HYDRAGEL 7 HEMOGLOBIN(E) HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E) Ref Ref /08

Transkript

1 HYDRAGEL 7 HEMOGLOBIN(E) Ref HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E) Ref /08

2 POUŽITÍ KITU HYDRAGEL 7 HEMOGLOBIN(E) a HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E) kity jsou určeny k separaci normálních hemoglobinů (A a A 2 ) a pro detekci hlavních variant hemoglobinu : S nebo D, C nebo E, a to elektroforezou na agarózových gelech o ph 8.5. Jsou používány ve spojení s poloautomatickým systémem HYDRASYS. Výsledné elektroforegramy jsou vyhodnocovány buď vizuálně nebo denzitometricky (relativní kvantifikace jednotlivých zón). Elektroforéza na kyselých gelech (např. HYDRAGEL 7 / 15 ACID(E) HEMOGLOBIN(E)) by měla pak sloužit k potvrzení identifikace hemoglobinových variant, zvláště pak k rozlišení hemoglobinu S od D a E od C. Každý agarózový gel je určen k analýze : 7-mi vzorků - HYDRAGEL 7 HEMOGLOBIN(E) kit, 15-ti vzorků - HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E) kit. Určeno pro diagnostické použití in vitro. POZNÁMKA : V tomto návodu se název "HYDRASYS" používá pro poloautomatické přístroje HYDRASYS a HYDRASYS 2. PRINCIP TESTU Hemoglobin je komplexní molekula složená ze dvou párů polypeptidových řetězců. Každý řetězec je připojen k hemu chelátovému komplexu protoporfyrinu s dvojmocným Fe. Hem je u všech hemoglobinů stejný typ hemoglobinu je určen proteinovou částí, zvanou globin. Polypeptidové řetězce alfa, beta, gama a delta tvoří normální lidské hemoglobiny. - hemoglobin A...= alfa 2 beta 2 - hemoglobin A 2... = alfa 2 delta 2 - fetální hemoglobin F... = alfa 2 gama 2 Alfa řetězec je společný pro všechny tyto tři hemoglobiny. Prostorová struktura hemoglobinu a ostatní vlastnosti jeho bílkovinné molekuly (stejně jako u ostaních bílkovin) závisí na prostorovém uspořádání a sekvenci aminokyselin, které tyto řetězce tvoří. Substituce aminokyselin mutací je zodpovědná za tvoření variant hemoglobinu, které mají různý povrchový náboj a následně rozdílnou pohyblivost v elektroforetickém poli, jež rovněž závisí na ph a iontové síle pufru. Výsledné kvalitativní (nebo strukturální) abnormality se nazývají hemoglobinopatie. Snížená syntéza jednoho z hemoglobinových řetězců vede ke kvantitativním (nebo regulačním) abnormalitám, zvaným talasemie. Test je prováděn s hemolyzovanými propranými erytrocyty. Hemoglobiny jsou separovány elekroforeticky na alkalických gelech a frakce jsou vizualizovány obarvením amidočerní. Suché gely je možno ihned interpretovat. REAGENCIE A MATERIÁL OBSAŽENÝ V KITECH HYDRAGEL 7 HEMOGLOBIN(E) A HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E) VAROVÁNÍ : Viz bezpečnostní listy. POLOŽKY KAT. Č KAT. Č Agarózové gely (připraveny k použití) 10 gelů 10 gelů Houbičky s pufrem (připraveny k použití) 10 bal. po 2 ks 10 bal. po 2 ks Etylénglykol (EG) (připraveny k použití) 1 lahv. 3 ml 1 lahv. 3 ml Ředící roztok pro amidočerň (zásobní roztok) 1 lahv. 60 ml 1 lahv. 60 ml Amidočerň (zásobní roztok) 1 lahv. 20 ml 1 lahv. 20 ml Hemolyzační roztok (připraveny k použití) 1 lahv. 20 ml 1 lahv. 20 ml Aplikátory (připraveny k použití) 1 bal. po 10 ks (7 zubů) 1 bal. po 10 ks (15 zubů) Tenké filtrační papíry 1 bal. po 10 ks 1 bal. po 10 ks OPTIMÁLNÍ ŘÍZENÍ VYSLEDOVATELNOSTI : Všechna činidla ze stejné sady se musejí používat společně. DOSAŽENÍ OČEKÁVANÝCH VÝKONŮ : Musí se dodržovat pokyny z příbalového letáku. 1. AGARÓZOVÉ GELY Agarózové gely jsou připraveny k použití. Každý gel obsahuje : agarózu ; tlumicí roztok ph 8.5 ± 0.5 ; přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. Nosné medium pro elektroforézu hemoglobinů. Skladujte v horizontální poloze v originálních ochranných obalech šipkou na přední straně krabice směrem nahoru. Lze skladovat při pokojové teplotě (15-30 C) nebo v chladničce (2-8 C.) Zamezit prudkým změnám teploty - neskladovat v blízkosti oken nebo tepelného zdroje. Stabilní do doby exspirace vyznačené na krabici či štítcích na obalech gelů. NEMRAZIT! Nepoužívejte : (i) v případě nálezu krystalů nebo precipitátů na povrchu gelů a pokud struktura gelu v důsledku zmrazení změkne, (ii) jsou-li přítomny mikroby a plísně, (iii) abnormální množství tekutiny v obalu gelu (výsledek vypocení pufru z gelu v důsledku nesprávného skladování) SEBIA NÁVOD - Czech

