HYDRAGEL PROTEINURIE K20 Ref. 3004 2006/12
POUŽITÍ KITU HYDRAGEL PROTEINURIE K20 kit je určen ke klasifikaci proteinurie v nezahuštěné moči. Kit se používá ve spojení s manuálním elektroforetickým zařízením. Elektroforéza na neutrálně pufrovaných SDS-agarózových gelech separuje močové bílkoviny podle jejich molekulové hmotnosti a zcela jasně odlišuje bílkoviny tubulárního od bílkovin glomerulárního původu. Výsledek elektroforetického dělení proteinů obarvených kyselou violetí je vizuálně porovnáván s proteinovým markerem v referenční stopě. Tak lze identifikovat jednotlivé bílkoviny a proteinurii správně klasifikovat. Každý agarózový gel kitu HYDRAGEL PROTEINURIE K20 je určen k analýze 5-ti vzorků. Určeno pro diagnostické použití in vitro. PRINCIP TESTU V přebytku anionického detergentu SDS (Sodium Dodecyl Sulfate laurylsíran sodný) jsou bílkoviny změněny v komplexy obsahující SDS. V těchto komplexech dochází k rozrušení nativní struktury bílkovin a zaujetí uniformní struktury o stejném negativním elektrickém náboji na jednotku hmotnosti. Při elektroforéze na mediu s vlastnostmi síta jako jsou HYDRAGEL 5 PROTEINURIE gely s vysokou koncentrací agarózy, dochází k rozdělení bílkovin dle jejich molekulární hmotnosti (dále jen MV). Jednotlivé bílkoviny tubulárního původu (MV < 65-70 kda) jsou jasně odlišeny od glomerulárních (MV > 65-70 kda). Dle detekovaných bílkovin lze proteinurii klasifikovat jako tubulární, glomerulární a smíšenou. Nastavení parametrů procedury a citlivost barvení kyselou violetí umožňuje detekci proteinů bez předchozího zahuštění moče. Minimální detekční hladina je 15 mg/l pro frakci. REAGENCIE A MATERIÁL OBSAŽENÝ V KITU HYDRAGEL PROTEINURIE K20 POLOŽKA KAT. Č. 3004 Agarózové gely (hotovy k použití) 10 gelů SDS pufr (zásobní roztok) 3 lahv. po 100 ml Kyselá violeť (zásobní roztok) 1 lahv. 75 ml Odbarvovací roztok (zásobní roztok) 1 lahv. 100 ml Diluent (hotov k použití) 1 lahv. 1 ml Proužky filtračního papíru 1 bal. po 10 ks PRO OPTIMÁLNÍ VÝSLEDKY : Všechny reagenty ze stejné sady musí být vždy používány společně a podle pokynů v příbalovém letáku. PROSÍME, ČTĚTE PEČLIVĚ PŘÍBALOVÝ LETÁK. 1. AGARÓZOVÉ GELY Připraveny k použití, každý gel obsahuje agarózu 5 g/dl, neutrální pufr o ph 7.0 ± 0.1, SDS (laurylsíran sodný) a přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. Nosné medium pro elektroforézu bílkovin v moči. Skladujte v horizontální poloze v originálních ochranných obalech šipkou na přední straně krabice směrem nahoru. Lze skladovat při pokojové teplotě (15-30 C). NEMRAZIT A NECHLADIT! Zamezit prudkým změnám teploty neskladovat v blízkosti oken nebo tepelného zdroje. Stabilní do doby exspirace vyznačené na krabici či štítcích na obalech gelů. Nepoužívejte : (i) v případě nálezu krystalů nebo precipitátů na povrchu gelů a pokud struktura gelu v důsledku zmrazení změkne, (ii) jsou-li přítomny mikroby a plísně, (iii) abnormální množství tekutiny v obalu gelu (výsledek vypocení pufru z gelu v důsledku nesprávného skladování). 