MINICAP IMMUNOTYPING. Ref /07

Transkript

1 MINICAP IMMUNOTYPING Ref /07

2 ZAMÝŠLENÝ ÚČEL Sada MINICAP IMMUNOTYPING je navržena k detekci a charakterizaci monoklonálních bílkovin (imunotypizace) v lidském séru systémem MINICAP, SEBIA, pro kapilární elektroforézu. SEBIA, používaná spolu se sadou MINICAP PROTEIN(E) 6, je určena k rozdělení bílkovin lidského séra na 6 hlavních frakcí v alkalickém tlumivém roztoku (ph 9,9). MINICAP provádí automaticky všechny operační postupy a výsledkem je profil bílkovin pro kvalitativní analýzu. Každý vzorek séra se smíchá se specifickými antiséry proti těžkým řetězcům gama (Ig G), alfa (Ig A), mí (Ig M) a případně lehkým kappa a lambda řetězcům (volným i vázaným). Bílkoviny,dělené v křemenných kapilárách, jsou přímo detekovány absorbancí při 200 nm. Detekce přítomnosti specifických reakcí s monoklonálními bílkovinami se hodnotí vizuálně na elektroforeogramu. Pro diagnostické použití in vitro. POZNÁMKA : V tomto návodu se název "MINICAP" používá pro poloautomatické přístroje MINICAP a MINICAP FLEX-PIERCING. PRINCIP TESTU Elektroforéza bílkovin je zavedená technika běžně používaná v klinických laboratořích pro vyšetření vzorků séra pro zjištění proteinových abnormalit (1, 3, 5, 6, 7, 10). Systém MINICAP pro kapilární elektroforézu, SEBIA, byl vyvinut ke kompletní automatizaci tohoto testování s rychlým dělením a dobrým rozlišením. Tuto techniku lze z mnoha hledisek zařadit jako spojovací článek mezi klasickou zónovou elektroforézou a kapalinovou chromatografií (1, 4, 5). Systém MINICAP používá princip kapilární elektroforézy ve volném roztoku. Elektricky nabité molekuly jsou děleny podle elektroforetické pohyblivosti v alkalickém tlumivém roztoku o určitém ph. Dělení je rovněž závislé na ph elektrolytu a elektroosmotickém toku (2, 9, 10). Abnormální frakce v elektroforeogramech sérových bílkovin, primárně v zónách beta a gamaglobulinů, vždy vyvolávají podezření na výskyt monoklonálních proteinů (M-bílkovin, paraproteinů, monoklonální imunoglobulinů) a tedy ukazatelů monoklonální gamapatie. Imunotypizace se provádí metodou MINICAP IMMUNOTYPING, se specifickými protilátkami pro identifikaci těchto abnormálních frakcí. Systém MINICAP má 2 kapiláry v paralelním zapojení. V tomto systému se ředění vzorku připravuje a nastřikuje simultánně aspirací na anodovém konci 2 kapilár, 3 krát postupně za sebou. Referenční záznam (záznam ELP) pro imunotypizaci se získá nastříknutím vzorku smíšeného s roztokem ELP do kapiláry, která poskytuje kompletní záznam elektroforézy bílkovin ve vzorku. Záznamy antisér se získají z 5 následujících analýz nastříknutím dříve naředěných vzorků smíchaných se specifickými antiséry proti těžkým řetězcům gama (Ig G), alfa (Ig A) a mí (Ig M) do kapilár a proti volným i vázaným lehkým kappa a lambda řetězcům. Potom následuje vysokonapěťové dělení bílkovin a jejich přímá detekce při 200 nm na katodovém konci kapiláry. Kapiláry jsou ihned promývány promývacím roztokem a promytím tlumivém roztokem připraveny k další analýze. Překryv záznamů antiséra se záznamy ELP bere v úvahu vizualizaci úbytku a nebo zmenšení monoklonální frakce na záznamu antiséra a pro indikaci gamapatie. POZNÁMKA : při metodě MINICAP IMMUNOTYPING se bílkoviny detekují v následujícím pořadí od katody k anodě : gama globuliny, beta-2 globuliny, beta-1 globuliny, alfa-2 globuliny, alfa-1 globuliny a albumin s tím, že každá zóna obsahuje jeden či více proteinů. Komplex antigen-protilátka (mezi imunoglobuliny vzorku séra a specifického antiséra) má velmi anodickou mobilitu (mezi zónou alfa-1 a albuminem nebo anodičtější než albumin). Imunotypizace se provádí ve čtyřech automatizovaných krocích : 1. ředění vzorku séra specifickými ředidly v reagenční nádobce. Toto ředění se provádí podle koncentrace imunoglobulinů ve vzorku. 2. míchání ředěného vzorku séra s individuálním specifickým antisérem (2 antiséra na reagenční nádobku). V kapalném médiu se tvoří rychle komplex antigen-protilátka, aniž by byl zapotřebí inkubační krok nebo odstranění imunitních komplexů, 3. tři následující nástřiky připravovaných vzorků simultánní aspirací do 2 kapilár na anodovém konci a dělení bílkovin elektroforézou při vysokém napětí. Rozdělené bílkoviny se detekují na katodovém konci kapiláry při 200 nm, 4. překryv záznamů ELP se záznamy antiséra (Ig G, Ig A, Ig M, kappa a lambda) umožňuje charakterizovat podezřelé monoklonální složky. ČINIDLA A MATERIÁLY DODÁVANÉ V SADĚ MINICAP IMMUNOTYPING VAROVÁNÍ : Viz bezpečnostní listy. POLOŽkY kat. Č Ředicí roztok vzorku (připravený k použití) 6 lahviček, 4,0 ml každá Stojan s roztokem ELP a zkumavky antisér Roztok ELP (připravený k použití) 1 lahvička, 1,2 ml Savčí imunoglobuliny jako lidské antisérum s těžkými řetězci gama (připraveno k použití) 1 lahvička, 1,2 ml Savčí imunoglobuliny jako lidské antisérum s těžkými řetězci alfa (připraveno k použití) 1 lahvička, 1,2 ml Savčí imunoglobuliny jako lidské antisérum s těžkými řetězci mí (připraveno k použití) 1 lahvička, 1,2 ml Savčí imunoglobuliny jako lidské antisérum s lehkými řetězci kappa (volnými i vázanými) (připraveno k použití) 1 lahvička, 1,2 ml Savčí imunoglobuliny jako lidské antisérum s lehkými řetězci lambda (volnými i vázanými) (připraveno k použití) 1 lahvička, 1,2 ml Během přepravy může být souprava uchována bez zmražení (15 až 30 C) až po dobu 15 dní bez nepříznivého vlivu na vlastnosti. OPTIMÁLNÍ ŘÍZENÍ VYSLEDOVATELNOSTI : Všechna činidla ze stejné sady se musejí používat společně. DOSAŽENÍ OČEKÁVANÝCH VÝKONŮ : Musí se dodržovat pokyny z příbalového letáku. VAROVÁNÍ : Nepoužívejte standardně prodávanou deionizovanou vodu, jako např. na žehlení (nebezpečí poškození důležitých kapilár). Používejte výhradně ultračistou vodu, jako je např. voda pro čistoty pro nástřik SEBIA NÁVOD - Czech

3 1. ŘEDICÍ ROZTOk VZORkU Příprava MINICAP IMMUNOTYPING /07 Ředicí roztok vzorku je připraven k použití. Obsahuje : tlumicí roztok s ph 9.4 ± 0.5 ; přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. Použití Specifický ředicí roztok pro automatické ředění vzorků pro analýzu proteinů kapilární elektroforézou s automatizovaným systémem MINICAP. To umožňuje optimální překryv záznamů z elektroforézy. K umístění přímo na otočný autosampler MINICAP po odstranění víčka nádobky. Čárový kód musí být viditelný v otvorech otočného autosampleru. Skladování, stabilita a známky znehodnocení roztoku Ředicí roztok skladujte při pokojové teplotě (15 až 30 C) nebo v chladničce (2 až 8 C). Je stabilní do data expirace vyznačeného na obalu sady nebo na štítku lahvičky ředicího roztoku vzorku. Ředicí roztok vzorku nesmí obsahovat sraženiny. NEMRAZIT. 2. STOJAN S ROZTOkEM ELP A ZkUMAVkY ANTISÉR Stojan s roztokem ELP a zkumavky s antisérem anti-ig G, antisérem anti-ig A a anti-ig M a anti-kappa a anti-lambda jsou připravené pro použití. Vložte přímo do otočného autosampleru MINICAP. Čárové kódy musejí být viditelné v otvorech otočného autosampleru. DŮLEŽITÉ : Umístěte otočný autosampler MINICAP těsně před zahájením analýzy a ihned po ukončení analýzy uložte do chladničky (2-8 C). 2.1.ROZTOk ELP Příprava Roztok ELP je připraven k použití. Obsahuje : tlumicí roztok s ph 7.4 ± 0.5 ; přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. Pro snadnou identifikaci roztoku ELP a jako pomůcka pro sledování jeho použití je roztok ELP obarven (žlutým) neškodným barvivem tak, aby se jeho barva shodovala se štítkem lahvičky. Použití Pro referenční záznamy z elektroforézy bílkovin ve vzorku (záznamy ELP). Skladování, stabilita a označení znehodnocení roztoku Roztok ELP skladujte v chladničce (2 až 8 C) na stojanu. Před prvním použitím je stabilní do data expirace vyznačeného na obalu sady nebo na štítku lahvičky roztoku ELP. Lahvička s roztokem ELP umístěná ve stojanu a v otočném autosampleru je stabilní maximálně 60 hodin (akumulovaný čas) při pokojové teplotě (15 až 30 C). Po každém použití musí být roztok ELP nutně ihned uložen do chladničky (2 až 8 C), pak je stabilní do data expirace vyznačeného na štítku lahvičky s roztokem ELP. DŮLEŽITÉ : Akumulovaný čas pro roztok ELP skladovaný při pokojové teplotě nesmí překročit 60 hodin. Roztok ELP nesmí obsahovat sraženiny. NEMRAZIT. 2.2.ANTISÉRA Příprava Antiséra jsou připravena k použití. Jednotlivé lahvičky obsahují : savčí imunoglobuliny jako lidské antisérum s těžkými řetězci gama (růžová), lidské antisérum s těžkými řetězci alfa (tmavě modrá), lidské antisérum s těžkými řetězci mí (žlutozelená), lidské antisérum s lehkými řetězci kappa (volnými i vázanými) (světle zelená), lidské antisérum s lehkými řetězci lambda (volnými i vázanými) (světle modrá) a přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v neškodných koncentracích. Pro snadnou identifikaci antiséra a jako pomůcka pro jejich sledování jsou antiséra zbarvena různými neškodnými barvami, které odpovídají barvě štítku lahvičky. Použití Pro imunotypizaci bílkovin v systému MINICAP. DŮLEŽITÉ : Antiséra jsou specifická pro metodu MINICAP IMMUNOTYPING. Nesmějí se žádným způsobem používat pro imunofixační postupy na agarózových gelech a naopak. Skladování, stabilita a označení znehodnocení roztoku Antiséra skladujte v chladničce (2 až 8 C) na stojanu. Před prvním použitím jsou stabilní do data expirace vyznačeného na obalu sady nebo na štítcích lahviček antisér. Lahvičky s antiséry umístěné ve stojanu a v otočném autosampleru jsou stabilní maximálně 60 hodin (akumulovaný čas) při pokojové teplotě (15 až 30 C). Po každém použití musí být antisérum nutně ihned uloženo do chladničky (2 až 8 C), pak je stabilní do data expirace vyznačeného na štítku lahvičky antiséra. DŮLEŽITÉ : Akumulovaný čas pro antisérum skladované při pokojové teplotě nesmí překročit 60 hodin. Antiséra nesmějí obsahovat sraženiny. NEMRAZIT. POZNÁMKA : během přepravy mohou být roztok ELP a antiséra uchovány bez zmražení (15 až 30 C) až po dobu 15 dní bez nepříznivého vlivu na vlastnosti