3 2. PUFROVANÉ STRIPY Pufrované houbovité proužky (stripy) jsou připraveny k použití. Každý obsahuje : tlumicí roztok s ph 9.2 ± 0.5 ; přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. Slouží jako rezervoár pufru a zajišťují kontakt mezi gelem a elektrodami. Skladovat při pokojové teplotě nebo v chladničce. Jsou stabilní nejméně do data exspirace vyznačeného na balení kitu či na štítcích jednotlivých balení. NEMRAZIT! Nepoužívejte stripy z otevřených balení nebo stripy vyschlé! 3. ROZTOK ETYLÉNGLYKOLU Roztok etylénglykolu je připraven k použití. K zajištění efektivního kontaktu mezi gelem a teplotně kontrolovanou plochou migračního modulu v průběhu elektroforetického dělení. DŮLEŽITÉ : Po každém použití lahvičku s roztokem okamžitě etylenglykolu a těsně uzavřete, abyste zabránili oxidaci roztoku. Roztok etylén glykolu musí být skladovány při pokojové teplotě nebo v chladničce. Je stabilní do data exspirace vyznačeného na štítku lahvičky. 4. ŘEDÍCÍ ROZTOK PRO AMIDOČERŇ Zásobní ředicí roztok barvicího roztoku musí být použit podle pokynů v odstavci "AMIDOČERŇ". Obsahuje kyselý roztok ph 2. barvícího roztoku s amidočerní. Zásobní roztok ředícího roztoku pro amidočerň se skladuje při pokojové teplotě nebo při teplotě 2-8 C. Zásobní roztok je stabilní do data exspirace vyznačeného na obalu či na štítku lahvičky. NEMRAZIT. Nepřidávat azid sodný. 5. AMIDOČERŇ Koncentrát amidočerni je viskózní roztok, který může gelovatět. Citlivost zásobního barvícího roztoku není změněna zvýšením viskozity nebo ztuhnutím. V každém případě je pro dosažení správného rozpuštění barvícího roztoku nutné dodržet následující postup : 1. Přidejte 15 ml ředícího roztoku pro amidočerň do lahvičky s koncentrovanou amidočerní. 2. Pečlivě uzavřete lahvičku. 3. Lahvičku pořádně protřepejte po dobu cca 5 sekund. 4. Přelijte tento roztok do odměrného válce pro přípravu barvicího roztoku. 5. Opakujte tento krok 2 3x, až do úplného rozpuštění koncentrované amidočerni. 6. Nalijte zbylý obsah lahvičky s ředícím roztokem pro amidočerň do odměrného válce a doplňte do 300 ml destilovanou nebo deionizovanou vodou 7. Promíchávejte obsah válce po dobu 5-10 minut. Barvící roztok je připraven k použití. Pracovní barvicí roztok po naředění obsahuje : kyselý roztok o ph 2 ; amidočerň ; ethylenglykol ; přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. Barvení gelů s rozdělenými bílkovinami po elektroforéze. DŮLEŽITÉ : Barvicí roztok je určen k obarvení pouze 10 gelů. Roztok vyměňte po 10 použitích k barvení. Zásobní i pracovní barvicí roztok se skladuje při pokojové teplotě nebo v chladničce v těsně uzavřených nádobách tak, aby nedošlo k odpařování. Zásobní barvicí roztok je stabilní do data expirace vyznačeného na obalu sady nebo na štítku lahvičky rozpouštědla pro barvicí roztok. Pracovní barvicí roztok je stabilní 1 měsíc. Stabilita roztoku může být prodloužena na 3 měsíce, pokud je uchováván v chladničce. Ihned po použití musí být uzavřené nádoby uloženy v chladničce. Neskladujte pracovní barvicí roztok v blízkosti zdrojů tepla. 6. HEMOLYZAČNÍ ROZTOK Hemolyzační roztok je připraven k použití. Obsahuje : tlumicí roztok ph 6.1 ± 0.5 ; přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. K hemolýze erytrocytů