2. SDS PUFR Každá lahvička zásobního roztoku pufru se doplní do 1 litru destilovanou nebo deionizovanou vodou. Promíchat velmi opatrně, aby se zabránilo vzniku pěny. Pracovní roztok po zředění obsahuje neutrální pufr o ph 7.0 ± 0.3, SDS, a přídavné látky, nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. Elektroforetický pufr. Pufr lze skladovat při pokojové teplotě nebo v chladničce. Je stabilní několik let, nejméně do data expirace vyznačeného na balení či lahvičkách. Zředěný pufr je stabilní po dobu 1 roku při pokojové teplotě v uzavřené láhvi. Při zjištění zákalu v roztoku, který je obvykle známkou mikrobiální kontaminace, je nutno pufr vylít. POZNÁMKA : Zásobní roztok se může zakalit nebo gelifikovat při nízkých teplotách k projasnění stačí zahřátí na 37 C. - 83 - SEBIA NÁVOD - Czech
3. KYSELÁ VIOLEŤ HYDRAGEL PROTEINURIE K20-2006/12 Obsah lahvičky se zásobním roztokem kyselé violeti doplňte do 300 ml destilovanou nebo deionizovanou vodou. Po rozředění pracovní barvící roztok obsahuje kyselý roztok ph 2, kyselou violeť, 0.2 g/dl, 3.25 % etylen glykol, a přídavné látky nezbytné pro optimální provedení testu, v koncentracích, které neškodí zdraví. UPOZORNĚNÍ : Nepolykat, zdraví škodlivé! Pro barvení gelů po elektroforéze a imunofixaci. Zásobní i pracovní roztok se skladuje při pokojové teplotě nebo při 2-8 C v těsně uzavřených nádobách tak, aby nedošlo k odpařování. Zásobní roztok je stabilní do data expirace vyznačeného na obalu či na štítku lahvičky. Pracovní roztok vydrží 6 měsíců. 4. ODBARVOVACÍ ROZTOK Každá lahvička zásobního odbarvovacího roztoku je určena k přípravě 100 litrů pracovního odbarvovacího roztoku. Je výhodné připravovat jen 1 litr pracovního roztoku doplněním 1 ml zásobního roztoku do 1 litru destilovanou nebo deionizovanou vodou. Pracovní roztok obsahuje 0.05 g/dl kyseliny citronové. Roztokem se odstraňuje přebytečné množství barvičky a odbarvuje se pozadí agarózové plotny. Skladujte při pokojové teplotě nebo v chladničce. Roztok je stabilní do doby expirace vyznačené na obalu soupravy nebo na štítku lahvičky. Pracovní odbarvovací roztok je stabilní 1 týden při pokojové teplotě v uzavřené láhvi. Nepřidávejte azid sodný. Nepoužívat při změně vzhledu, vzniku zákalu nebo precipitátu v roztoku. K zabránění mikrobiálního růstu v pracovním roztoku skladovaném déle než 1 týden lze přidat 5 µl/dl ProClin 300. Pracovní odbarvovací roztok s přídavkem ProClinu je stabilní v uzavřené nádobě do doby expirace vyznačené na obalu soupravy nebo na štítku lahvičky. 5. DILUENT Diluent je připraven k okamžitému použití. Obsahuje : neutrální pufr o ph 7.0 ± 0.3, SDS bromfenolovou modř, a přídavné látky, nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. K ředění a úpravě vzorků moči. Bromfenolová modř slouží jako praktický aplikační a migrační marker. Skladujte při pokojové teplotě. Je stabilní do doby expirace vyznačené na obalu kitu a na štítcích jednotlivých lahviček. V roztoku nesmí být sraženiny. 6. PROUŽKY FILTRAČNÍHO PAPÍRU Určeny k odsátí přebytečné tekutiny z povrchu gelu před aplikací vzorků. DALŠÍ POTŘEBNÉ REAGENCIE 1. KONZERVAČNÍ ROZTOK Připravte 15 % roztok glycerinu v destilované nebo deionizované vodě (obj. / obj.). K prevenci poškození (pokrčení či roztržení) gelu v průběhu sušení. Skladuje se při teplotě místnosti nebo v chladničce v uzavřené láhvi. Tentýž roztok lze použít na 10 gelů. Při změně vzhledu, tj. výskytu zákalu způsobeného mikrobiální kontaminací, roztok nepoužívejte. 