4 ANALÝZA VZORkŮ SÉRA : POSTUP MINICAP IMMUNOTYPING POTŘEBNÁ ČINIDLA (ale neobsažené v sadě MINICAP IMMUNOTYPING) VAROVÁNÍ : Viz bezpečnostní listy. 1. SADA MINICAP PROTEIN(E) 6 (SEBIA, kat. č. 2203) Příprava, použití, skladování, stabilita a známky znehodnocení Viz návod obsažený v sadě. 2. DESTILOVANÁ NEBO DEIONIZOVANÁ VODA Použití K vyplachování kapilár v systému MINICAP, SEBIA, pro elektroforézu. Je doporučeno používat filtrovanou, destilovanou nebo deionizovanou vodu (na filtr o porozitě 0,45 μm) a s vodivostí nižší než 3 µs/cm, což odpovídá rezistivitě vyšší než 0,33 MΩ x cm. Vodu je nutno denně měnit, aby nedošlo k mikrobiální kontaminaci. Pro optimální funkci přidejte roztok CLEAN PROTECT (SEBIA, KAT. Č. 2059, 1 lahvička o objemu 5 ml) do destilované nebo deionizované vody nebo použijte přímo roztok CAPIprotect* připravený k použití (SEBIA, KAT. Č : 2 nádoby o objemu 5 L destilované vody s CLEAN PROTECT). DŮLEŽITÉ : Vyplachovací kontejner je před naplněním nutno vymýt větším množstvím destilované nebo deionizované vody. * POZNÁMKA : Řešení CAPIprotect lze také použít k rozředění zásobního promývacího roztoku. Pak v takovém případě může zředěný promývací roztok vykazovat přechodnou, více či méně žlutou barvu bez jakýchkoliv negativních účinků na jeho výkon. 3. CAPICLEAN (PRO MINICAP) NEBO MINICAP FLEX-PIERCING CAPICLEAN (PRO MINICAP FLEX-PIERCING) Složení Lahvička koncentrovaného roztoku CAPICLEAN (CAPICLEAN, SEBIA, kat. č. 2058, 1 lavička po 25 ml nebo MINICAP FLEX-PIERCING CAPICLEAN, SEBIA, kat. č. 2251, 1 lahvička, 25 ml) obsahuje proteolytické enzymy, povrchově aktivní činidla a aditiva, která nejsou nebezpečná v používaných koncentracích, nezbytných pro optimální výkon. Použití K čištění vzorkovací sondy v automatickém přístroji MINICAP nebo MINICAP FLEX-PIERCING, SEBIA pro kapilární elektroforézu během čištění CAPICLEAN. DŮLEŽITÉ : Čisticí sekvenci CAPICLEAN spusťte alespoň jednou týdně a nejvýše jednou denně nebo po každých 500 analýzách, pokud jsou provedeny za méně než jeden týden. Viz listy s pokyny pro CAPICLEAN nebo MINICAP FLEX-PIERCING CAPICLEAN, SEBIA. DŮLEŽITÉ : Pro správné použití roztoku CAPICLEAN v přístrojích MINICAP a MINICAP FLEX-PIERCING je nutné použít jeden čárový kód určený k označení zkumavky, která obsahuje naředěný roztok CAPICLEAN. Skladování, stabilita a známky znehodnocení roztoku Roztok CAPICLEAN skladujte v chladničce (2-8 C). Stabilní do data expirace vyznačeného na štítku lahvičky. NEMRAZIT. V lahvičce roztoku CAPICLEAN může být vidět sraženina nebo částice spojené v suspenzi (vločky) bez nežádoucích účinků na jeho použitelnost. Nerozpouštějte tuto sraženinu ani částice. Doporučuje se shromáždit pouze supernatant. Pro pozdější použití skladujte zkumavku s naředěným roztokem při teplotě 2-8 C. Musí se použít během jednoho dne. 4. ROZTOk CHLORNANU SODNÉHO (k čištění vzorkovací sondy) Příprava Připravte roztok chlornanu sodného (2 až 3 % chlorid) naředěním 250 ml 9,6 % roztoku chloridu (koncentrovaného) do 1 litru studené destilované nebo deionizované vody. Použití Pro čištění vzorkovací sondy automatického přístroje MINICAP nebo MINICAP FLEX-PIERCING, SEBIA, pro kapilární elektroforézu (týdenní údržba pro odstranění proteinů adsorbovaných na sondě). Viz návod k systému MINICAP nebo MINICAP FLEX-PIERCING, SEBIA. Pro MINICAP aplikujte do hemolyzační zkumavky 2 ml zředěného dříve připraveného chlorovaného roztoku. Pro MINICAP FLEX-PIERCING aplikujte do 100 mm zkumavky 2 ml zředěného dříve připraveného chlorovaného roztoku. Umístěte zkumavku (se stejným čárovým kódem jako roztok chlornanu sodného) na otočný autosampler přístroje MINICAP nebo MINICAP FLEX- PIERCING. Zkontrolujte, zda jsou na automatický podávací systém nádobek MINICAP / MINICAP FLEX-PIERCING umístěny nové reagenční nádobky (pokud bude reagenční nádobka chybět, zobrazí se zpráva). Zasuňte otočný autosampler do systému MINICAP / MINICAP FLEX-PIERCING. Zavřete dvířka systému MINICAP / MINICAP FLEX-PIERCING a čistící sekvence se zahájí automaticky. DŮLEŽITÉ : Pro správné použití roztoku chlornanu sodného v přístrojích MINICAP a MINICAP FLEX-PIERCING je nutné použít jeden čárový kód určený k označení zkumavky, která obsahuje roztok. Skladování, stabilita a známky znehodnocení roztoku Pracovní chlorovaný roztok skladujte v uzavřené nádobě při pokojové teplotě. Roztok je stabilní 3 měsíce. Roztok neskladujte na slunečním světle, blízko tepelného nebo zápalného zdroje, kyselin a amoniaku. 5. PROMÝVACÍ ROZTOk CAPILLARYS / MINICAP Příprava Každá lahvička promývacího roztoku CAPILLARYS / MINICAP (SEBIA, kat č. 2052, 2 lahvičky, 75 ml) může být zředěna destilovanou nebo deionizovanou vodou na 750 ml. Pro systém MINICAP je vhodné naředit pouze 25 ml zásobního roztoku destilovanou nebo deionizovanou vodou na 250 ml. Po zředění vznikne promývací roztok obsahující zásaditý roztok ph

5 Použití Pro promývání kapilár systému MINICAP. DŮLEŽITÉ : Před naplněním nádoby na promývací se roztok se doporučuje vymýt otvor nádoby a zkumavku větším množstvím destilované nebo deionizované vody, aby se zabránilo srážení solí. Skladování, stabilita a známky znehodnocení roztoku Zásobní i pracovní roztok skladujte při pokojové teplotě nebo v chladničce v uzavřených nádobách. Zásobní promývací roztok je stabilní do data expirace vyznačeného na obalu sady nebo na štítku lahvičky promývacího roztoku. Pracovní promývací roztok je stabilní 3 měsíců. Pracovní promývací roztok zneškodněte, pokud se změní jeho vzhled, například se zakalí v důsledku mikrobiální kontaminace. 6. BETA-MERkAPTOETHANOL (BME nebo 2-MERkAPTOETHANOL) (nedodávaný SEBIA) MINICAP IMMUNOTYPING /07 POZNÁMKY : Zkoušky provedené pro ověření reagentů prokázaly, že pro různé roztoky a použití přizpůsobeného vybavení pro rekonstituci objemu, nemají odchylky objemu ± 5 % z konečného objemu vliv na výsledek analýzy. Destilovaná nebo deionizovaná voda používaná k ředění roztoků musí být prostá bakteriální proliferace a plísní (použijte filtr 0,45 µm) a musí mít vodivost nižší než 3 µs/cm, což odpovídá rezistivitě vyšší než 0,33 MΩ x cm. POTŘEBNÉ VYBAVENÍ A PŘÍSLUŠENSTVÍ 1. Systém MINICAP, SEBIA, kat. č. 1230, Systém MINICAP FLEX-PIERCING, SEBIA, kat. č Otočný autosampler dodávaný se systémem MINICAP. 3. Sada nádob dodávaná se systémem MINICAP : promývací nádobka (na destilovanou či deionizovanou vodu) a nádobka na odpad. 4. MINICAP Reagenční nádobky / 125 (3), SEBIA, PN Víčka na kontejnery na použité nádobky činidel, SEBIA (12 kusů), kat. č : víka na uzavírání kontejnerů s použitými nádobkami. VZORkY PRO ANALÝZU Odběr a skladování vzorků Pro analýzu se doporučuje používat čerstvé vzorky séra. Odběr séra musí být v souladu s následujícími postupy používanými pro testování v klinických laboratořích. Vzorky lze skladovat chlazené mezi 2 až 8 C po dobu až 10 dní. Na delší skladování by měly být vzorky zmrazeny na - 18 / - 30 C do 8 hodin po odběru. Zmražené vzorky séra jsou stabilní po dobu 3 měsíců. Bílkoviny ve vzorku skladovaném při teplotě 2 až 8 C nebo 15 až 30 C podléhají degradaci, zejména složka C3, u které je kinetika degradace při teplotách C velmi rychlá a po třech dnech ji lze jasně pozorovat. Sérum skladované při teplotě mezi 2 a 8 C nebo mezi 15 a 30 C obsahuje frakci beta-2, jejíž obsah postupně klesá a může se objevit zkresleně (s dalšími malými frakcemi, které se objeví na straně gama nebo beta-1 následně po znehodnocení složky C3), a frakci alfa-2, jejíž tvar může být mírně změněn. Po 10 dnech skladování mezi 2 a 8 C nebo 3 dnech skladování mezi 15 a 30 C se frakce beta-1 začne deformovat rozpínáním a obsah frakce beta-2 se silně sníží. V závislosti na vzorcích může být po 10 dnech skladování při teplotě mezi 2 a 8 C nebo 3 dnech skladování při teplotě mezi 15 a 30 C potenciálně narušeno automatické vrstvení frakcí provedené softwarem pro zpracování dat. POZNÁMKA : Každá laboratoř musí zajistit, že jsou vzorky přepravovány za optimálních podmínek, aby nedošlo k porušení jejich integrity (1). (1) ISO : Zdravotnické laboratoře Požadavky na kvalitu a způsobilost. Příprava vzorků Používejte neředěné vzorky séra. Při skladování při 2 až 8 C nebo po zmrazení se některá séra (zvláště ty, jež obsahují kryoglobulin nebo kryogel) mohou stát viskózními nebo vznikne zákal. Tyto vzorky přímo analyzovány mohou být při pokojové teplotě. Vzorky obsahující polymerizovaný imunoglobulin mohou být použity bez další úpravy. Doporučuje se pozorovat chování séra před analýzou (např. známky hemolýzy, kryoglobuliny nebo zákal). Vzorky, které není vhodné používat Nepoužívejte staré, nesprávně skladované vzorky sér, mohl by se změnit obsah frakce beta. Nepoužívejte vzorky plazmy. Fibrinogen migruje do pozice beta-2 (větev na beta-2). POZNÁMKA : Odběrové zkumavky pro biologické vzorky jsou popsány v dostupné dokumentaci k předanalytické fázi pro biomedicínskou analýzu (údaje poskytnuté výrobci zkumavek, návody a doporučení k odběru biologických vzorků ). Nejsou-li v návodu k použití pro typ zkumavek, které mají být použity, uvedeny žádné pokyny, postupujte podle této dokumentace a v případě rozměrů zkumavek, které mají být použity, postupujte podle dokumentu SEBIA "Charakteristiky zkumavek používaných podle přístroje". Předanalytická fáze musí být provedena podle stavu poznání, různých doporučení, mimo jiné doporučení výrobců zkumavek a platných předpisů. POSTUP Systém MINICAP je multiparametrické zařízení pro analýzu sérových bílkovin ve dvou paralelních kapilárách metodou MINICAP IMMUNOTYPING v následující sekvenci : načtení čárového kódu zkumavek se vzorkem séra (až 18 zkumavek) z reagenčních zkumavek MINICAP IMMUNOTYPING a čárového kódu otočného autosampleru ; naředění vzorku z primárních zkumavek do reagenčních nádobek ; smíchání naředěných vzorků sér s roztokem ELP a specifickými antiséry v reagenčních nádobkách ;

