. 2) Proveďte identifikaci zneužité drogy v moči s pomocí imunochemických diagnostických testů. Pomůcky a chemikálie: bromid draselný, roztoky činidel (Marquisovo, Chen-Kaovo, Simonovo, Fast Blue B), imunochemické diagnostké testy, infračervený spektrometr, lis na tablety. Doplňující otázky: 1. Které další spektrální metody je možné využít k rychlé identifikaci drog v pevném či kapalném stavu? 2. Je možné pro identifikaci drog využít kromě imunochemických metod také enzymatické metody? Použitá literatura: 1. A. C. Moffat: Clark Analysis of Drugs and Poisons, 3 rd edition, Vol. 1, Pharmaceutical Press, 2004. 2. B. Levine ed., Principles of Forensic Toxicology, 4 th edition, AACC Press, 2013. 3. http://www.dancesafe.org/testing-kit-instructions/.