4 Skladovat při pokojové teplotě nebo v chladničce. Stabilní do data exspirace vyznačeného na štítcích lahviček a obalu kitu. Nepoužívat při změně vzhledu roztoku, např. při výskytu zákalu, který znamená mikrobiální kontaminaci. 7. APLIKÁTORY Na jedno použití, k aplikaci vzorků. Skladujte na suchém místě při pokojové teplotě nebo v chladničce. 8. TENKÉ FILTRAČNÍ PAPÍRY Určeny k odsátí přebytečné tekutiny z povrchu gelu před aplikací vzorků. Skladování Skladujte na suchém místě při pokojové teplotě nebo v chladničce. POTŘEBNÉ REAGENTY NEOBSAŽENÉ V BALENÍ VAROVÁNÍ : Viz bezpečnostní listy. 1. ODBARVOVACÍ ROZTOK Každá lahvička zásobního Odbarvovacího Roztoku (SEBIA, kat. č. 4540, 10 lahv. po 100 ml) je určena k přípravě 100 litrů pracovního odbarvovacího roztoku. Je výhodné připravovat jen 5 litrů pracovního roztoku doplněním 5 ml zásobního roztoku do 5-ti litrů destilovanou nebo deionizovanou vodou. Po zředění vznikne odbarvovací roztok obsahující kyselý roztok ph 2. Roztokem se odstraňuje přebytečné množství barvičky a odbarvuje se pozadí agarózové plotny. Dále k vyplachování barvícího prostoru po barvícím kroku. K neutralizaci kyselé reakce odbarvovacího roztoku nalijte do prázdné nádoby na odpady 15 ml 50 % (w/w) komerčně dostupného roztoku NaOH ( 19 M NaOH). Skladování při pokojové teplotě nebo v chladničce. Stabilita do doby exspirace vyznačené na obalu soupravy nebo na štítku lahvičky. Pracovní odbarvovací roztok je stabilní 1 týden při pokojové teplotě v uzavřené láhvi. Nepřidávejte azid sodný! Nepoužívat při změně vzhledu, vzniku zákalu nebo precipitátu v roztoku. Pro zabránění mikrobiální proliferace ve zředěném odbarvovacím roztoku, který má být skladován déle než dva týdny, přidejte 5 μl/dl roztoku ProClin 300 nebo roztoku CLEAN PROTECT (SEBIA, kat. č. 2059, 1 lahvička, 5 ml). Viz příbalový leták s návodem k použití roztoku CLEAN PROTECT. Pracovní odbarvovací roztok s přídavkem roztoku ProClin nebo CLEAN PROTECT je při pokojové teplotě nebo v chladničce v uzavřené nádobě stabilní do doby exspirace vyznačené na obalu sady nebo na štítku lahvičky. 2. PROMÝVACÍ ROZTOK PRO HYDRASYS Každá lahvička Promývací roztok pro HYDRASYS (SEBIA, kat. č. 4541, 10 lahviček a 80 ml) se ředí do 5 litrů destilovanou nebo deionizovanou vodou. Promývací pracovní roztok po zředění obsahuje : tlumicí roztok ph 8.7 ± 0.5. Slouží k čištění oddílu HYDRASYSu určeného k barvení. Při denním používání přístroje se doporučuje promývat barvící prostor jednou za týden. Viz příbalový leták. Skladujte zásobní i pracovní promývací roztok v uzavřených nádobách při pokojové teplotě nebo v chladničce. Stabilní do data exspirace uvedeného na štítcích lahviček s promývacím roztokem. Při známkách změny vzhledu pracovního promývacího roztoku, výskytu zákalu v důsledku mikrobiální kontaminace, roztok vyřaďte z používání. 3. FYZIOLOGICKÝ ROZTOK Samostatně v laboratoři 0.15 M (9 g/l) roztok NaCl v destilované vodě. K proprání erytrocytů. Skladuje se při teplotě místnosti, nebo v chladničce. Po třech měsících nebo při známkách mikrobiálního znečištění zákalu vylej. Po přidání 0.1 g/dl lze skladovat i delší dobu. POZNÁMKY : Zkoušky provedené pro ověření reagentů prokázaly, že pro různé roztoky a použití přizpůsobeného vybavení pro rekonstituci objemu, nemají odchylky objemu ± 5 % z konečného objemu vliv na výsledek analýzy. Destilovaná nebo deionizovaná voda používaná k ředění roztoků musí být prostá bakteriální proliferace a plísní (použijte filtr 0,45 µm) a musí mít vodivost nižší než 3 µs/cm, což odpovídá rezistivitě vyšší než 0,33 MΩ x cm

5 NUTNÉ VYBAVENÍ 1. HYDRASYS Systém SEBIA : HYDRASYS 2 SCAN kat. č. 1200, HYDRASYS 2 kat. č. 1201, HYDRASYS 2 SCAN FOCUSING kat. č. 1202, HYDRASYS 2 FOCUSING kat. č. 1203, HYDRASYS kat. č nebo kat. č nebo HYDRASYS FOCUSING kat. č Vlhká Zásobní Komora kat. č. 1270, dodávaná s HYDRASYS systémem. 3. Souprava kontejnerů dodávaná s HYDRASYSem. 4. Pipety 10 µl a 200 µl. 5. Densitometr / skener pro skenování gelových ploten 82 x 51 mm nebo 82 x 102 mm : Software HYRYS SEBIA, GELSCAN SEBIA, DVSE SEBIA nebo PHORESIS pro plochý skener. Pro postupy činnosti a kalibrace viz pokyny výrobce. 