Studium přípravy a aplikačních možností nanočástic stříbra

Univerzita Palackého v Olomouci Přírodovědecká fakulta Studium přípravy a aplikačních možností nanočástic stříbra Habilitační práce RNDr. Libor Kvítek, CSc. Olomouc 2008

2

Poděkování Rád bych zde poděkoval všem členům Katedry fyzikální chemie Přírodovědecké fakulty Univerzity Palackého v Olomouci i kolegům z dalších pracovišť Univerzity Palackého za veškerou podporu, kterou mi projevovali po celou dobu mého působení na univerzitě. Jmenovitě pak bych rád poděkoval svým bývalým studentům a dnes již kolegům, Robertu Pruckovi, Aleši Panáčkovi a Janě Soukupové, bez jejichž pilné práce v laboratoři by nevznikl tak ohromný objem výsledků, které jsou prezentovány v této habilitační práci. A samozřejmě nemohu zapomenout na svou rodinu, obzvláště svou ženu Evu, bez jejíž trpělivosti, tolerance a opory bych se nemohl tak intenzivně věnovat své didaktické i odborné práci na univerzitě. 3

4

Obsah Seznam příloh... 7 1. Úvod... 9 2. Disperze nanočástic kovů... 10 2.1 Rozptyl světla elektricky vodivými částicemi... 10 2.2 Stabilita disperzí nanočástic kovů... 14 3. Základní metody přípravy nanočástic stříbra a jejich modifikace... 18 3.1 Dispergační metody... 18 3.1.1 Laserová ablace... 18 3.2 Kondenzační metody... 19 3.2.1 Chemická redukce... 19 3.2.2 Fotochemická redukce a radiolýza... 22 3.2.3 Redukce působením ultrazvuku... 23 3.3 Povrchová modifikace nanočástic stříbra a jejich stabilizace... 23 4. Základní aplikační oblasti nanočástic stříbra... 24 4.1 Antibakteriální aktivita nanočástic stříbra... 25 4.2 Povrchem zesílená Ramanova spektroskopie... 27 4.3 Další oblasti využití nanočástic stříbra... 30 4.3.1 Analytické aplikace a nanosenzory... 30 4.3.2 Využití nanočástic stříbra v elektronice a informačních technologiích... 31 4.3.3 Využití nanočástic stříbra v katalýze... 31 5. Použité experimentální postupy... 32 6. Výsledky a diskuze... 36 6.1 Příprava nanočástic stříbra v komplexujícím prostředí siřičitanu... 36 6.2 Příprava nanočástic stříbra v komplexujícím amoniakálním prostředí... 45 6.3 Modifikace nanočástic stříbra tenzidy a polymery... 53 6.4 Aplikace nanočástic stříbra v SERS... 58 6.5 Testy biologické aktivity nanočástic stříbra... 60 6.5.1 Antibakteriální aktivita nemodifikovaných nanočástic stříbra... 60 6.5.2 Antibakteriální aktivita modifikovaných nanočástic stříbra... 62 6.5.3 Testování environmentální toxicity nanočástic stříbra... 64 7. Závěr... 67 8. Citovaná literatura... 69 9. Přílohy... 79 5