6 promytí kapilár ; nastříknutí zředěných vzorků ; dělení bílkovin a jejich přímá detekce v kapilárách. Manuální kroky zahrnují : vložení otevřených zkumavek se vzorkem do otočného autosampleru v pozicích 1 až 18 ; vložení zkumavky s ředicím roztokem vzorku do otočného autosampleru do pozice 27 ; umístěte stojan s roztokem ELP a zkumavky antisér do otočného autosampleru do pozic 19 až 24 ; vložní otočného autosampleru do zařízení MINICAP ; odstranění zkumavek se vzorky po analýze ; odstranění a uzavření kontejnerů s použitými nádobkami. Elektroforetická analýza v systému MINICAP s metodou MINICAP PROTEIN(E) 6 se musí provést nejprve s vybranými vzorky, které pravděpodobně obsahují monoklonální bílkovinu(bílkoviny) (např. s abnormálním záznamem nebo frakcí bílkovin). PEČLIVĚ SI PROSTUDUJTE NÁVOD K POUŽITÍ. I. PŘÍPRAVA ELEkTROFORETICkÉ ANALÝZY 1. Vyberte vzorky s abnormální frakcí bílkovin v elektroforeogramech získaných metodou MINICAP PROTEIN(E) Zapněte přístroj MINICAP a počítač. 3. Aby se přístroj spustil, umístněte alespoň jednu novou reagenční nádobku do automatického podávacího systému nádobek MINICAP (pokud není nádobka přítomna, zobrazí se zpráva). 4. Nastavte program a přístroj se automaticky spustí. 5. Při analyzování vzorku v případě podezření na protein v gama zóně zvolte program ředění na základě celkové koncentrace imunoglobulinu v zóně gama, jak je vysvětleno níže. Ředění se na vzorek aplikuje automaticky. "HYPERGAMMA" je-li hladina celkového imunoglobulinu > 2 g/dl (hypergamaglobulinemie), "HYPOGAMMA" je-li hladina celkového imunoglobulinu < 0,8 g/dl (hypogamaglobulinemie), "STANDARD" je-li hladina celkového imunoglobulinu mezi 0,8-2 g/dl (výchozí program ředění). 6. Sada MINICAP IMMUNOTYPING je zamýšlena k provádění analýzy vzorku séra podle programu "IMMUNOTYPING 6" na zařízení MINICAP a s tlumivým roztokem MINICAP PROTEIN(E). Pro volbu programu analýzy "IMMUNOTYPING 6" a umístnění lahvičky s tlumivým roztokem MINICAP PROTEIN(E) 6 v pozici "B1" v zařízení si přečtěte pozorně návod k obsluze zařízení MINICAP a postupujte dle pokynů zobrazených na obrazovce. POZNÁMKA : Není nutné měnit lahvičku s tlumivým roztokem, když přepnete z metody MINICAP PROTEIN(E) 6 na metodu MINICAP IMMUNOTYPING (a naopak). 7. Novou reagenční nádobku umístněte do automatického podávacího systému nádobek MINICAP (pokud bude reagenční nádobka chybět, zobrazí se zpráva). 8. Nový kontejner na použité nádobky umístněte na zařízení MINICAP do míst určených k tomuto účelu. 9. Zkontrolujte hladinu náplně reagenčních nádobek a pokud je to nutné, doplňte činidlo a vyprázdněte odpadní nádobu. V okně "Kontrola hladiny činidel", aktualizujte software posunutím tlačítek kurzoru. 10. Otočný autosampler má 28 pozic pro umístnění zkumavek se vzorkem : umístněte 18 otevřených zkumavek se vzorkem do otočného autosampleru (pozice č. 1 až 18). Čárový kód každé zkumavky musí být vidět v otvorech na otočném autosampleru. Pokud nebyla zkumavka se vzorkem, umístěná ve stojanu na vzorky, vybraná dříve, automaticky se provede program ředění "STANDARD", Stojan s roztokem ELP a zkumavky s antisérem anti-ig G, antisérem anti-ig A a anti-ig M a anti-kappa a anti-lambda jsou připravené pro použití. Stojan zasuňte přímo do otočného autosampleru do pozic roztoku ELP a antisér pomocí dvou svorek umístěných na každé straně. Čárový kód na každé zkumavce musí být viditelný v otvorech otočného autosampleru. DŮLEŽITÉ : Před zahájením analýzy zkontrolujte, zda je stojan správně zasunut v otočném autosampleru. Odvíčkujte zkumavku ředicího roztoku vzorku a dejte ji do pozice č. 27 (pozice "ředicí roztok / roztok"). Čárový kód na zkumavce musí být viditelný v otvoru otočného autosampleru. DŮLEŽITÉ : Roztok ELP a všechna antiséra použitá pro jednu analýzu musí mít stejné číslo šarže. V žádném případě nemíchejte zbylá antiséra se stejnou specificitou nebo roztok ELP mezi 2 následujícími lahvičkami, ani v případě, že mají stejné číslo šarže. DŮLEŽITÉ : Pokud chybí zkumavka v pozicích pro zkumavky se vzorkem, v pozicích č. 19 až 24 (antiséra a roztok ELP) a v pozici č. 27 (ředicí roztok vzorku), analýzu nelze spustit a zobrazí se zpráva. 11. Zasuňte otočný autosampler do systému MINICAP. 12. Zavřete dvířka systému MINICAP, analýza se automaticky spustí. 13. Po skončení analýzy vyjměte otočný autosampler a s analyzovanými zkumavkami se vzorky. Vyjměte stojan s roztokem ELP a zkumavky antisér a ihned uložte v chladničce (2-8 C). DŮLEŽITÉ : Mezi zónami alfa-2 a beta-1 je možné pozorovat posun vzoru ELP a antiséra, pokud jsou zkumavky v přístroji ponechány delší dobu. 14. Pokud je to nutné, opatrně vyjměte kontejner obsahující použité reagenční nádobky, pevně jej uzavřete odpovídajícím uzávěrem a vyhoďte jej. VAROVÁNÍ : S kontejnery obsahujícími reagenční nádobky s biologickými vzorky se musí zacházet opatrně. ŘEDĚNÍ - MIGRACE - POPIS AUTOMATIZOVANÝCH kroků 1. Čárové kódy se načítají ze zkumavek se vzorky (až do 18), z reagenčních zkumavek MINICAP IMMUNOTYPING a z otočného autosampleru. 2. Vzorek se ředí ředicím roztokem vzorku v reagenční nádobce. 3. Dvě první činidla a naředěný vzorek jsou aspirovány a smíchány v reagenční nádobce. Vzorkovací sonda je po každém vzorku opláchnuta. S každým vzorkem se provádí vybraný program ředění. Pokud není vybraný program ředění, použije se výchozí program "STANDARD". Pořadí činidel je následující : roztok ELP a antisérum anti-ig G, antiséra anti-ig A a anti-ig M a anti-kappa a anti-lambda. 4. Kapiláry jsou promyty. 5. Zředěné vzorky s činidly se nastříknou do kapilár. 6. Migrace probíhá za konstantního napětí po dobu asi 4 minut a teplota se ovládá Peltiérovým jevem. 7. Proteiny jsou detekovány přímo skenováním při 200 nm a na obrazovce systému se objeví elektroforetický profil