6. Držák gelů SEBIA, kat. č ANALYZOVANÉ VZORKY Odběr a skladování vzorků Nejlepších výsledků se dosahuje analýzou čerstvých nesrážlivých vzorků krve. Lze použít antikoagulancia jako EDTA, citrát, heparin vyhnout se jodoacetátu. Po odběru lze skladovat až 5 dní v chladničce. vzorku (standardní procedura) Před odebráním krve pro přípravu promíchejte zkumavku. Centrifugujte krev s antikoagulačním činidlem pro získání červených krvinek. Odstraňte plazmu. Erytrocyty promyjte 2 x 10 objemy fyziologického roztoku ; pokud pracujeme s objemy erytrocytů menšími než 10 µl je nutné věnovat práci velkou péči. Odstraňte přebytek fyziologického roztoku z povrchu (nad erytrocyty) a promíchejte erytrocyty na vortexu před odebráním 10 µl pro hemolyzaci. Hemolyzujte 10 µl erytrocytů se 130 µl hemolyzačního činidla. Promíchejte na vortexu po dobu 10 sekund a po dobu 5 minut nechte inkubovat při pokojové teplotě. POZN. : - hemolyzátu z krve u anemiků (100 g/l Hb) a anemiků s Hb pod 70 g/l objem erytrocytů musí být zvýšen z 15 µl resp. 20 µl. - Hemolyzát se nemusí filtrován ani centrifugován. - Hemolyzační roztok ze setu nepůsobí na nestabilní hemoglobin Bart. vzorku pro stanovení hemoglobinu H - Před odebráním krve pro přípravu promíchejte zkumavku. - Centrifugujte krev s antikoagulačním činidlem pro získání červených krvinek. - Odstraňte plazmu. - Erytrocyty promyjte 2 x 10 objemy fyziologického roztoku ; pokud pracujeme s objemy erytrocytů menšími než 10 µl je nutné věnovat práci velkou péči. - Odstraňte přebytek fyziologického roztoku z povrchu (nad erytrocyty) a promíchejte erytrocyty na vortexu před odebráním 40 µl pro hemolyzaci. - Hemolyzujte 40 µl erytrocytů se 100 µl hemolyzačního činidla. - Promíchejte na vortexu po dobu 10 sekund a po dobu 5 minut nechte inkubovat při pokojové teplotě. - Centrifugujte hemolyzát 5 minut při 6700 g. - Analýza se provádí na supernatantu hemolyzátu, dále pokračujte migračním prog. "7 / 15 Hb". POZNÁMKA : Odběrové zkumavky a centrifugační parametry pro biologické vzorky jsou popsány v dostupné dokumentaci k předanalytické fázi pro biomedicínskou analýzu (údaje poskytnuté výrobci for zkumavek, návody a doporučení k odběru biologických vzorků ). Nejsou-li v návodu k použití pro typ zkumavek, které mají být použity, nebo k centrifugaci uvedeny žádné pokyny, postupujte podle této dokumentace a v případě rozměrů zkumavek, které mají být použity, postupujte podle dokumentu SEBIA "Charakteristiky zkumavek používaných podle přístroje". Předanalytická fáze musí být provedena podle stavu poznání, různých doporučení, mimo jiné doporučení výrobců zkumavek a platných předpisů. PRACOVNÍ POSTUP HYDRASYS je multiparametrický, poloautomatizovaný systém. Automatizované kroky zahrnují postupně nanesení vzorků, elektroforetickou migraci, sušení,barvení, odbarvování a konečné osušení gelové plotny. Manipulace se vzorky, gely, vkládání reagencií a nastavení přístroje k uvedení do chodu se provádí ručně. Teplota migračního modulu je řízena na principu peltierova efektu. DODRŽUJTE PEČLIVĚ POKYNY UVEDENé V MANUÁLU HYDRASYS / HYDRASYS 2 SYSTéMU. I. NASTAVENÍ MIGRACE 1. Zapněte HYDRASYS. 2. Umístěte jeden aplikátor na rovnou plochu čísly jamek nahoru (viz Obr. 1). - naneste 10 µl připraveného vzorku do každé jamky. Každý aplikátor musí být naaplikován nejdéle ve dvou minutách, - vložte aplikátory do vlhké komůrky zoubky nahoru (při vkládání je uchopte za ochranný plastový rámeček), - nechejte vzorky difundovat do zoubků po dobu 5 minut po nanesení posledního vzorku. Komůrka se může vložit až na 8 hodin do chladničky a analýza může být tak po tuto dobu odložena. Detaily viz v příbalovém letáku vlhké skladovací komůrky. 3. Otevřete víko migračního modulu a zvedněte migrační rámeček s elektrodami a nosičem aplikátorů nahoru, POzOR : Nikdy nezavírejte víko pokud je migrační rámeček nahoře! 4. Zvolte program migrace "7/15 Hb". POZN. : Pro lepší oddělení Hb F a Hb S se doporučuje zvolit program migrace "7/15 Hb F-S". Program je určen pro kvalitativní analýzu. 5. Vyjměte z ochranného obalu pufrované stripy uchopením za plastikové konce. Děrovanými konci plastikového vyztužení je upevněte na kovové výstupky migračního rámečku nad elektrody. Plastikové vyztužení stripů musí směřovat k nosiči (viz Obr. 2)