6

Seznam příloh Příloha 1 Kvítek L., Prucek R., Pikal P., Novotný R.: Silver colloid particles preparation by using photographic development system. Acta Univ. Palacki. Olom., Chemica 38, 33-40 (1999) Příloha 2 Kvítek L., Prášková M., Pikal P., Prucek R., Novotný R.: Effect of cetyltrimethylammonium bromide on formation of colloidal silver particles. Acta Univ. Palacki. Olom., Chemica 40, 41-48 (2001) Příloha 3 Prucek R., Kvítek L., Hrbáč J.: Silver colloids - methods of preparation and utilization. Acta Univ. Palacki. Olom., Chemica 43, 59-67 (2004) Příloha 4 Kvítek L., Prucek R., Panáček A., Novotny R., Hrbac J., Zboril R.: The influence of complexing agent concentration on particle size in the process of SERS active silver colloid synthesis. J. Mat. Chem., 15, 1099-1105 (2005) Příloha 5 Kvítek L., Macháňová P., Nováková J., Panáček A., Soukupová J.: Influence of Halide Anion on Preparation of Silver Colloid Particles. Acta Univ. Palacki. Olom., Chemica 45, 35-44 (2006) Příloha 6 Panáček A., Kvítek L., Prucek R., Kolář M., Večeřová R., Pizúrová N., Sharma V. K., Nevěčná T., Zbořil R.: Silver Colloid Nanoparticles: Synthesis, Characterization, and Their Antibacterial Activity. J. Phys. Chem. B, 110, 16248-16253 (2006) Příloha 7 Kvítek L., Panáček A., Soukupová J., Kolář M., Večeřová R., Prucek R., Holecová M., Zbořil R.: Effect of Surfactants and Polymers on Stability and Antibacterial Activity of Silver Nanoparticles (NPs). J. Phys. Chem. C, přijato do tisku 2008 Příloha 8 Kvítek L., Vaníčková M., Panáček A., Soukupová J., Dittrich M., Valentová E., Milde D., Prucek R., Bancířová M., Zbořil, R. : Toxicity of Silver Nanoparticles against Unicellular Eukaryotic Organisms an Initiatory Study. Adv. Mater., odesláno do redakce. 7

8

1. Úvod Současné období intenzivního rozvoje v oblasti nanotechnologií dává nový život materiálům, které lidstvo neuvědoměle využívá již po staletí materiálům, které daly vzniknout významné oblasti fyzikální chemie koloidní chemii. V této oblasti hrály vždy důležitou roli i koloidy kovů, např. při barvení keramiky a skla [1], kde obzvláště významnou roli hrál koloid zlata. Michael Faraday výzkumem tohoto koloidu na počátku 2. poloviny 19. století zahájil éru koloidní chemie [2], jejíž rozvoj na počátku 20. století přinesl mimo jiné masové rozšíření fotografie [3], či naději v boji s mikroorganismy za pomoci koloidu stříbra [4]. Poslední čtvrtina 20. století přinesla mimo jiné i obnovení zájmu o koloidy kovů, jako příklad může sloužit objev stříbrným povrchem zesíleného Ramanova rozptylu (SERS) [5], který inicioval rychlý rozvoj nové, vysoce citlivé spektroskopické metody, umožňující studium i jediné molekuly naadsorbované na stříbrné nanočástici [6]. Nelze nezmínit ani obnovený zájem o baktericidní účinky stříbrného koloidu v době, kdy rostoucí rezistence bakterií vůči antibiotikům přináší závažný problém pro medicínskou praxi budoucnosti [7]. V předchozím odstavci často zmiňované stříbro patří svými vlastnostmi i oblastmi využití k nejstudovanějším kovům v koloidní chemii, obzvláště z hlediska současného i budoucího využití nejen v oblasti výzkumných metod, ale i v moderních mikro či nanotechnologiích [8]. Ve všech vyvíjených nanotechnologických aplikacích hraje významnou roli velikost, resp. velikostní distribuce používaných nanočástic, dále jejich morfologie, stabilita, stav povrchu z hlediska fyzikálního (např. elektrický náboj) i chemického (modifikace povrchu). Cílená příprava nanočástic stříbra požadovaných vlastností však zdaleka není vyřešeným úkolem současného materiálového výzkumu, čemuž odpovídá i rostoucí počet publikací na toto téma. Tato práce je z těchto důvodů zaměřena na výzkum v oblasti tzv. wet (na mokré cestě) přípravy nanočástic stříbra a rovněž výzkumu možnosti jejich využití zejména v oblasti boje proti patogenním mikroorganismům. 9