7 POZNÁMKA : Kroky 3 až 7 se opět provádějí s následujícími činidly (výchozí nastavení anti-ig A a anti-ig M, a anti-kappa a anti-lambda). POZNÁMKA : Tyto kroky jsou popsány pro 2 první činidla (roztok ELP a anti-ig G). Krok 3 se pro následující činidla (antiséra anti-ig A, anti-ig M, anti-kappa a anti-lambda) provádí během 2 předchozích analýz. Kompletní záznamy z elektroforézy, odpovídající imunotypizaci vzorků, se objeví asi za 35 minut. Ve stavovém okně : - Složka "Legenda" ukazuje postup analýzy na otočném autosampleru. - Položka "Počítadlo IT" indikuje počet provedených analýz a zobrazuje se pouze v režimu "zavíčkovaných zkumavek". Po instalaci nové verze software se počítadlo analýz vynuluje. Počítá probíhající analýzy a všechny analýzy, které byly dokončeny nebo zastaveny (po přerušení). Vynulujte počítadlo, když jsou zkumavky prázdné (pomocí tlačítka "reset"). POZNÁMKA : Ve stavovém okně začne blikat varovný signál po dokončení 60 analýz. Signál zůstane zobrazen, ale nezastaví následné analýzy, dokud není počítadlo analýz vynulováno. II. VÝSLEDkY ANALÝZ Na konci analýzy se každý záznam antiséra (Ig G, Ig A, Ig M, Kappa a Lambda) automaticky převrství záznamem ELP. Pokud spolu reagovaly monoklonální složka a specifické antisérum, objeví se odpovídající frakce na záznamu antiséra. Tato srovnání umožní identifikaci a charakterizaci monoklonálních složek. III. UkONČENÍ SÉRIE ANALÝZ Po ukončení každé sekvence analýzy musí operátor zahájit postup "stand by" (přepnutí do pohotovostního režimu) nebo "shut down" (vypnutí) systému MINICAP, aby se kapiláry uložily v optimálních podmínkách. DŮLEŽITÉ : Novou reagenční nádobku umístěte na automatický podávací systém nádobek MINICAP (pokud bude reagenční nádobka chybět, zobrazí se zpráva). IV. PLNĚNÍ REAGENČNÍCH NÁDOB Systém MINICAP má automatické ovládání činidel. DŮLEŽITÉ : Dodržujte pokyny pro výměnu reagenčních nádob s ohledem na barevný kód pro lahvičky a spojovací části. V případě nezbytného provedení jednoho z následujících úkonů bude zobrazena zpráva : vložte novou lahvičku s tlumivým roztokem a/nebo, naplňte nádobu pracovním promývacím roztokem a/nebo, naplňte nádobu filtrovanou destilovanou nebo deionizovanou vodou k vyplachování kapilár a/nebo, vyprázdněte kontejner s odpadem. VAROVÁNÍ : Nepoužívejte standardně prodávanou deionizovanou vodu, jako např. na žehlení (nebezpečí poškození důležitých kapilár). Používejte výhradně ultračistou vodu, jako je např. voda pro čistoty pro nástřik. DŮLEŽITÉ : Před naplněním se doporučuje vyplachovací nádobu vymýt větším množstvím destilované nebo deionizované vody. PEČLIVĚ SI PROSTUDUJTE NÁVOD K POUŽITÍ. kontrola kvality Po každé změně série reakčního činidla se doporučuje analyzovat kontrolní sérum (jako např. Kontrolní sérum IT / IF, SEBIA PN 4788). POZNÁMKA : Je-li to nezbytné, může být roztok Normal Control Serum séra SEBIA (kat. č. 4785) nebo roztok Hypergamma Control Serum SEBIA (kat. č. 4787) použit jako negativní kontrola. VÝSLEDkY Pokyny pro analýzu záznamů 1. Referenční záznam (záznam ELP) Z důvodů abnormalit se doporučuje nejprve pečlivě vyzkoušet referenční záznam (záznam ELP). Když si všimnete nějakých abnormalit na stopě ELP, všimněte si migrační pozice píku (píků) na křivce zóna alfa-2, beta, beta-gama nebo gama. Použití záznamu ELP zejména pro vyhledávání oblastí abnormalit srovnáním záznamu ELP s každým zpracovávaným rámečkem G, A, M, kappa a lambda. Abnormality mohou představovat monoklonální, biklonální, triklonální, oligoklonální složky, těžké řetězce, volné lehké řetězce atd 2. Zkoušejte všechny rámečky zpracovávané imunoglobulinem porovnat s křivkou převrstveného referenčního záznamu (záznam ELP). Hledejte nepřítomnost nebo zmenšení abnormálního píku : Ig G : Ig G je třída nejhojnějších imunoglobulinů, která se nachází v séru a obvykle se zaznamená běžné polyklonální oddělení. Obvyklé polyklonální zmenšení tohoto píku by se nemělo mylně považovat za monoklonální složku. Polyklonální oddělení se jeví jako zmenšení frakce bez jakékoli změny její symetrie. Monoklonální Ig G se projeví oddělením píku s viditelnou změnou symetrie ve srovnání se záznamem ELP. Ig A : obvykle je Ig A v poměrně malé koncentraci ve srovnání s Ig G. Hledejte nepatrná zmenšení v gama oblasti v blízkosti beta. Záznam ELP by měl odrážet Ig A v normálních vzorcích. Ig M : záznam je podobný Ig A kromě koncentrace, která je obvykle menší. Normální vzorky budou mít velmi malé zmenšení bez změny symetrie frakce. Záznam ELP by měl odrážet záznam Ig M v normálních vzorcích

8 Kappa : jsou normálně přítomné v poměru 2 kappa na každou 1 lambdu. Normálně se zaznamená 2/3 zmenšení ve frakci gama. Polyklonální oddělení se jeví jako zmenšení frakce bez jakékoli změny její symetrie. Monoklonální složka kappa se projeví oddělením píku s viditelnou změnou symetrie ve srovnání se záznamem ELP. Lambda : v důsledku poměru kappa k lambda 2:1 musí být stopa lambda přítomná v 1/3 zbytkového zmenšení ve frakci gama v normálních vzorcích. Polyklonální oddělení se jeví jako zmenšení frakce bez jakékoli změny její symetrie. Monoklonální složka lambda se projeví oddělením píku s viditelnou změnou symetrie ve srovnání se záznamem ELP. Identifikace monoklonální složky se dosáhne oznámením přítomnosti nebo oddělení abnormálního píku (píků) v odpovídajících zpracovávaných rámečcích. Například oddělení abnormálního píku v obou zpracovávaných rámečcích G i kappa by měly ukazovat na monoklonální složku Ig G a kappa. Vyhodnocení analýzy vzorků séra Nepřítomnost monoklonální složky Normální vzorek séra nebo vzorek s hypergamaglobulinemií zobrazí zmenšení polyklonálních imunoglobulinů na záznamech antisér (viditelné jako snížení frakce gama a/nebo beta) bez jakéhokoli účinku na jiné frakce bílkovin (obr. 1). Přítomnost monoklonální složky Přítomnost monoklonální bílkoviny (monoklonální gamapatie) je charakterizována zmenšením frakce s jedním z antisér proti těžkým řetězcům (gama, alfa nebo mí) a nebo antisérem proti lehkým řetězcům kappa nebo lambda. Detekovaný monoklonální pík, obvykle ostrého a ohraničeného výskytu, musí být lokalizován ve stejné migrační vzdálenosti jako možná monoklonální frakce spatřená v referenční stopě (stopa ELP) (obr. 3 a 4). Nepřítomnost reakce s antiséry proti těžkým řetězcům a reakce s jedním z antisér proti lehkým řetězcům může svědčit o : a)velmi vzácné gamapatii Ig D nebo Ig E : potvrďte s antiséry proti těžkým řetězcům delta nebo epsilon a metodami SEBIA HYDRAGEL IF, b)gamapatii lehkého řetězce : potvrďte s antiséry proti lehkým řetězcům kappa nebo lambda a metodami SEBIA HYDRAGEL BENCE JONES nebo HYDRAGEL IF, Chybí-li pozitivní reakce s antiséry proti lehkým řetězcům, zatímco některé z antisér proti těžkým řetězcům reagují, může jít o velmi vzácnou gamapatii těžkých řetězců (gama, alfa nebo mí). Přítomnost dvou nebo více monoklonálních komponent Stejné vyhodnocení může být provedeno se vzorky se dvěma nebo více monoklonálními složkami. Ve vzácných případech může proliferovat několik klonů B-buněk imunotypizací je odhaleno několik monoklonálních proužků : biklonální gamapatie je charakterizována zmenšením dvou frakcí těžkých řetězců (identických nebo různých) a dvou frakcí lehkých řetězců (identických nebo různých) (obr. 5), polymerizované imunoglobuliny jsou charakterizovány zmenšením několika frakcí téhož typu těžkých řetězců a stejným typem lehkého řetězce, K potvrzení přítomnosti jednoduché monoklonální abnormality je nutná depolymerizace beta-merkaptoethanolem a opakovaná imunotypizace. V takovém případě (i) připravte 1% β-merkaptoethanol (BME nebo 2-merkaptoethanol, 2 ME) v roztoku Fluidil (SEBIA, kat. č. 4587, 1 lahvička 5 ml), (ii) systém MINICAP připraven čeká na otočný autosampler, přidejte 100 µl tohoto redukčního roztoku k 300 µl čistého séra, (iii) promíchejte na vortexu a vyčkejte maximálně 15 minut a potom zopakujte standardní postup. DŮLEŽITÉ : Po redukční úpravě β-merkaptoethanolem musí být vzorek neprodleně analyzován. V systému MINICAP nesmí žádná pozice čekat na analýzu. Po úpravě β-merkaptoethanolem, vzorek představuje pouze jednu monoklonální složku, pokud je ve vzorku přítomný jeden klon. Úprava snížení vzorku včetně degradace složky C3 (s vysokou deformací zóny beta) ; může se vyskytnout široká frakce mezi zónou alfa-1 a albuminem. oligoklonální gamapatie je charakterizována nepřítomností mnohočetných, obvykle malých píků nebo odchylek s jedním nebo více typy těžkých řetězců a dvěma typy lehkých řetězců (obr. 7). Zvláštní případy : pokud monoklonální frakce nezmizí úplně na záznamech antisér, zopakujte postup s vyšším ředěním vzorku. Vyberte program ředění "STANDARD" místo programu "HYPOGAMMA" nebo program ředění "HYPERGAMMA" místo programu "STANDARD". vzory s monoklonálními složkami při vysoké hladině celkového imunoglobulinu (program ředění "HYPERGAMMA") V takovém případě je komplex antigen - protilátka velká a široká frakce umístěná mezi zóny albuminu a alfa-1, monoklonální frakce nemusí zcela zmizet na záznamech antisér (obr. 2). vzorky s polymerizovanými monoklonálními složkami V takovém případě je komplex antigen - protilátka velká a široká frakce umístěná mezi zóny albuminu a beta-1. Vzorky vykazující monoklonální komponenty, které migrují v jiných zónách než gama (alfa-2, beta-1 nebo beta-2) Jestliže silná monoklonální komponenta migruje v jiné zóně než gama (alfa-2, beta-1 nebo beta-2), zvolte program ředění na základě celkové koncentrace imunoglobulinů, jak je vidět na profilu (zóna gama + suspektní monoklonální proteiny v alfa-2 nebo beta). Biklonály Biklonály mohou být důsledkem komplexní nebo biklonální gamapatie nebo křížových reakcí, které jsou velmi vzácné (viz odstavec Interference a omezení). Vymizení Ig M na antisérových typech anti-kappa a lambda : V případě úplného odečtení píku s protilátkami proti Ig M, kappa a lehkým řetězcům lambda se doporučuje ošetřit vzorek redukčním přípravkem beta-merkaptoethanol (viz předchozí odstavec) a opakovat imunotypizaci. V případě vícenásobných současných reakcí s protilátkami těžkých řetězců G, A a M se doporučuje analyzovat znovu sérový vzorek výběrem možnosti ředení "OPTIMIZED" (optimalizované). Interference a omezení DŮLEŽITÉ : Použití jiných než specifických antisér pro metodu MINICAP IMMUNOTYPING poskytnutých spolu se sadou může mít špatný vliv na výsledky. Používejte pouze specifická antiséra pro metodu MINICAP IMMUNOTYPING. Viz VZORKY PRO ANALÝZU. Vzhledem k omezené rozlišovací schopnosti a citlivosti zónové elektroforézy je možné, že některé monoklonální komponenty nebudou touto metodou detekovány. V mnoha studiích bylo prokázáno, že reakce antigen - protilátka je odlišná v kapalné a agarózové fázi. Postupy imunotypizace kapilární elektroforézou se provádí zcela v kapalném médiu a některá antiséra mohou někdy křížově reagovat s monoklonálními složkami přítomnými ve vzorku. Neexistuje žádné riziko falešně negativních výsledků, jako je nezjištění přítomné gamapatie