6 6. Vybalte desku s agarosovým gelem HYDRAGEL. - Položte plastovou stranu dolů na látku nebo filtrační papír, abyste odstranili kapky vody. - Odsajte přebytečnou kapalinu tak, že na povrch gelu rychle a rovnoměrně narolujete filtrační papír. Papír ihned odstraňte. VAROVÁNÍ : Neponechávejte filtrační papír delší dobu na povrchu, mohlo by dojít k dehydrataci gelu. - Naneste 150 µl ethylenglykolu (EG) pro HYDRAGEL 7 HEMOGLOBIN(E) nebo 300 µl pro HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E) do spodní třetiny migrační plochy vytištěné na teplotní kontrolní destičce migračního modulu. DŮLEŽITÉ : Před nanesením roztoku ethylenglykolu musí být teplotní kontrolní destička perfektně čistá a suchá. - Opřete gelovou desku (gelem nahoru) dolním okrajem o zarážku na spodní části vyznačeného rámečku na migrační ploše (Obr. 3). - Ohněte gel a položte jej pomalu dolů na pás EG (Obr. 3). Ověřte, zda nedošlo k zachycení vzduchových bublin, že je EG rozprostřen po celém povrchu gelové desky a že je gel vyrovnán s vyznačeným rámečkem. 7. Snižte migrační rámeček dolů. V této pozici se pufrované stripy nedotýkají gelu. NA MIGRAČNÍ RÁMEČEK NETLAČTE DOLŮ SILOU! 8. Aplikátory nyní vyjměte z vlhké skladovací komůrky. Manipulujte s nimi za pomoci ochranného rámečku. - odlomte ochranný rámeček chránící zuby aplikátoru, - migrační program "7/15 Hb" : aplikátor umístěte na nosič do pozice č. 4, - migrační program "7/15 Hb F-S" : aplikátor umístěte na nosič do pozice č. 3. DŮLEŽITÉ : Čísla vyznačená na aplikátoru musí směřovat k operátorovi (viz Obr. 4). 9. Uzavřete víko migračního modulu. 10. Stisknutím tlačítka "START" označeného zelenou šipkou (levá strana klávesnice) je procedura ihned zahájena. DŮLEŽITÉ : Přesvědčte se, zda není blokován otvor vzduchové ventilace na pravé straně přístroje. MIGRACE POPIS AUTOMATICKÝCH ČINNOSTÍ Všechny části migračního rámečku jsou sníženy stripy s pufrem i aplikátory jsou v kontaktu s povrchem gelu probíhá aplikace vzorků do gelu. Nosič aplikátorů vzorků se zvedne, části s elektrodami nesoucí stripy s pufrem zůstávají v kontaktu s povrchem gelu. Proběhne migrace při konstantních 340 V při 25 C, řízených Peltierovým efektem až do akumulovaných 65 Vh (po dobu asi 12 minut pro migrační program "7 / 15 Hb") nebo do akumulovaných 85 Vh (po dobu asi 15 minut pro migrační program "7 / 15 Hb F-S"). Po zvednutí nosiče elektrod se elektrody odpojí. Teplota migrační plochy stoupá až na 50 C na dobu 15 minut, po kterou se gel suší. migrační plocha je dále temperovaná na 50 C a slyšitelné pípnutí signalizuje odjištění víka migračního modulu. Teplota se udržuje na 50 C až do otevření víka. Potom teplota klesá na 25 C (v necelých 5-ti minutách). Po této době může začít nové dělení. POZN. : Víko migračního modulu zůstává uzavřeno během všech migračních kroků II. PŘÍPRAVA ZPRACOVÁNÍ GELU 1. Otevřete víko. 2. Vyjměte aplikátory a odstraňte je. 3. Zvedněte oba nosiče, vyjměte pufrované stripy uchopením za plastikové konce a odstraňte je. 4. Vyjměte usušený gel pro další zpracování. 5. Elektrody a teplotní kontrolní destičku otřete velmi pečlivě jemným hadříkem navlhčeným ve vodě. Ujistěte se, že elektroda a destička jsou před dalším použitím dobře usušeny. DŮLEŽITÉ : Po každém použití musí být elektroda systematicky očištěna. 6. Vyjměte držák gelu z barvící komory, otevřete jej, umístěte usušenou gelovou plotnu (gelovou stranou dopředu) do žlábků obou jeho tyček a držák uzavřete. Ujistěte se, že plotna je umístěna správně uvnitř držáku (viz Obr. 5). 7. Vložte držák gelu do modulu na zpracování a barvení gelu. DŮLEŽITÉ : Před nastartováním programu pro zpracování a barvení zkontrolujte : - zda kontejner pro barvení obsahuje 300 ml barvícího roztoku, - zda kontejner pro odbarvování obsahuje nejméně 1 litr odbarvovacího roztoku, - zda kontejner na odpad není plný. Pro připojení přívodů reagencií se řiďte pokyny zobrazovanými na obrazovce přístroje (zvolte klávesu : REAGENT LINES). DŮLEŽITÉ : Nezapomeňte zablokovat nepoužité přívody. 8. Vyberte z menu přístroje program pro barvení "PROTEIN(E)/ß1-ß2/Hb" nebo "Hb" a stiskněte "START" (zelená šipka na pravé straně klávesnice). Během barvení, odbarvování a sušení zůstává tento modul zajištěn. Odjištění je signalizováno slyšitelným pípnutím ventilace je udržovaná až do vynětí držáku s gelem. III. DOKONČENÍ ZPRACOVÁNÍ GELU 1. Vyjměte držák s gelem, otevřete ho a vyjměte usušený gel. POZNÁMKA : Po obarvení / odbarvení a před densitometrií / skenováním může být gel navíc jednou propláchnut, pokud je to zapotřebí pro další vyjasnění pozadí gelu a odstranění zbytkového barviva, které by se mohlo projevit jako modré skvrny. Omyjte gel pomocí programu "WASH ISOENZ/GEL". 