2. Disperze nanočástic kovů Disperze nanočástic kovů jsou obecně popsatelné za využití metod odvozených pro popis obecného chování koloidních soustav, tedy heterogenních soustav, v nichž je jedna fáze (disperzní fáze) velmi jemně (částice menší než cca 1 µm) rozptýlena v prostředí fáze druhé (disperzní prostředí). Existují sice případy, kdy klasická teorie popisu vlastností koloidních soustav může selhat tzv. quantum dots [9], tedy nanočástice polovodivých materiálů, kde kvantové efekty zastíní efekty spojené s vysokým podílem povrchu koloidních částic, ovšem nanočástice kovů se z tohoto hlediska chovají mimořádně vzorně a kvantové efekty ve většině případů neovlivňují popis jejich vlastností a chování využívající postupy klasické fyziky. Typický případ představuje absorpce a rozptyl světla kovovými nanočásticemi spojený s existencí povrchového plasmonu, jehož vznik a závislost na částicových parametrech velmi dobře vystihují klasické přístupy založené na Maxwellově řešení elektrodynamické teorie. Obdobně je za využití přístupů klasické fyziky řešitelný i problém agregátní stability disperzí kovových nanočástic, založený na popisu existence elektrické dvojvrstvy na povrchu nanočástice a popisu meziatomových přitažlivých sil na základě aproximace disperzních (resp. London - van der Waalsových) interakcí, které jsou základem dodnes nejúspěšnější teorie objasňující příčiny agregátní stability koloidních disperzí teorie DLVO. Těmto vybraným problémům tak bude věnována tato vstupní kapitola. 2.1 Rozptyl světla elektricky vodivými částicemi Pro koloidní soustavy je typický rozptyl světla, který byl jedním z prvních popsaných jevů v počátcích studia specifického chování soustav s jemně rozptýlenou fází v rámci kontinua fáze druhé koloidních soustav. Tento jev kvantitativně popsal již v roce 1871 Rayleigh na základě Maxwellem rozpracované elektrodynamické teorie. Platnost Rayleigho rovnice (1) je omezena na zředěné disperze dostatečně malých sférických částic o průměru d<λ/20, neabsorbujících světlo [10]: Θ I I 0 = 1 2 r 8 2 4 6 2 π R n 1 rel 2 4 2 λ 2 nrel + ( 1+ cos θ ) (1) kde I θ představuje intenzitu rozptýleného světa (o vlnové délce λ) měřenou v úhlu θ 10

vůči primárnímu paprsku o intenzitě I 0 ve vzdálenosti r od rozptylující částice poloměru R. Prostředí, ve kterém je částice umístěna, má pak relativní index lomu n rel. V případě, že koloidní částice nejen rozptylují světlo, ale rovněž současně jej absorbují, přestává klasická Raileygho teorie platit. Intenzita rozptýleného záření potom nevzrůstá monotónně s klesající vlnovou délkou dopadajícího záření, ale prochází maximem. Poloha tohoto maxima je závislá jednak na chemickém složení a velikosti částic, ale i na jejich morfologii a rovněž na jejich agregaci. Teorii popisující současný rozptyl i absorpci světla částicí sférického (či cylindrického) tvaru vypracoval Mie. Popis současné absorpce a rozptylu světla vyřešil Mie v roce 1908 definicí dvousložkového indexu lomu v podobě komplexního čísla ve tvaru (n-ik), kde pro neabsorbující materiál k = 0. Mieho rovnice (2) pak obsahuje dvě části, z nichž první popisuje reálnou část a druhá imaginární část indexu lomu [11]: I I 0 = exp 4π i x λ ( n 1) exp 4π k x λ (2) kde x představuje vrstvu materiálu, přes který prochází světelná vlna. Mieho teorie umožňuje v prvním přiblížení popsat absorpci a rozptyl světla i na kovových částicích, ovšem přesnost popisu chování tohoto typu částic není příliš vysoká. Hlavní důvod této nízké přesnosti Mieho teorie v případě kovových nanočástic spočívá v koherentní oscilaci elektronů, indukovanou interakcí s elmg. polem světelné vlny. Tyto oscilace produkují šíření vln tzv. povrchového plasmonu, který je na rozdíl od situace na rozhranní rovinného povrchu kov-dielektrikum lokalizován na povrchu nanočástice proto bývá často nazýván jako lokalizovaný povrchový plasmon. Vlnová délka, při níž je světlo absorbováno za vzniku plasmonových oscilací se označuje jako absorpční pás povrchového plasmonu. S klesající velikostí kovové částice roste energetický rozdíl mezi vodivostními pásy, který je v makroskopické fázi normálně menší než kt (energie tepelného pohybu). Se zmenšováním částice se začínají uplatňovat kvantová omezení a narůstá energetický rozdíl nad hranici kt, kdy kovový charakter nanočástice přechází na nevodivý. Ovšem rozdíl jednotlivých hladin povolených pro elektrony není tak velký, aby došlo tímto způsobem k ovlivnění optických vlastností nanočástic kvantově chemickými mechanismy. Proto je pro popis optických vlastností kovových nanočástic stále použitelný klasický Mieho model odvozený na základech Maxwellovy elektrodynamické teorie. V prvním přiblížení je nejčastěji používána dipólová aproximace založená na popisu oscilace vodivostních 11