9 Tato křížová reakce, ke které dochází jen vzácně, může vést k určení biklonální gamapatie místo skutečné monoklonální gamapatie. Z dostupné literatury vyplývá, že není žádný rozdíl v léčbě biklonální a monoklonální gamapatie (Kyle et al, 1981). Pokud je vzorek neurčitý, může být nutné provést další testování s použitím imunofixační soupravy HYDRAGEL. Mohou být pozorovány jemné posuny mezi záznamem ELP a překrytými záznamy antisér (zvláště v zóně beta-1). Nesmějí se považovat za výsledek zmizení monoklonální frakce v jednom nebo více záznamech antisér. Jako u každé elektroforetické metody může být obtížné rozeznat malé monoklonální bílkoviny, které migrují spolu s dalšími normálními bílkovinami séra. Pokud jsou podezřelé malé monoklony, je nutné provést další testování imunofixační sadou SEBIA HYDRAGEL. Když je metodou MINICAP pro analýzu bílkovin detekována monoklonální složka, MINICAP PROTEIN(E) 6 a není charakterizována metodou MINICAP IMMUNOTYPING, doporučuje se zopakovat imunotypizaci vzorku dříve ošetřeného betamerkaptoethanolem (viz předchozí odstavec) a pokud nejistota přetrvává, potvrdit výsledek imunofixační technikou na agarózový gel. Nebylo zjištěno žádné rušení postupu MINICAP IMMUNOTYPING v důsledku vysoké koncentrace cholesterolu ( 8,24 mmol/l), triglyceridů ( 11,58 mmol/l) a hemoglobinu ( 0,40 g/dl) ve vzorku. Rušení bilirubinem nebylo pro metodu MINICAP IMMUNOTYPING studováno. Doporučuje se sledovat vlastnosti vzorku séra. V případě podezření na rušení se doporučuje znovu provést analýzu vzorku séra nebo použít doplňkovou studii jinou metodou. Řešení problémů Pokud při dodržení veškerých instrukcí pro přípravu, skladování a provedení testu uvedených v příbalovém letáku testy nevycházejí, kontaktujte technickou podporu společnosti SEBIA. Bezpečnostní datové listy soupravy činidel a informace o čištění a likvidaci odpadů, označování a bezpečnostní pravidla používaná společností SEBIA, obaly pro přepravu biologických vzorků a informace o čistění přístroje jsou k dispozici na webových stránkách SEBIA : ÚDAJE O VÝkONU Reprodukovatelnost mezi sekvencemi a jednotlivými analýzami Reprodukovatelnost v sekvenci a mezi analýzami byla demonstrována na třech rozdílných patologických vzorcích sér s monoklonálními složkami (Ig GL, Ig AK a Ig MK) a na jednom vzorku normálního séra. Byly analyzovány na 3 systémech MINICAP metodou MINICAP IMMUNOTYPING a při programu ředění "STANDARD", při použití stejné šarže sady MINICAP IMMUNOTYPING. Každé sérum bylo 3krát analyzováno na obou kapilárách každého systému MINICAP s jedním z 6 činidel, podle zkoušeného vzorku (roztok ELP pro normální vzorek, antiséra anti-ig G, anti-ig A, anti-ig M, anti-kappa a anti-lambda pro patologické vzorky podle monklonální složky). Všechna opakování poskytla stejné výsledky v sekvenci a mezi analýzami a záznamy odpovídala typu každého zkoušeného vzorku. Imunotypizace metodou MINICAP IMMUNOTYPING umožnila charakterizaci pouze jedné monoklonální složky z každého patologického vzorku a žádnou abnormální frakci normálního vzorku. Reprodukovatelnost mezi analýzami a mezi systémy Reprodukovatelnost mezi analýzami a mezi systémy byla demonstrována na třech různých patologických vzorcích sér s jednou monoklonální složkou (Ig GK, Ig GL a Ig MK) a s rozdílnými koncentracemi imunoglobulinu. Jeden vzorek (s hladinou celkového Ig < 0,8 g/dl) byl analyzován metodou MINICAP IMMUNOTYPING a programem ředění "HYPOGAMMA", jeden vzorek (s hladinou celkového Ig v rozsahu 0,8 až 2 g/dl) programem ředění "STANDARD" a jeden vzorek (s hladinou celkového Ig > 2 g/dl) s programem ředění "HYPERGAMMA". Tyto vzorky byly analyzovány 3 krát po sobě v každém ze 3 systémů MINICAP při použití stejné šarže sady MINICAP IMMUNOTYPING. Všechna opakování poskytla identické výsledky mezi analýzami a mezi systémy a záznamy přesně identifikovaných monoklonálních složek. Metoda MINICAP IMMUNOTYPING umožňuje charakterizaci očekávaných monoklonálních složek pro tři patologické vzorky. Reprodukovatelnost mezi analýzami a mezi šaržemi Reprodukovatelnost mezi analýzami a mezi šaržemi byla prokázána na dvou různých patologických vzorcích séra s jednou monoklonální složkou (Ig GK nebo Ig MK) a na jednom vzorku séra se dvěma monoklonálními složkami (Ig AL). U všech vzorků byla hladina Ig mezi 0,8 a 2 g/dl. Tyto vzorky byly analyzovány 3krát po sobě třemi různými šaržemi sad MINICAP IMMUNOTYPING a režimu ředění "STANDARD". Všechna opakování poskytla identické výsledky mezi analýzami a mezi šaržemi a záznamy přesně identifikovaných monoklonálních složek. Metoda MINICAP IMMUNOTYPING umožňuje charakterizaci očekávaných monoklonálních složek pro tři patologické vzorky. Studie shody Studie shody byla provedena na 69 vzorcích sér srovnáním metody MINICAP IMMUNOTYPING a komerčně dostupným systémem kapilární elektroforézy pro imunotypizaci : oběma technikami bylo analyzováno 57 různých patologických vzorků sér a 12 normálních vzorků sér. Studie prokázala 100 % shodu mezi těmito dvěma technikami : pro 12 patologických vzorků séra : úplná shoda. pro 57 patologických vzorků séra : úplná shoda. ve všech případech obě techniky detekovaly a charakterizovaly monoklonální bílkoviny (imunotypizace) v lidském séru v úplné shodě. Citlivost Postupným ředěním byly připraveny v normálním séru se třemi patologickými vzorky sér všech obsažených monoklonálních složek a byly analyzovány metodou MINICAP IMMUNOTYPING

10 Výsledky jsou shrnuty níže : MONOkLONÁLNÍ SLOŽkA koncentrace (g/dl) Č. VZORkU DETEkČNÍ LIMIT (mg/dl) TYP (v původním séru) 1 Ig A, L Alfa Lambda 25 2 Ig G, K Gama Kappa 25 3 Ig M, K Mí Kappa 25 Detekční limit monoklonální složky je přibližně 25 mg/dl. POZNÁMKA : Může se lišit v závislosti na blízkosti a hodnotě interferující bílkoviny. Citlivost se bude zvyšovat pro monoklonální migraci u katodového konce zóny gama a snižovat uprostřed zóny polyklonální hypergamaglobulinemie. V závislosti na umístění monoklonální složky a polyklonálního pozadí v zónách gama a beta, se může detekční limit lišit