2. FYZIOLOGICKÝ ROZTOK Připravte 0.15 M (0.9 g/dl) roztok NaCl v destilované nebo v deionizované vodě. Používá se k ředění vzorků moče s koncentrací bílkovin > 0.2 g/dl. Vydrží asi 3 měsíce v těsně uzavřených láhvích při pokojové teplotě. Přestaňte používat po 3 měsících nebo při změně vzhledu, tj. výskytu zákalu způsobeného mikrobiální kontaminací. Pro delší skladování lze konzervovat 0.1 g/dl azidem sodným. - 84 -
ZAŘÍZENÍ NEZBYTNÁ K PROVEDENÍ TESTU 1. Zdroj proudu : MG 300 SEBIA, kat. č. 1302 nebo MG 500 SEBIA, kat. č. 1303. 2. Elektroforetická komora : K20 SEBIA, kat. č. 1400. 3. Nádobky a držáky gelů pro manipulaci s nimi HYDRAGEL K20 Accessory Kit SEBIA, kat. č. 1420. 4. Pipety 5 µl, 20 µl a 200 µl. 5. Sušička - Inkubátor, IS 80 SEBIA, kat. č. 1430. 6. Markery molekulární hmotnosti, např. : Molecular Mass Control, SEBIA kat. č. 4781 nebo LMW Calibration kit, Pharmacia. ANALYZOVANÉ VZORKY Odběr a skladování vzorku Provádíme pouze analýzu čerstvých močí, sbíraných 24 hodin. Lze skladovat v chladničce ihned po odběru po dobu jednoho týdne. Zmražené vzorky vydrží až 1 měsíc. Zmražení s přídavkem HEPES 0.1 M (ph 6.75) a 0.02 g/dl azidu sodného zvyšuje stabilitu skladování vzorku. DŮLEŽITÉ : Kyselinu boritou jako konzervans nepoužívejte. Zmražené vzorky po rozpuštění zanechávají na startu stopu z denaturovaných proteinů. vzorků Vezměte 20 µl diluentu (roztok je viskózní pozor na vznik bublinek během pipetování) a přeneste na dno mikrozkumavky nesmí zůstat na stěně. Přidejte 80 µl čisté moči a 5 sec. promíchejte na vortexu. Vzorek nesmí obsahovat více než 0.2 g/dl bílkovin. Při vyšší koncentraci se moč ředí fyziologickým roztokem a potom se pokračuje standardním způsobem. POZNÁMKA : Je -li zákal v analyzované moči, může být bržděna difúze do špiček aplikátoru. V tomto případě se doporučuje odstranit částice působící zákal centrifugací (např. 10 min. při 3000 ot./min.) nebo filtrací (např. stříkačkový filtr 0.45 µm). PRACOVNÍ POSTUP I. MIGRACE 1. Z obalu opatrně vyjměte agarózovou plotnu. 2. Přebytek tekutiny v jamkách rychle osušte proužkem filtračního papíru tak, že jej přiložíte přes jamky. 3. Napipetujte pečlivě 5 µl upraveného vzorku moče do každé jamky bez přenesení bublin. Po každé aplikaci vyměňte špičku pipety. Během pipetování se nesmíte dotknout dna jamek. 4. Po dobu 10 minut nechejte vzorky difundovat do gelu. 5. Při použití migrační komory SEBIA K20 : - Naplňte pečlivě komůrku bez vzniku pěny pokud se pěna vytvoří, musíte počkat až do okamžiku, kdy pěna na hladině pufru zmizí. - Umístěte HYDRAGEL gelovou stranou směrem dolů můstek musí být mimo komůrku (prevence vniknutí pufru do jamek). - Můstek vložte opatrně do nádržky (vzorky na katodické straně). Gel se ponoří na každé straně asi 1 cm do pufru. Další detaily - viz návod k migrační komoře K20. 