elektronů (plasmonová oscilace) vyvolané elmg. polem světelné vlny, která následně produkuje oscilující dipóly ve směru pole, vyvolaného pohybem vodivostních elektronů k povrchu částice. Přesnější popis tohoto jevu vede k vyjádření extinkčního koeficientu k ex, který v sobě zahrnuje současně jak absorpci tak i rozptyl světla [12]: 3 2 18π NVε h ε 2 k ex = (3) λ 2 2 [ ε + 2ε ] + ε 1 h kde ε h zastupuje dielektrickou konstantu okolního prostředí částice a ε 1 a ε 2 představují reálnou a imaginární část dielektrické konstanty kovové částice (ε m = ε 1 + iε 2 ), závislé na úhlové frekvenci šířící se světelné vlny ω. Pokud je imaginární část dielektrické konstanty malá nebo jen slabě závislá na frekvenci záření ω, pak se absorpční maximum odpovídající resonanční podmínce objevuje za situace kdy ε 1 = -2ε h. Závislost resonance povrchového plasmonu na velikosti kovové nanočástice souvisí se závislostí dielektrické konstanty kovu na velikosti kovové nanočástice. U kovů, jako je zlato či stříbro, je příspěvek k dielektrické konstantě dán dvěmi částmi jedna pochází od vnitřních d elektronů, druhá pak od volných vodivostních elektronů. Tento druhý příspěvek popisuje Drudeho model [13], popsaný vztahem (4): ε D ( ω) 2 2 ω p 1 (4) ω + iγω = 2 kde ω p představuje frekvenci povrchového plasmonu makroskopické fáze kovu a γ tlumící konstantu. V makroskopické fázi kovu je hodnota této konstanty dána zejména vzájemnými srážkami elektronů a srážkami typu elektron-fonon, ovšem v malých částicích nabývá na důležitosti rozptyl na rozhraní fází (na povrchu nanočástice). V tomto případě je pak tlumící konstanta nepřímo úměrná velikosti částice, což se odráží v závislosti ε D (ω) na velikosti částice odtud pak plyne závislost ε 1 na velikosti a tím i resonanční podmínky pro vznik povrchového plasmonu. U větších částic (více než 25 až 30 nm) dochází k distorzi vyšších řádů prostorového rozložení náboje vodivostních elektronů (kvadrupólové či multipólové), což způsobuje významný posun resonance povrchového plasmonu s růstem nanočástice. Poloha a tvar absorpčního pásu povrchového plasmonu je rovněž ovlivněna dielektrickou konstantou okolí částice ε h, která je přímo součástí již zmíněné resonanční podmínky ε 1 = -2ε h. Růst hodnoty ε h vede k růstu intenzity a šířky absorpčního pásu povrchového plasmonu a současně způsobuje i jeho posun k vyšším vlnovým délkám (tzv. red shift ). 12

Obr. 1: Závislost extinkce na vlnové délce pro kulovité částice stříbra o rozměrech od 20 do 100 nm na základě výsledků teorie (a) Mieho, (b) DDA, (c) MLWA a srovnání výsledků těchto metod pro kulovité částice o velikosti 30 nm (d). Převzato z práce Jensen and al., J. Cluster Sci. [14]. Díky rozvoji elektrodynamických metod v posledním období lze v současné době charakterizovat optické vlastnosti nejenom koloidních částic se sférickou symetrií, ale kvantitativně vyhovující popis existuje již i pro jiné symetrie částic a dokonce i pro klastry sférických částic [15]. Pro tyto účely byla vyvinuta např. velmi jednoduchá aproximace MLWA (Modified Long-Wavelength Approximation) založená na klasické elektrostatické teorii doplněné o elektrodynamické korekce a vhodná pro přibližné výpočty chování klastrů částic. Složitější a samozřejmě i přesnější aproximace samostatných dipólů DDA (Discrete Dipole Aproximation), omezující složité výpočty modelů elektrického pole indukovaného v částici dopadající světelnou vlnou na interakce typu dipól-dipól, je naopak využitelná pro popis nanočástic nesférických tvarů, pro něž není použitelná klasická Mieho teorie [14]. Pomocí uvedených 13