2. Je-li třeba, očistěte zadní plastikovou podpůrnou část gelové plotny vlhkým měkkým hadříkem nebo buničinou. 3. Nasnímejte denzitometrem / skenerem výběrem vhodného programu snímání. Při použití denzitometrů HYRYS nebo DVSE, přiložte frakci A 2 na 5 mm značku skenovací plochy nulové pozadí se vytvoří mezi A 2 a frakcemi karbonát-anhydrázy v nejnižším bodě. POZNÁMKA : Pro zajištění nejpřesnějších a nejkonzistnějších výsledků, proveďte následující : - Upravte délku snímání, aby zahrnula celý elektroforetický záznam ( 30 mm). - Pokud je zapotřebí, umístěte minima na obě strany frakce A 2 (pokud nikoli, nechte minima tam, kde jsou automaticky umístěna). Je nutné výsledek odečítat bez jakéholiv prodlení. Pro porovnání v budoucnosti max. 3 měsíce, lze skladovat v ochranném obalu na suchém, tmavém místě, v bezpečné vzdálenosti od zdrojů tepla

7 KONTROLA KVALITY Doporučuje se zahrnout do každé série analýz zkoušku kontrolní krve (například Normal Hb A2 Control, SEBIA, kat. č nebo Pathological Hb A2 Control, SEBIA, kat. č. 4779) nebo vyšetření kontrolního vzorku krve s obsahem hemoglobinů A, F, S a C (například Hb AFSC Control, SEBIA, kat. č. 4792). VÝSLEDKY Hodnoty Denzitometrické skenování nabarvených polí elektroforegramů (procentuálních hodnot) jednotlivých hemoglobinových zón. Referenční hodnoty (průměr ± 2 SD) 200 zdravých mužů a žen metodou HYDRAGEL 7 / 15 HEMOGLOBIN(E) : Hemoglobin A 96.5 % Hemoglobin F < 2.0 % (*) Hemoglobin A % (*) viz čl. Interference a Omezení. Doporučuje se, aby každá laboratoř stanovila své vlastní referenční hodnoty. Interpretace 1. Kvalitativní abnormality hemoglobinopatie Většina hemoglobinopatií vzniká následkem jiného uspořádání genomu (Hb genu) Změněný gen tvoří hemoglobiny, u kterých může docházet ve srovnání s Hb A k jinému pořadí nebo záměně aminokyselin v globinu. Klinický význam takových změn závisí na typu a pořadí aminokyselin. U klinicky významných onemocnění jsou postiženy řetězce alfa, beta (gama). Dnes je známo více než 200 variant hemoglobinů u dospělých jedinců. Existují čtyři hlavní abnormální hemoglobiny, zasluhující zvláštního klinického zájmu S, C, E a D. HYDRAGEL 7 / 15 HEMOGLOBIN(E) kity jsou určeny k předběžné identifikaci hemoglobinopatií a talasemií. K potvrzení abnormálních nálezů je nutno použít další testy (např. elektroforézu na kyselých agarózových gelech). Hemoglobin S Nejčastěji detekovaný hemoglobin. Vzniká záměnou kys. glutamové (kyselé AK) za valin (neutrální AK) v beta řetězci. Elektroforetická pohyblivost je snížena. Na alkalicky pufrovaném gelu Hb S migruje mezi frakcemi A a A 2. Hemoglobin C Glutamová kyselina beta řetězce je nahrazena lyzinem (bazická AK). Jeho pohyblivost je silně omezena. Na alkalicky pufrovaném gelu této metody je Hb C navrstven s Hb E a Hb A 2 ve společné zóně. Pokud tato frakce přesahuje 15 % je velmi pravdě- podobná přítomnost Hb C a Hb E. Hemoglobin E Glutamová kyselina v beta řetězci je nahrazena lyzinem. Pohyblivost Hb E je stejná jako Hb C na gelech soupravy HYDRAGEL 7/ 15 HEMOGLOBIN(E). Na rozdíl od Hb C se však při dělení na kyselém gelu [HYDRAGEL 7 / 15 ACID(E) HEMOGLOBIN(E)] souprava neodděluje od Hb A. Tato jeho vlastnost dovoluje odlišení Hb E od Hb C. Hemoglobin D Glutamová kyselina beta řetězce je nahrazena glutaminem. Na gelech soupravy HYDRAGEL 7 / 15 HEMOGLOBIN(E) se Hb D pohybuje stejně jako hemoglobin S. Na kyselém gelu [HYDRAGEL 7 / 15 ACID(E) HEMOGLOBIN(E)] souprava se však Hb D neoddělí od Hb A ; tato vlastnost dovoluje odlišení Hb S od Hb D. 2. Kvantitativní abnormality : Talasemie Talasemie představují nesourodou skupinu genetických poruch charakterizovanou sníženou syntézou jednoho nebo několika typů polypeptidových řetězců. Molekulární mechanizmus tohoto snížení nebyl do dneška plně popsán. Existují dva