6. Připojte migrační komoru ke zdroji proudu. PODMÍNKY MIGRACE Objem pufru ke každé elektrodě Celkový objem pufru Čas migrace Konstantní napětí Počáteční proud (na gel) SEBIA K20 150 ml 300 ml 60 minut 60 V 10 ± 2 ma 7. Asi 5 minut před ukončením dělení předehřejte v inkubátoru skleněnou plotnu velikosti gelu (nebo větší) na 80 C. 8. Po ukončení migrace komůrku odpojte od proudového zdroje a gelovou plotnu vyjměte. Modrý marker musí být umístěn asi 10 mm od anodického okraje gelu. II. BARVENÍ A ODBARVOVÁNÍ 1. Ihned položte gel na předehřátou skleněnou plotnu a důkladně jej osušte v sušičce při 80 C po dobu minimálně 20 minut. 2. Vložte vysušený a ochlazený gel do držáku (součást SEBIA HYDRAGEL K20 Accessory Kitu). Ponořte držák vertikálně do barvícího roztoku po dobu přesně 30 minut. POZNÁMKA : Pokud gel nebude hned zpracován, je nutné jej před barvením nechat znovu sušit po dobu 15 minut. 3. Nyní opláchněte přebytek barvícího roztoku na gelu v destilované vodě. 4. Odbarvujte vertikálně v jedné lázni odbarvovacího roztoku (300 ml) po dobu 45 min. III. ZÁVĚREČNÉ ZPRACOVÁNÍ 1. Ponořte odbarvený gel na 15 minut do lázně s konzervačním roztokem. 2. Umístěte gel vertikálně na 2 minuty na horní plochu savého papíru k odstranění přebytku konzervačního roztoku. 3. Osušte gel proudem 80 C teplého vzduchu - po dobu nejméně 15 minut. Je-li třeba, očistěte zadní plastikovou podpůrnou část gelové plotny vlhkým měkkým hadříkem nebo buničinou. - 85 -
VÝSLEDKY Kontrola kvality Doporučuje se zařadit na každou sérii vzorků kontrolu se známými hodnotami molekulárních hmotností. Interpretace 1-13 Interpretace je kvalitativní, dále viz LITERATURA. Fyziologická proteinurie Je nízká, 120 mg / 24 hod. bez signifikantního rozdílu mezi pohlavími. Hlavním proteinem je albumin sdružený se stopami transferinu a imunoglobulinů. Proteinurie nad 120 mg / 24 hod. musí být považována za patologickou. Měla by (> 120 mg / 24 hod.) být vždy následována kvalitativní analýzou vyloučených proteinů. Glomerulární proteinurie Je charakterizována výskytem proteinů s molekulární hmotností > 65-70 kda (např. : albumin, transferin, Ig G) lokalizovanými mezi bodem aplikace vzorku a frakcí albuminu. Albumin je hlavní frakcí. Tubulární proteinurie Je charakterizována bílkovinami s molekulární hmotností < 65-70 kda lokalizovanými mezi albuminovou frakcí a anodickou stranou gelu - např. : alfa-1 mikroglobulin, monoklonální volné lehké řetězce, ß-2 mikroglobulin, RBP (retinol binding protein), lysozym. U tubulární proteinurie je albumin druhořadou frakcí. Kromě monomerů (25 kda) mohou být přítomny dimery (50 kda) a vyšší polymerizované formy volných lehkých řetězců. Vzácně lze pozorovat jen jeden proužek polymerizovaných lehkých řetězců. K rozlišení polyklonálních volných lehkých řetězců od monoklonálních volných lehkých řetězců lze použít imunofixaci (HYDRAGEL BENCE JONES K20 kit SEBIA, kat. č. 3038). K potvrzení přítomnosti lehkých řetězců v proužku, o nichž se dá předpokládat, že jsou polymery, by vzorky měly být ošetřeny redukující reagencií (např. : ß-merkaptoetanol), jež slouží k depolymerizaci lehkých řetězců a elektroforéza by měla být opakována. Přidejte 5 µl ß-merkaptoetanolu 10 ti-násobně naředěného destilovanou nebo deionizovanou vodou ke 100 µl moči, dobře promíchejte a přidejte diluent (viz čl. vzorků). Smíšená proteinurie Vyznačuje se přítomností tubulárních i glomerulárních