aproximací lze vypočítat závislosti extinkce soustavy koloidních částic stříbra na vlnové délce dopadajícího záření. Tyto závislosti pro částice různých velikostí a tvarů umístěných ve vakuu jsou uvedeny na Obr. 1. Úspěchy teoretických přístupů k popisu interakce nanočástic stříbra s elmg. polem (světelným zářením) dokumentují výsledky získané na reálných disperzích těchto nanočástic, jak ukazuje následující Obr. 2, ozřejmující důležitý rys stříbrných nanočástic. Tyto UV/VIS spektra totiž dokumentují existenci absorpčního pásu lokalizovaného povrchového plasmonu pro nanočástice stříbra o velikostí 38 až 75 nm, kdežto u částic větších než 100 nm se tento absorpční pás již neobjevuje. Obrázek rovněž dokumentuje dříve zmíněný a teorií předpovězený red shift maxima plasmonové absorpce s rostoucí velikostí částic.[16] Obr. 2: Experimentálně změřené absorpční křivky částic stříbra o rozměrech 38 nm (A), 56 nm (B), 75 nm (C), 110 nm (D), 162 nm (E) a 173 nm (F). Převzato z práce Schneider et al., Photochem. Photobiol. 1994 [16]. 2.2 Stabilita disperzí nanočástic kovů Problém stability disperzí nanočástic kovů je plně popsatelný obecnými přístupy odvozenými v klasické koloidní chemii, přičemž odpovídající teorie je obecně známa pod zkratkou DLVO. Ta pochází z počátečních písmen jmen svých tvůrců, dvojice sovětských vědců B. V. Derjagina a L. Landaua a dvojice holandských vědců E. J. W Verweye a T. Th. G. Overbeeka, kteří nezávisle na sobě publikovali ve čtyřicátých létech 20. stol. práce, které položily základ kvantitativnímu popisu problému agregátní 14

stability koloidních disperzí. Základní myšlenka, na které je tato teorie založena, spočívá ve vzájemném soupeření přitažlivých a odpudivých sil mezi dvěmi přibližujícími se koloidními částicemi. Pokud převáží ty odpudivé, vyvolané především elektrostatickou repulzí, částice nevejdou do přímého kontaktu a nedojde k jejich spojení flokulaci. Pokud naopak převáží přitažlivé síly, vyvolané disperzními přitažlivými interakcemi (van der Waalsovy interakce), dojde k jejich dotyku a tvorbě aglomerátů (ne zcela pevně vázaných souborů částic) či dokonce agregátů (pevně propojených srostlých ) primárních koloidních částic. Energetické poměry při přibližování dvou nezávislých a identických koloidních částic názorně popisuje Obr. 3. Z něj je zřejmé, že se částice při vzájemném přibližování mohou dostat nejprve do stavu lokálního minima energie vzájemné interakce (tzv. sekundární minimum), kdy dochází Obr. 3: Graf závislosti energie interakce E dvou identických koloidních částic na jejich vzájemné vzdálenosti d podle DLVO teorie. ke vzniku nepříliš pevně spojených uskupení koloidních částic aglomerátů. Dalšímu přiblížení částic a jejich pevnému propojení (vytvoření agregátu) v rámci primárního energetického minima ovšem brání energetická bariéra daná převahou odpudivých sil ta je odpovědná za tzv. kinetickou stabilitu koloidní disperze. Kvantitativně toto vzájemné soupeření elektrostatických odpudivých interakcí a disperzních přitažlivých interakcí lze na základě představ teorie DLVO popsat ve zjednodušené formě pomocí výrazu pro interakční potenciál V T [17]: 2 [ 2 aε Dψ exp( κd )] a A121 V T π 0 0 (5) 12d kde v prvním členu, kvantifikujícím elst. interakce veličina a představuje poloměr koloidních částic, d jejich vzájemnou vzdálenost, ψ 0 jejich povrchový elst. potenciál a κ charakterizuje Debyeho tloušťku elektrické dvojvrstvy na povrchu koloidní částice. Druhý člen v rovnici (5) kvantifikuje velikost disperzních přitažlivých interakcí na základě Lifshitzova řešení vzájemných interakcí mezi přibližujícími se částicemi oddělenými disperzním prostředím za využití Hamakerovy konstanty A 121. Její hodnota odpovídá práci nutné na rozdělení fáze tvořící koloidní částice na dvě části v příslušném 15