typy talasemiových syndromů : Alfa-talasemie Jsou charakterizovány snížením syntézy alfa řetězců, čímž je následně postižena tvorba všech normálních hemoglobinů. Nadměrná syntéza beta a gama řetězců v poměru k řetězcům alfa vede ke tvorbě tetramerů : hemoglobin Bart = g 4, hemoglobin H = ß 4. Beta-talasemie Jsou charakterizovány poklesem syntézy beta řetězců. Procenta hemoglobinu F a hemoglobinu A 2 jsou zvýšena s ohledem na hemoglobin A. 3. Migrační typy Normální migrace hemoglobinů A (A 0 + A 1 ) A (A 0 + A 1 ) F S - D A 2 A 2 - C - E karboanhydráza karboanhydráza aplikační bod Migrace hlavních abnormálních hemoglobinů A 0 : Neglykovaná frakce normálního hemoglobinu A dospělých. A 1 : Glykovaná frakce normálního hemoglobinu A dospělých. POZN. : U typů dělení viz výše je katoda dole a anoda nahoře

8 Interference a Omezení Nepoužívejte hemolyzované vzorky. Pokud je detekován abnormální hemoglobin, jenž se chová odlišně od hlavních variant hemoglobinu je nuitno použít další prostředky určené k identifikaci (izoelektrická fokusace, elektroforéza globinových řetězců) nebo odeslat vzorky krve do specializované laboratoře. Denzitometrické stanovení HbF nebo podobného hemoglobinu, jenž tvoří jen malé procentuální zastoupení lze považovat jen za semikvantitativní, protože hodnoty pod 2-3 % celkového hemoglobinu jsou nepřesné. Některé homozygoty "S" přijímají při léčení přípravkem "Hydrea " (hydroxyurea), který může indukovat syntézu fetálního hemoglobinu. Mobilita indukovaného Hb F na HYDRAGEL 7 / 15 HEMOGLOBIN(E) gelech byla v některých případech odlišná od fyziologického Hb F. U vzorků skladovaných déle než 7 dní se může stín umístěný za Hb A frakcí zobrazit jako frakce. Pozor, aby nebyla tato frakce interpretována jako hemoglobinový variant, např. H nebo Bart. Problémy Pokud testy nevycházejí při dodržení veškerých instrukcí pro přípravu, skladování a provedení testu uvedených v příbalovém letáku, volejte Technicko- Servisní středisko vašeho dodavatele. Bezpečnostní datové listy soupravy činidel a informace o čištění a likvidaci odpadů, označování a bezpečnostní pravidla používaná společností SEBIA, obaly pro přepravu biologických vzorků a informace o čistění přístroje jsou k dispozici na webových stránkách SEBIA : HODNOTY Všechchny výsledky jsou založeny na studiích za použití HYDRAGELů a zařízení fy SEBIA a srovnatelných, komerčně dostupných agarózových gelových systémů. Denzitometr HYRYS fy SEBIA byl použit pro denzitometrická hodnocení. Všechny elektroforeogramy byly interpretovány taktéž vizuálně. V tabulkách níže jsou uvedeny příklady výsledků reprezentativních vzorků z hlediska jednotlivých hodnot, průměrů, SD a CV. Výsledky testů indikují velice dobrou reprodukovatelnost pro všechny testované aspekty : průměrné CV = 2.4 % za použití "7 / 15 Hb" migračního programu. Tyto hodnoty byly podobné taktéž pro "7 / 15 Hb F-S" migrační program. Reprodukovatelnost Na Gelu Každý ze tří krevních vzorků byl podroben analýze na HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E) gelech stejné šarže. Každý vzorek byl testován na všech 15-ti drahách gelu. Tabulka ukazuje průměry, SD a CV pro každý jednotlivý hemoglobin všech tří vzorků, který byl vypočítán z denzitometricky stanovených procentuálních hodnot pro každou dráhu. Navíc žádné z opakování neukázalo falešně pozitivní nebo falešně negativní hodnoty. FRAKCE PRŮMĚR % SD CV % Normální krev Hb A Hb A zvýšené Hb A 2 Hb A Hb A zvýšené Hb C Hb A Hb C Reprodukovatelnost Mezi Gely Patnáct (15) krevních vzorků bylo podrobeno testům na gelech HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E) stejné šarže. Analyzované vzorky zahrnovaly 9 vzorků s abnormálním hemoglobinem ( Hb S, Hb F nebo Hb C) a 5 vzorků se zvýšeným Hb A 2, Průměr, SD a CV byly kalkulovány pro každý vzorek a každou frakci. Rozsah průměrů, SD a CV a průměr CV reprezentující směs jednotlivých komponent je uveden v tabulkách níže. Navíc žádné z opakování neukázalo falešně pozitivní nebo falešně negativní hodnoty. FRAKCE PRŮMĚR % SD CV % PRŮMĚR CV % Hb A Hb F Hb C/E Hb S/D Hb A Přesnost