bílkovin. Omezení Zmražené a znovu rozmražené vzorky mohou zanechávat na startu stopu denaturovaných proteinů. Díky omezené rozlišovací schopnosti a citlivosti zónové elektroforézy, je možné, že některé monoklonální komponenty nebudou detekovány touto metodou. Problémy Pokud testy nevycházejí při dodržení veškerých instrukcí pro přípravu, skladování a provedení testu uvedených v příbalovém letáku, volejte Technicko- Servisní středisko vašeho dodavatele. Soupravy, reagencie, bezpečnostní listy a informace o likvidaci odpadu jsou dostupné na Technicko-Servisním středisku vašeho dodavatele. HODNOTY Všechny elektroforeogramy byly hodnoceny vizuálně. Reprodukovatelnost Byly použity močové vzorky s tubulární, glomerulární a smíšenou proteinúrií. Kontrola molekulové hmotnosti (Pharmacia) byla aplikovaná vždy do jedné jamky každého gelu. Reprodukovatelnost na gelu Tři vzorky byly aplikovány do čtyřech jamek každého gelu. Reprodukovatelnost mezi gely Čtyři různé vzorky byly aplikovány na každý z 10-ti gelů stejné šarže. Reprodukovatelnost mezi šaržemi Čtyři různé vzorky byly aplikovány do čtyřech jamek každého gelu třech různých šarží. Po vizuální analýze elektroforeogramů nebyly pozorovány žádné rozdíly mezi opakováními. Přesnost Byl použit nemocniční močový vzorek (n = 90) a moče zdravých dospělých jedinců (n = 14). Močové proteiny, zvolené jako indikátory typu nefropatie (alfa-1 mikroglobulin, beta-2 mikroglobulin, volné a vázané kappa lehké řetězce a volné a vázané lambda lehké řetězce pro tubulární poškození, a Ig G, albumin a transferin pro glomerulární poškození), byly každý kvantitativně anylyzován v laboratoři klinické biochemie imunologickou metodou : nefelometricky (Beckman Array systém) nebo imunoenzymaticky (Abbot IMX system). Analýzy byly provedeny na čerstvých močových vzorcích. Vzorky pro elektroforetickou slepou analýzu byly ochlazeny a použity po čtyřech dnech po odběru. Výsledky kvantitativní proteinové analýzy byly interpretovány pro každou jednotlivou bílkovinu ve smyslu stanovení tubulárního, glomerulárního, nebo smíšeného (mixed, mixed mostly tubular or mixed mostly glomerular) poškození : od nulového poškození (hodnoty bílkoviny byly pod nebo na normální hodnotě) až po vážné poškození (> 5x normálních hodnot). Elektroforegramy byly hodnoceny vizuálně. Jednotlivé proteinové frakce byly identifikovány podle jejich molekulové hmotnosti. Tato byla stanovena podle kalibrační křivky založené na mobilitě márkrů molekulové hmotnosti (Pharmacia). Navíc, frakce byly semi-kvantitativně vizuálně ohodnoceny podle jejich intenzity, např., slabý, střední a silný proužek. Ve smyslu přítomnosti / nepřítomnosti nefropatie a jejího typu, interpretace výsledků kvantitativní proteinové analýzy (QPA) a SDS proteinové elektroforézy (SDS-EP) byla identická v 83 případech (80 %). V 19 případech (18 %) oba systémy detekovaly proteinurii, ale rozdílného typu, ponejvíce podle podtříd. Některé proteiny stanovené SDS-EP nebyly měřitelné pomocí QPA (např. lysozym) ; tyto případy demonstrují výhody SDS-EP, která poskytuje požadovaný elektroforeogram bílkovin přítomných v moči, oproti QPA, která je omezená na několik vybraných proteinů. - 86 -