11 ANALÝZA VZORkŮ MOČI : POSTUP IMUNOTYPIZACE MOČI MINICAP POTŘEBNÁ ČINIDLA (ale neobsažené v sadě MINICAP IMMUNOTYPING) VAROVANÍ: Viz bezpečnostní listy 1. SADA MINICAP PROTEIN(E) 6 (SEBIA, kat. č. 2203) Příprava, použití, skladování, stabilita a známky znehodnocení Viz návod obsažený v sadě. 2. SOUPRAVA CAPILLARYS / MINICAP URINE (SEBIA, PN 2013) Použití, skladování, stabilita a známky znehodnocení roztoku Viz návod obsažený v sadě. Použití K přípravě vzorků moři před separací lidských proteinů z moči kapilární elektroforézou s použitím systému MINICAP. 3. DESTILOVANÁ NEBO DEIONIZOVANÁ VODA Použití K vyplachování kapilár v systému MINICAP, SEBIA, pro elektroforézu. Je doporučeno používat filtrovanou, destilovanou nebo deionizovanou vodu (na filtr o porozitě 0,45 μm) a s vodivostí nižší než 3 µs/cm, což odpovídá rezistivitě vyšší než 0,33 MΩ x cm. Vodu je nutno denně měnit, aby nedošlo k mikrobiální kontaminaci. Pro optimální funkci přidejte roztok CLEAN PROTECT (SEBIA, KAT. Č. 2059, 1 lahvička o objemu 5 ml) do destilované nebo deionizované vody nebo použijte přímo roztok CAPIprotect* připravený k použití (SEBIA, KAT. Č : 2 nádoby o objemu 5 L destilované vody s CLEAN PROTECT). DŮLEŽITÉ : Vyplachovací kontejner je před naplněním nutno vymýt větším množstvím destilované nebo deionizované vody. * POZNÁMKA : Řešení CAPIprotect lze také použít k rozředění zásobního promývacího roztoku. Pak v takovém případě může zředěný promývací roztok vykazovat přechodnou, více či méně žlutou barvu bez jakýchkoliv negativních účinků na jeho výkon. 4. CAPICLEAN Složení Lahvička koncentrovaného roztoku CAPICLEAN (SEBIA, PN 2058, 25 ml) obsahuje proteolytické enzymy, povrchově aktivní činidla a aditiva, která nejsou nebezpečná v používaných koncentracích, nezbytných pro optimální výkon. Použití K čištění vzorkovací sondy v automatickém systému MINICAP, SEBIA, pro kapilární elektroforézu, během čisticí sekvence CAPICLEAN. DŮLEŽITÉ: Čisticí sekvenci CAPICLEAN spusťte alespoň jednou týdně a nejvýše jednou denně nebo po každých 500 analýzách, pokud jsou provedeny za méně než jeden týden. Viz návod k CAPICLEAN, SEBIA. DŮLEŽITÉ : Pro správné použití roztoku CAPICLEAN v přístroji MINICAP je nutné použít jeden čárový kód určený pro označení zkumavky, která obsahuje naředěný roztok CAPICLEAN. Skladování, stabilita a známky zhoršování Skladujte CAPICLEAN v chladničce (2 8 C). Je stabilní do data exspirace vyznačeného na štítku lahvičky. NEZMRAZUJTE. V lahvičce roztoku CAPICLEAN může být vidět sraženina nebo částice spojené v suspenzi (vločky) bez nežádoucích účinků na jeho použitelnost. Nerozpouštějte tuto sraženinu ani částice. Doporučuje se shromáždit pouze supernatant. Pro pozdější použití skladujte zkumavku obsahující zředěný roztok při teplotě 2 8 C. Roztok je nutno použít v průběhu dne. 5. ROZTOk CHLORNANU SODNÉHO (k čištění vzorkovací sondy) Příprava Připravte 9 chlorovaný roztok chlornanu sodného (2 až 3 % chlorid) naředěním 250 ml 9,6 % chlorovaného koncentrovaného roztoku v 1 litru studené destilované nebo deionizované vody. Použití Pro čištění vzorkovací sondy systému MINICAP (týdenní údržba pro odstranění proteinů adsorbovaných na sondu ze vzorku). Viz návod k systému SEBIA MINICAP. Aplikujte do hemolyzační zkumavky 2 ml zředěného dříve připraveného chlorovaného roztoku. Umístěte zkumavku (se stejným čárovým kódem jako roztok chlornanu sodného) na otočný autosampler přístroje MINICAP. Novou reagenční nádobku umístněte na automatický podávací systém nádobek MINICAP (pokud bude reagenční nádobka chybět, zobrazí se zpráva). Zasuňte otočný autosampler do systému MINICAP. Zavřete dvířka systému MINICAP a čistící sekvence se zahájí automaticky. DŮLEŽITÉ : Pro správné použití roztoku chlornanu sodného v přístroji MINICAP je nutné použít jeden čárový kód určený k označení zkumavky, která obsahuje roztok. Skladování, stabilita a známky zhoršování Uchovávejte chlorovaný pracovní roztok při pokojové teplotě v uzavřené nádobě. Je stabilní po dobu 3 měsíce. Roztok neskladujte na slunečním světle, blízko tepelného nebo zápalného zdroje, kyselin a amoniaku

12 6. CAPILLARYS / MINICAP PROMÝVACÍ ROZTOk Příprava Každá lahvička promývacího roztoku CAPILLARYS / MINICAP (SEBIA, kat č. 2052, 2 lahvičky, 75 ml) může být zředěna destilovanou nebo deionizovanou vodou na 750 ml. Pro systém MINICAP je vhodné naředit pouze 25 ml zásobního roztoku destilovanou nebo deionizovanou vodou na 250 ml. Po zředění vznikne promývací roztok obsahující zásaditý roztok ph 12. Použití Pro promývání kapilár systému MINICAP. DŮLEŽITÉ: Před naplněním zásobníku na promývací se roztok se doporučuje vymýt otvor zásobníku a zkumavku větším množstvím destilované nebo deionizované vody, aby se zabránilo srážení solí. Skladování, stabilita a známky zhoršování Skladujte zásobní a pracovní promývací roztok v uzavřených nádobách při pokojové teplotě nebo v chladničce. Zásobní promývací roztok je stabilní do data exspirace vyznačeného na obalu sady nebo na štítku lahvičky promývacího roztoku. Pracovní promývací roztok je stabilní 3 měsíce. Pracovní promývací roztok zlikvidujte, pokud změní vzhled, např. pokud se zakalí vlivem mikrobiální kontaminace. POZNÁMKY: Zkoušky provedené pro ověření reagentů prokázaly, že pro různé roztoky a použití přizpůsobeného vybavení pro rekonstituci objemu, nemají odchylky objemu ± 5 % z konečného objemu vliv na výsledek analýzy. Destilovaná nebo deionizovaná voda používaná k ředění roztoků musí být prostá bakteriální proliferace a plísní (použijte filtr 0,45 µm) a musí mít vodivost nižší než 3 µs/cm, což odpovídá rezistivitě vyšší než 0,33 MΩ x cm. POTŘEBNÉ ZAŘÍZENÍ A PŘÍSLUŠENSTVÍ 1. Systém MINICAP, SEBIA, kat. č Otočný podavač vzorků dodávaný se systémem MINICAP. 3. Sada nádob dodávaná se systémem MINICAP: promývací nádobka (na destilovanou či deionizovanou vodu) a nádobka na odpad. 4. MINICAP Reagenční nádobky / 125 (3), SEBIA, PN Víka na kontejnery s použitými reagenčními nádobkami, SEBIA (12 jednotek), PN 2286 : víka na uzavírání kontejnerů s použitými nádobkami. 6. Hemolyzační zkumavky (75 mm vysoká a 13 mm průměr). VZORkY PRO ANALÝZU Odběr a skladování vzorků Analýza se přednostně provádí s čerstvou močí shromážděnou během 24 hodin. Odběr moči musí být v souladu s následujícími postupy používanými pro testování v klinických laboratořích. Vzorky moči je možno skladovat chlazené mezi 2 až 8 C po dobu jednoho týdne. Pro delší doby skladování se doporučuje uchovávat vzorky zmrazené při teplotě - 70 / - 80 C (stabilní nejméně jeden měsíc). DŮLEŽITÉ: Neskladujte vzorky při teplotě - 18 / - 30 C. Roztáté či nevhodně skladované vzorky mohou vzhledem k degradaci proteinů vykazovat modifikované a jiné další struktury. POZNÁMKA: Vzorky moči je třeba skladovat při pokojové teplotě. Příprava vzorků Před analýzou připravte vzorky moči podle postupu přípravy dialýzy a v koncentraci uvedené v příbalové informaci soupravy CAPILLARYS / MINICAP URINE (viz odstavec "Nedodávaná avšak požadovaná činidla"). Použijte přímo tyto připravené vzorky moči. DŮLEŽITÉ: Metoda analýzy moči kapilární elektroforézou vyžaduje 2 kroky: krok dialýzy a krok koncentrace vzorků moči s použitím dialyzačního systému SEBIA (20 ml zkumavky). Použijte pouze jednu zkumavku na vzorek. Pak lze odebrané dialyzované a koncentrované vzorky moči lze analyzovat s použitím postupů MINICAP URINE a MINICAP IMMUNOTYPING URINE. Analýzu vzorků moči proveďte nejdéle jeden den po jejich přípravě. Pro omezení adsorpce proteinů na dialyzační membránu a koncentrační zařízení (dialyzační systém) se nedoporučuje skladovat vzorek v dialyzačním systému po centrifugace, ale doporučuje se jej skladovat v mikrozkumavce v chladničce (při teplotě 2-8 C). Vzorky, které není vhodné používat Nepoužívejte staré, nesprávně skladované vzorky moči, došlo by ke změně frakcí v důsledku denaturace. Doporučuje se sledovat vlastnosti vzorku moči po první centrifugaci (tzn. známky hemolýzy nebo zakalení). Neskladujte vzorky v dialyzačních a koncentračních zařízeních, protože některé proteiny by se mohly navázat na membránu. POZNÁMKA: Odběrové zkumavky a centrifugační parametry pro biologické vzorky jsou popsány v dostupné dokumentaci v předanalytické fázi pro biomedicínskou analýzu (údaje poskytnuté výrobcem zkumavek, návody a doporučení k odběru biologických vzorků...). Nejsou-li v návodu k použití pro typ zkumavek, které mají být použity, nebo k centrifugaci uvedeny žádné pokyny, postupujte podle této dokumentace a v případě rozměrů zkumavek, které mají být použity, postupujte podle dokumentu SEBIA "Charakteristiky zkumavek používaných podle přístroje". Předanalytická fáze musí být provedena podle stavu poznání, různých doporučení, mimo jiné doporučení výrobců zkumavek a platných předpisů