Stanovení Hemoglobinových Abnormalit Šedesát tři (63) různých krevních vzorků bylo analyzováno pomocí HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E) soupravy a jiného, komerčně dostupného agarózového gelového systému. Krevní vzorky a příslušné dg. byly poskytnuty nemocnicemi. Elektroforetické analýzy byly provedeny na rutinním alkalickém a kyselém gelech a / nebo pomocí HPLC. Všechny abnormální hemoglobiny nebo abnormální hodnoty normálních hemoglobinů detekované metodou HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E) byly srovnatelné s porovnávacím gelovým systémem, nemocničními výsledky a klinickou dg.. Nebyly pozorovány případy falešně pozitivní jako např. detekce abnormální frakce nebo abnormální hodnoty normální frakce. Přesnost Kvantitativní Stanovení Hb A 2 Byly změřeny hladiny Hb A 2 dvakrát u 51 krevních vzorcích s normálními a zvýšenými hladinami Hb A 2 pomocí densitometrie po elektroforetické separaci získanými na gelech HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E) a jiném komerčně dostupném systému agarozového gelu. Hodnoty naměřené oběmi procedurami byly analyzované statistickou procedurou lineární regrese. Následující tabulka ukazuje výsledky lineární regresne (y = HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E))

9 Korelační Koef. y - úsek Sklon Rozsah % Hodnot (na SEBIA systému) Linearita Krevní vzorky byly smíchány v různých poměrech a jednotlivá ředění byla elektroforeticky analyzována na HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E) gelu. Test byl proveden lineárně s ohledem na požadovaný rozsah studie

10 BIBLIOGRAPHIE / BIBLIOGRAPHY (1) V.F. Fairbanks, ed. (1980) Hemoglobinopathies and thalassemia: Laboratory methods and case studies. Brian C. Decker, New York. (2) F. Galacteros (1986) Thalassémie, drépanocytose et autres hémoglobinopathies. Techniques et Biologie, 3, (3) T.H.J. Huisman and J.H.P. Jonxis (1977) The hemoglobinopathies: techniques of identification. Marcel Dekker, New York. (4) J.S. Krauss, P.A. Drew, M.H. Jonah, M. Trinh, S. Shell, L. Black and C.R. Baisden (1986) Densitometry and microchromatography compared for determination of the hemoglobin C and A 2 proportions in hemoglobin C and hemoglobin SC disease and in hemoglobin C trait. Clin. Chem. 32, 5, (5) C. Livingstone (1986) The hemoglobinopathies. Edit. London. (6) M. Maier-Redelsberger, R. Girot (1989) Diagnostic biologique des maladies de l hémoglobine. Feuillets de biologie 170. (7) R.G. Schneider (1978) Methods for detection of hemoglobin variants and hemoglobinopathies in the routine clinical laboratory. CRC Crit. Rev. Clin. Lab. Sci. 9, (8) L. Vovan, D. Lara-Russo, A. Orsini (1985) Diagnostic biologique des hémoglobinoses. Ann. Pédiat. 32, 9, (9) Wendling A. Procédures de diagnostic ou de dépistage : Justification et validité d un test de diagnostic ou de dépistage-sensibilité-spécificité. Impact-Internat, 1986 ; Sept :

11 SCHÉMAS / FIGURES Figure 1 Figure Figure 3 Figure Figure 5 HYDRASYS HYDRAGEL PROTEIN(E) 15/ HYDRAGEL PROTEIN(E) 15/ HYDRAGEL 7 PROTEIN(E) HYDRAGEL 7 PROTEIN(E)

12 SCHÉMAS / FIGURES HYDRASYS 2 HYDRAGEL PROTEIN(E) 15/ HYDRAGEL PROTEIN(E) 15/ HYDRAGEL 7 PROTEIN(E) HYDRAGEL 7 PROTEIN(E)

13 Benelux SCS / Comm. V Jan Olieslagerslaan Vilvoorde Belgique / België Tél. : 32 (0) Fax : 32 (0) benelux@.be Brasil Edifício Baker Office Tower Rua Barão do Triunfo, 73, conjunto 51 CEP Bairro Brooklin Paulista, São Paulo - SP Brasil Tel. : Fax : GmbH Münsterfeldallee, Fulda Deutschland Tel. : 49 (0) Fax : 49 (0) Hispania S.A. C/Sicilia, n Barcelona España Tel. : Fax : Inc Corporate Drive Norcross, GA U.S.A. Tel. : Fax : info@-usa.com Italia S.r.l. Via Antonio Meucci, 15/a Bagno a Ripoli (FI) Italia Tel. : Fax : info@.it UK Ltd River Court, Meadows Business Park Station Approach, Blackwater Camberley, Surrey, GU17 9AB United Kingdom Tel. : 44 (0) Fax : 44 (0) info@.co.uk Parc Technologique Léonard de Vinci CP 8010 Lisses EVRY Cedex - France Tél. : 33 (0) Shanghai Representative Office Cross Tower, Room Fuzhou Road Shanghai China Tel. : (21) Fax : (21)