Výsledky jsou sumarizovány níže : QPA SDS-EP počet % pozn. N N 21 20.2 identická interpretace T T 6 5.8 identická interpretace G G 11 10.6 identická interpretace S S 22 21.1 identická interpretace S(T) S(T) 12 11.5 identická interpretace S(G) S(G) 11 10.6 identická interpretace S S(G) 6 5.8 identická interpretace N, S(G), nebo G(2) T, S(T), S(G) nebo S 4 3.8 SDS-EP poskytuje kompletní profil močových proteinů zatímco QPA měří pouze reprezentativní proteiny S, S(G) or S(T) G 9 8.6 méně citlivá detekce tubulárních proteinů pomocí SDS-EP N T 1 1 detekce protein degradačních produktů pomocí SDS-EP T S(T) 1 1 detekce protein polymerizačních produktů pomocí SDS-EP Celkem 104 100 N = normální ; T = tubulární ; G = glomerulární ; S = smíšená ; S(T) = smíšená hlavně tubulární ; S(G) = smíšená hlavně glomerulární. Citlivost Citlivost detekce byla stanovena z nejvyššího ředění albuminového a lysozymového roztoků, které dávalo pozorovatelnou frakci, na 1.5 mg/dl. LITERATURA 1. Cameron JS. 1987. The nephrotic syndrome. Am J Kidney Dis, 10 : 157-171. 2. Chopin N. 1991. Étude de la protéinurie. Inf Tech Biol, 1 : 23-28. 3. Cohen R, François B, Sabot JF, Bernard P, Picq JP, Adeleine P. Étude comparative de l immunoélectrophorèse urinaire et de quatre index de sélectivité glomérulaire au cours des glomérulopathies chroniques. 1985. Path Biol, 33 : 23-26. 4. Joachim GR, Cameron JS, Chwartz M, Belker EL. 1964. Selectivity of protein excretion in patients with the nephrotic syndrome. J Clin Invest, 43, 2332-2346. 5. Laemli U.K., Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227 : 680-685. 6. Le Bricon T, Erlich D, Bengoufa D, Dussaucy M, Garnier JP, Bousquet B. 1998. SDS-agarose gel electrophoresis of urinary proteins : Application to multiple myeloma. Clin Chem., 44 : 1991-1997. 7. Le Carrer D. 1990. Protéinuries : Mise au point sur leur exploration biologique en 1990. L Eurobiologiste, 190 : 395-405. 8. Le Carrer D, Chopin N. 1994. Profil protéique urinaire : Proposition d un protocole d exploration biologique des protéinuries. Revue française des laboratoires, 269 : 29-37. 9. Le Carrer D, Nicolas A, Ducasse L. 1992. L analyse des protéinuries au laboratoire de biologie en 1992. Revue française des laboratoires, 225 : 41-47. 10. Linstedt G, Lindberg PA. 1974. Loss of tubular proteinuria pattern during urine concentration with a commercial membrane filter cell. Clin Chem Acta, 56 : 125-126. 11. Philipon C. 1989. Protéines urinaires : Intérêt clinique et interprétation. Technique et Biologie, 6 : 239-249. 12. Waller KV, Ward KM, Mahan JD, Wismatt DK. 1989. Current concepts in proteinuria. Clin Chem, 35 : 755-765. 13. Westermeier R., «Electrophoresis in Practice. A Guide to Theory and Practice», VCH Publishers, New York, NY, 1993. ELEKTROFOREOGRAM ß2 Microglobulin (12 kda) Lysozyme (15 kda) RBP (21 kda) Proteins of tubular origin (< 70 kda) Free light chains (25 kda) α1 Microprotein (33 kda) Dimer of free light chains (50 kda) Albumin (70 kda) Transferrin (80 kda) Proteins of glomerular origin (> 70 kda) Ig G (160 kda) Ig A (165 kda) Haptoglobins α2 Macroglobulin - Ig M (800-900 kda) Application point - 87 -