13 POSTUP Systém MINICAP je multiparametrický nástroj pro analýzu proteinů z moči ve dvou paralelních kapilárách postupem MINICAP IMMUNOTYPING URINE v následujícím pořadí: Odečet čárového kódu ze zkumavek se vzorky moči (maximálně 18), z reagenčních zkumavek MINICAP IMMUNOTYPING a z otočného podavače vzorků; Zředění vzorku v reagenčních nádobkách; Smísení zředěných vzorků moři roztokem ELP a specifickými antiséry v reagenčních nádobkách; Promývání kapilár; Vstřikování zředěných vzorků; Separace proteinů a přímá detekce separovaných proteinů na kapilárách. Manuální kroky zahrnují: Nasazení mikrozkumavek (bez víček) se vzorky k analyzování do přídržných hemolytických zkumavek v otočném podavači vzorků do pozic 1-18; každý zkumavka musí být označena specifickým identifikačním štítkem s čárovým kódem, odpovídajícím vzorku k analýze; Nasaďte zkumavku s ředidlem vzorku do otočného podavače vzorků do pozice 27; Nasaďte stojan s roztokem ELP a se zkumavkami s antisérem do otočného podavače vzorků do pozic 19-24; Nasaďte otočný podavač vzorků do přístroje MINICAP; Po analýze zkumavky se vzorky odstraňte; Odstraňte a zavřete kontejnery na použité nádobky. Elektroforetickou analýzu na systému MINICAP s použitím postupu MINICAP URINE je třeba provést nejprve pro výběr vzorků s podezřením na přítomnost monoklonálního proteinu či monoklonálních proteinů (např. s abnormálními skvrnami či frakcí proteinů). PEČLIVĚ SI PROSTUDUJTE NÁVOD K POUŽITÍ I. PŘÍPRAVA ELEkTROFORETICkÉ ANALÝZY 1. Vyberte vzorky s abnormální frakcí proteinů na elektroforegramech, získané postupem MINICAP URINE. 2. Zapněte přístroj MINICAP a počítač. 3. aby se přístroj spustil, umístěte alespoň jednu novou reagenční nádobku do automatického podávacího systému nádobek MINICAP (pokud není nádobka přítomna, zobrazí se zpráva). 4. Nastavte program a přístroj se automaticky spustí. 5. Pro každý vzorek k analýze určete hodnotu "Ratio urine" (poměr moči) abnormální frakce pro charakterizaci u elektroforetických skvrn, získaných s použitím programu "URINE" (viz odstavec "Analýza výsledků" v příbalové informaci k soupravě CAPILLARYS / MINICAP URINE). "Ratio urine" (poměr moči) je definován jako podíl plochy abnormální frakce ve vztahu k celkové ploše proteinů normálního kontrolního séra. 6. Zvolte program ředění pro automatickou aplikaci podle hodnoty "Ratio urine".(poměr moči). "HYPOGAMMA" je-li hodnota "Ratio urine" (poměr moči) < 0,55, "STANDARD" je-li hodnota "Ratio urine" (poměr moči) mezi 0,55 a 1,55, "HYPERGAMMA" je-li hodnota "Ratio urine" (poměr moči) > 1,55. POZNÁMKA: Je-li hodnota "Ratio urine" (poměr moči) ± 10 % od jedné z prahových hodnot (0,55 nebo 1,55), doporučuje se program ředění podle abnormální frakce pro charakterizaci postupem MINICAP IMMUNOTYPING URINE: - pro zlepšení detekce slabé frakce zřeďte méně vzorku moči volbou programu ředění "HYPOGAMMA" namísto programu "STANDARD" a programu ředění "STANDARD" namísto programu "HYPERGAMMA", - pro zlepšení imunotypizace vysoké frakce zřeďte více vzorku moči volbou programu ředění "STANDARD" namísto programu "HYPOGAMMA" a programu ředění "HYPERGAMMA" namísto programu "STANDARD". 7. Pro analýzu vzorku moči je určena souprava MINICAP IMMUNOTYPING pro použití s programem analýzy "IMMUNOTYPING URINE" přístroje MINICAP a pufrem MINICAP PROTEIN(E) 6. Před volbou programu analýzy "IMMUNOTYPING URINE" a umístěním lahvičky s pufrem MINICAP PROTEIN(E) 6do pozice "B1" v přístroji si pečlivě prostudujte návod k použití MINICAP a postupujte podle pokynů zobrazovaných na obrazovce. POZNÁMKA: Není nutno vyměňovat lahvičku s pufrem při přechodu z postupu MINICAP URINE na postup MINICAP IMMUNOTYPING URINE a naopak. 8. Novou reagenční nádobku umístěte do automatického podávacího systému nádobek MINICAP (pokud bude reagenční nádobka chybět, zobrazí se zpráva). 9. Nový kontejner na použité nádobky umístěte do přístroje MINICAP do míst určených k tomuto účelu. 10. Zkontrolujte hladinu náplně reagenčních nádobek a pokud je to nutné, doplňte činidlo a vyprázdněte odpadní nádobu. V okně "Check reagent levels" (zkontrolujte hladiny reagencií) aktualizujte software pohybem tlačítek kurzoru. 11. Otočný podavač vzorků má 28 pozic pro umístnění zkumavek se vzorkem: Umístěte maximálně 18 prázdných hemolyzačních zkumavek (používaných jako držáky) opatřených štítky s čárovým kódem pro každého pacienta do otočného podavače vzorků (pozic 1 až 18) a pak mikrozkumavky obsahující dialyzované vzorky moči. Před použitím odřízněte ze všech mikrozkumavek víčka. Čárový kód každé zkumavky musí být viditelný na otvorech otočného podavače vzorků. Jestliže zkumavka se vzorkem umístěná do automatického podavače vzorků není dříve vybrána, provede se automaticky program ředění "HYPOGAMMA". V případě potřeby si uschovejte víčko pro další skladování vzorků. DŮLEŽITÉ: Doporučuje se identifikovat každou hemolyzační zkumavku obsahující mikrozkumavku se vzorkem k analýze štítkem s čárovým kódem specifickým pro každý vzorek. Stojan s roztokem ELP a zkumavkami se séry anti-ig G, anti-ig A, anti-ig M, anti-kappa a anti-lambda je připraven k použití. Stojan zasuňte přímo do otočného podavače vzorků do pozic roztoku ELP a antisér pomocí dvou svorek umístěných na každé straně. Čárový kód na každé zkumavce musí být viditelný v otvorech otočného podavače vzorků. DŮLEŽITÉ: Před zahájením analýzy zkontrolujte, zda je stojan správně zasunut v otočném podavači vzorků. Odvíčkujte zkumavku s ředidlem vzorku a umístěte ji do pozice č. 27 (pozice "Diluent / Solution" (rozpouštědlo/vzorek), čárový kód zkumavky musí být viditelný v otvoru otočného podavače vzorků. DŮLEŽITÉ: Roztok ELP a všechna antiséra použitá pro jednu analýzu musí mít stejné číslo šarže. V žádném případě nemíchejte zbylá antiséra se stejnou specificitou nebo roztok ELP mezi 2 následujícími lahvičkami, ani v případě, že mají stejné číslo šarže. DŮLEŽITÉ: Jestliže chybí zkumavka v pozici pro zkumavky se vzorky, v pozicích č, (antiséra a roztok ELP) a v pozici č. 27 (ředidlo vzorku), analýzu nelze spustit a zobrazí se hlášení

14 12. Zasuňte otočný podavač vzorků do systému MINICAP. 13. Zavřete dvířka systému MINICAP a postupujte podle pokynů zobrazovaných na obrazovce. 14. Po skončení analýzy vyjměte otočný podavač vzorků a s analyzovanými zkumavkami se vzorky. Odstraňte stojan s roztokem ELP a se zkumavkami s antiséry a neprodleně jej uložte do chladničky (2 8 C). DŮLEŽITÉ: Jsou-li zkumavky v přístroji ponechány delší dobu, lze pozorovat posun skvrn ELP a antisér mezi zónami alfa-2 a beta Pokud je to nutné, opatrně vyjměte kontejner obsahující použité reagenční nádobky, pevně jej uzavřete odpovídajícím uzávěrem a vyhoďte jej. VAROVANÍ: s kontejnery obsahujícími reagenční nádobky s biologickými vzorky se musí zacházet opatrně. ŘEDĚNÍ - MIGRACE - POPIS AUTOMATICkÝCH kroků 1. Čárové kódy jsou odečítány ze zkumavek se vzorky moči k analýze (max. 18) z reagenčních zkumavek MINICAP IMMUNOTYPING a z otočného podavače vzorků. 2. Dialyzovaný vzorek moči je zředěn ředidlem vzorku v reagenční nádobce. 3. Dvě první činidla a naředěný vzorek jsou aspirovány a smíchány v reagenční nádobce. Vzorkovací sonda je po každém vzorku opláchnuta. S každým vzorkem se provádí vybraný program ředění. Pokud není vybraný program ředění, použije se výchozí program "HYPOGAMMA". Pořadí činidel je následující: roztok ELP a antisérum anti-ig G, antiséra anti-ig A a anti-ig M a anti-kappa a anti-lambda. 4. Kapiláry jsou promyty. 5. Zředěné vzorky s činidly se nastříknou do kapilár. 6. Migrace se uskutečňuje za konstantního napětí po dobu asi 4 minuty a teplota je řízena Peltierovým efektem. 7. Proteiny jsou detekovány přímo skenováním při 200 nm a na obrazovce systému se objeví elektroforetický profil. POZNÁMKA: kroky 3 až 7 se opět provádějí s následujícími činidly (výchozí nastavení anti-ig A a anti-ig M, a anti-kappa a anti-lambda). POZNÁMKA: tyto kroky jsou popsány pro 2 první činidla (roztok ELP a anti-ig G). Krok 3 se pro následující činidla (antiséra anti-ig A, anti-ig M, anti- Kappa a anti-lambda) provádí během 2 předchozích analýz. Kompletní záznamy z elektroforézy, odpovídající imunotypizaci vzorků, se objeví asi za 35 minut. Ve stavovém okně: - Ve složce "Legend" (legenda) se zobrazuje postup analýz na otočném podavači vzorků. - "IT counter" (počitadlo IT) hlásí počet provedených analýz a zobrazuje se pouze v režimu "capped tubes" (zavíčkované zkumavky). Po instalaci nové verze software se počítadlo analýz vynuluje. Počítá probíhající analýzy a všechny analýzy, které byly dokončeny nebo zastaveny (po přerušení). Vynulujte počítadlo, když jsou zkumavky prázdné (pomocí tlačítka "reset"). POZNÁMKA: Ve stavovém okně začne blikat varovný signál po dokončení 60 analýz. Signál zůstane zobrazen, ale nezastaví následné analýzy, dokud není počítadlo analýz vynulováno. II. VÝSLEDkY ANALÝZ Na konci analýzy se každý záznam antiséra (Ig G, Ig A, Ig M, Kappa a Lambda) automaticky převrství záznamem ELP. Pokud spolu reagovaly monoklonální složka a specifické antisérum, objeví se odpovídající frakce na záznamu antiséra. Tato srovnání umožní identifikaci a charakterizaci monoklonálních složek. Pro analýzu vzorků moči jsou pozice různých zón (albumin, alfa 1, alfa 2, beta a gama) identifikovány na obrazovce a na zprávě o výsledcích. III. UkONČENÍ SÉRIE ANALÝZ Po ukončení každé sekvence analýzy musí operátor zahájit postup "stand by" (přepnutí do pohotovostního režimu) nebo "shut down" (vypnutí) systému MINICAP, aby se kapiláry uložily v optimálních podmínkách. DŮLEŽITÉ: Novou reagenční nádobku umístěte na automatický podávací systém nádobek MINICAP (pokud bude reagenční nádobka chybět, zobrazí se zpráva). IV. PLNĚNÍ REAGENČNÍCH NÁDOB Systém MINICAP má automatické ovládání činidel. DŮLEŽITÉ: Dodržujte pokyny pro výměnu reagenčních nádob s ohledem na barevný kód pro lahvičky a spojovací části. V případě nezbytného provedení jednoho z následujících úkonů bude zobrazena zpráva: Nasaďte novou lahvičku s pufrem a / nebo Naplňte nádobu pracovním promývacím roztokem a / nebo Naplňte nádobu filtrovanou destilovanou nebo deionizovanou vodou k propláchnutí kapilár a / nebo Vyprázdněte odpadní kontejner VAROVANÍ: Nepoužívejte standardně prodávanou deionizovanou vodu, jako např. na žehlení (nebezpečí poškození důležitých kapilár). Používejte výhradně ultračistou vodu, jako je např. voda používaná k výrobě injekčních roztoků. DŮLEŽITÉ: Před naplněním se doporučuje vyplachovací nádobu vymýt větším množstvím destilované nebo deionizované vody. PEČLIVĚ SI PROSTUDUJTE NÁVOD K POUŽITÍ

15 VÝSLEDkY Vyhodnocení analýzy vzorků moči Nepřítomnost monoklonální složky Vzorek moči s glomerulární nebo smíšenou proteinurií a s polyklonálními imunoglobuliny vykazuje zmizení polyklonálních imunoglobulinů na skvrnách antisér (jeví se jako pokles frakce gama a/nebo beta) bez jakéhokoli vlivu na proteinové frakce. Přítomnost monoklonální komponenty Přítomnost úplného monoklonálního imunoglobulinu je charakterizován zmizením frakce s jedním nebo více antiséry proti těžkému řetězci (gama, alfa nebo mu) a s antisérem proti lehkému řetězci buď anti-kapa nebo anti-lambda. Detekovaný monoklonální pík, typicky ostrého a ohraničeného vzhledu, musí být umístěn na stejné migrační pozici, jako suspektní monoklonální frakce, kterou lze pozorovat u referenčního záznamu (záznam ELP). Nepřítomnost refrakce s žádným z použitých antisér proti těžkým řetězcům a reakce s jedním z antisér proti lehkým řetězcům může naznačovat slabou gamapatii: potvrďte ji s použitím antisér anti-kapa nebo anti-lambda bez přítomnosti lehkých řetězců a postupů SEBIA HYDRAGEL BENCE JONES nebo HYDRAGEL IF. Není-li pozorována pozitivní reakce se žádným z aplikovaných sér proti lehkému řetězci když antisérum proti těžkému řetězci reaguje může znamenat velmi vzácnou gamapatii řetězce (gama, alfa nebo mu). Přítomnost dvou nebo více monoklonálních komponent Polymerizované imunoglobuliny jsou charakterizovány zmizením několika frakcí stejného typu lehkého řetězce. Speciální případy : Jestliže monoklonální frakce na skvrnách antiséra zcela nezmizí, opakujte postup s vyššim zředěním vzorku moči. Zvolte program ředění "STANDARD" namísto programu "HYPOGAMMA" nebo program ředění "HYPERGAMMA" namísto programu "STANDARD". Vzorky s monoklonálními komponentami při vysokých koncentracích (program ředění "HYPERGAMMA"): V takovém případě je komplex antigen - protilátka velká a široká frakce umístěná mezi zóny albuminu a alfa-1, monoklonální frakce nemusí na záznamech antisér zcela zmizet. Přítomnost kompletního imunoglobulinu v asociaci s volným lehkým řetězcem lze charakterizovat zmizením dvou frakcí s jedním z antisér proti lehkému řetězci a zmizením pouze jedné frakce s antiséry proti těžkému řetězci. Doporučuje se zvolit program ředění podle abnormální frakce, která má být charakterizována pro zlepšení detekce slabé frakce nebo imunotypizaci vysoké frakce (viz odstavec "Příprava elektroforetické analýzy"). Rušení a omezení DŮLEŽITÉ: Použití jiných antisér než těch, který jsou specifická pro postup MINICAP IMMUNOTYPING URINE poskytnutý k soupravě může ovlivnit výsledky. Používejte pouze antiséra specifická pro postup MINICAP IMMUNOTYPING URINE. Viz VZORKY PRO ANALÝZU. Analyzujte pouze vzorky připravené s použitím dialyzačních a koncentračních zařízení, jako jsou dialyzační systémy SEBIA nebo ekvivalentní zařízení, poskytující stejný výkon a schválená pro chemické analýzy, Chybná dialýza vzorků může způsobit nebílkovinné zbytkové frakce. Pokud je podezření na výskyt rušivé frakce, doporučuje se provést znovu dialýzu vzorku moči. Rušení, například zbytky léků nebo soli, jsou odstraněna během dialyzačního kroku. Pokud není tento krok pečlivě dodržován, mohou být pozorovány umělé píky. O hemoglobinu je všeobecně známo, že migruje společně s transferinem (frakce beta), pokud je ve vzorku moči. Doporučuje se pozorovat vlastnosti vzorku moči po první centrifugaci (např. známky přítomnosti červených krvinek a / nebo hemolýzy ve vzorku moči). V mnoha studiích bylo prokázáno, že reakce antigen - protilátka je odlišná v kapalné a agarózové fázi. Postupy imunotypizace kapilární elektroforézou se provádí zcela v kapalném médiu a některá antiséra mohou někdy křížově reagovat s monoklonálními složkami přítomnými ve vzorku. Neexistuje žádné riziko falešně negativních výsledků, jako je nezjištění přítomné gamapatie. Tato křížová reakce, ke které dochází jen vzácně, může vést k určení biklonální gamapatie místo skutečné monoklonální gamapatie. Z dostupné literatury vyplývá, že není žádný rozdíl v léčbě biklonální a monoklonální gamapatie (Kyle et al, 1981). Pokud je záznam neurčitý, je nutné provést další testování pomocí imunofixačních souprav HYDRAGEL BENCE JONES. Mohou být pozorovány jemné posuny mezi záznamem ELP a překrytými záznamy antisér (zvláště v zóně beta-1). Nesmějí se považovat za výsledek zmizení monoklonální frakce v jednom nebo více záznamech antisér. Vzhledem k limitům rozlišení a citlivosti zóny elektroforézy je možné, že některé monoklonální komponenty nemusí být tomto metodou detekovány. Jako u každé elektroforetické metody může být obtížné rozeznat malé monoklonální bílkoviny. Pokud jsou podezřelé malé monoklony, je nutné provést další testování imunofixační sadou SEBIA HYDRAGEL. Řešení problémů V případě, že se test nezdaří při dodržení pokynů k přípravě a skladování materiálů a pečlivém dodržování postupů, kontaktujte telefonicky technický servis SEBIA. Bezpečnostní datové listy soupravy činidel a informace o čištění a likvidaci odpadů, označování a bezpečnostní pravidla používaná společností SEBIA, obaly pro přepravu biologických vzorků a informace o čistění přístroje jsou k dispozici na webových stránkách SEBIA :

16 ÚDAJE O VÝkONU Studie shody Studie shody charakterizaci paraproteinů a volných lehkých řetězců byla provedena na 39 různých patologických vzorcích moči (s paraproteiny nebo volnými lehkými řetězci Kappa a Lambda) na 2 vzorcích s polyklonálními skvrnami a na 5 normálních vzorcích mezi postupem MINICAP IMMUNOTYPING URINE a komerčně dostupným systémem kapilární elektroforézy pro imunotypizaci (referenční postup). Všech 46 vzorků bylo analyzováno oběma metodami. Studie prokázala 100% shodu mezi oběma technikami. Pro 5 normálních vzorků moči: úplná shoda. Pro 2 vzorků moči s polyklonálními skvrnami: úplná shoda, Pro 39 patologických vzorků moči: úplná shoda. U všech analyzovaných patologických vzorků moči byly výsledky získané jednotlivými postupy ve shodě a identické proužky byly zjištěny u všech patologických vzorků v každém systému

17 BIBLIOGRAPHIE / BIBLIOGRAPHY 1. Cameron JS The nephrotic syndrome. Am. J. Kidney Dis, 10 : Chopin N Étude de la protéinurie. Inf. Tech. Biol., 1 : Clark R et al. Rapid capillary electrophoretic analysis of human serum proteins : qualitative comparison with high-throughput agarose gel electrophoresis. J. Chromatogr. A, 744, (1996). 4. Gay-Bellile C, Bengoufa D, Houze P, Le Carrer D, Benlakehal M, Bousquet B, Gourmel B, Le Bricon T. Automated multicapillary electrophoresis for analysis of human serum proteins. Clin. Chem., 49, (2003). 5. Henskens Y et al. Detection and identification of monoclonal gammopathies by capillary electrophoresis. Clin. Chem., 44, (1998). 6. Jellum E et al. Journal of Chromatography Biomedical Applications : Diagnostic applications of chromatography and capillary electrophoresis. J. Chromatogr. B, 689, (1997). 7. Jenkins MA and Guerin MD. Journal of Chromatography Biomedical Applications : Capillary electophoresis procedures for serum protein analysis : comparison with established techniques. J. Chromatogr. B, 699, (1997). 8. Joachim GR, Cameron JS, Chwartz M, Belker EL Selectivity of protein excretion in patients with the nephrotic syndrome. J. Clin. Invest., 43, Katzmann JA et al. Identification of monoclonal proteins in serum : A quantitative comparison of acetate, agarose gel, and capillary electrophoresis. Electrophoresis, 18, (1997). 10. Keren DF. Detection and characterization of monoclonal components in serum and urine. Clin. Chem., 44, 6, (1998). 11. Kyle RA, Robinson RA, Katzmann JA. The clinical aspects of biclonal gammopathies. Review of 57 cases. Am. J. Med., 71, 6, (1981). 12. Landers JP. Clinical Capillary Electrophoresis. Clin. Chem., 41, (1995). 13. Le Bricon T Identification et dosage des proteines urinaires au laboratoire d analyses. Ann. Biol. Clin., 60 : Le Carrer D Protéinuries : Mise au point sur leur exploration biologique en L Eurobiologiste, 190 : Le Carrer D, Nicolas A, Ducasse L L analyse des protéinuries au laboratoire de biologie en Revue française des laboratoires, 225 : Le Carrer D, Chopin N Profil protéique urinaire : Proposition d un protocole d exploration biologique des protéinuries. Revue française des laboratoires, 269 : Philipon C Protéines urinaires : Intérêt clinique et interprétation. Technique et Biologie, 6 : Oda RP et al. Capillary electrophoresis as a clinical tool for the analysis of protein in serum and other body fluids. Electrophoresis, 18, (1997). 19. Waller KV, Ward KM, Mahan JD, Wismatt DK Current concepts in proteinuria. Clin. Chem., 35 : Westermeier R., "Electrophoresis in Practice. A Guide to Theory and Practice", VCH Publishers, New York, NY, Wendling A. Procédures de diagnostic ou de dépistage : Justification et validité d un test de diagnostic ou de dépistage-sensibilité-spécificité. Impact-Internat, 1986 ; Sept :

18 PHOTO INSERTION DU SUPPORT SUR LE CARROUSEL - INSERTION OF THE RACk IN THE ROTATING SAMPLER