disperzním prostředí charakterizovaném jeho permitivitou. Hodnoty Hamakerovy konstanty pro danou interakci se musí určovat experimentálně (např. nepřímo z měření smáčivosti materiálů či přímými měřeními za využití metody AFM). Vzhledem k charakteru jednotlivých typů látek lze obecně říci, že kovy mají vyšší hodnoty Hamakerovy konstanty (vyšší polarizabilita) a proto jsou jejich disperze obecně méně stabilnější než disperze koloidních částic nevodivých materiálů. Velikost elektrostatických odpudivých sil mezi koloidními částicemi je závislá na jejich povrchovém náboji, který ovšem není přístupný přímému měření. Proto je jeho hodnota nahrazována měřitelnou hodnotou tzv. elektrokinetického (zeta, ζ ) potenciálu (viz Obr. 4) [18]. Tento potenciál je odpovědný za existenci tzv. elektrokinetických jevů, tedy jevů souvisejících s interakcí elektrického pole s koloidní disperzí elektricky nabitých částic. Tyto elektrokinetické jevy, z nichž nejznámější je elektroforéza, umožňují měřit velikost interakce částice s elektrickým polem, např. z rychlosti pohybu částice v elektrickém poli při elektroforéze. Z tohoto důvodu i z důvodu komplikace související obecně s tvarem koloidních částic je obtížné kvantifikovat skutečnou hodnotu elektrostatické repulze mezi přibližujícími se částicemi. Proto jsou hledána aproximativní řešení, přičemž řešení tohoto problému prezentované v rovnici (5) představuje rozšířenou Derjaginovu aproximaci, založenou na náhradě interagujících sférických povrchů sérií paralelních povrchů s odstupňovanými vzdálenostmi, modelující zakřivení původního sférického povrchu [19]. Obr. 4: Schema struktury elektrické dvojvrstvy podle Sternova modelu s vyznačením hodnoty elektrokinetického (zeta) potenciálu. Kvantitativní výsledky teorie DLVO jsou při využití experimentálně určených hodnot Hamakerovy konstanty velmi přesné a teorie tak vysvětlila některá empirická pravidla popisující stabilitu koloidních soustav, jako např. Schulze-Hardyho pravidlo (publikované v roce 1900), které popisovalo závislost kritické koagulační koncentrace elektrolytu (CCC), vyvolávajícího flokulaci koloidní disperze, na šesté mocnině náboje 16

protiiontu z, pocházejícího z tohoto elektrolytu. Aplikace DLVO teorie na tento problém přinesla kvantitativní vyjádření tohoto pravidla ve formě vztahu [20]: CCC 3 5 ( ε r ε ) ( kt ) 4 5 0 10 Γ 6 6 2 0 z e A121 (6) kde veličina Γ o představuje Gouy-Chapmanův koeficient, který lze pro nízké hodnoty hustoty povrchového náboje vyčíslit na základě Poisson Boltzmanovy rovnice za získání jednoduchého vztahu pro vyjádření tohoto koeficientu ve tvaru Γ o = zeψ o /4kT. Mimo kvantitativní popis problému flokulačního chování koloidních disperzí přináší DLVO teorie náhled na problém stabilizace koloidních částic v disperzi a tedy i stabilizace nanočástic v disperzi. Protože dle této teorie hlavní odpovědnost za stabilitu nese elektrický náboj koloidních částic, proto zvyšování tohoto náboje vede ke zvyšování agregátní stability koloidních disperzí. Mechanismů, které jsou k dispozici pro zvyšování povrchového náboje je celá řada. Velmi důležitý faktor z hlediska povrchového náboje představuje např. ph disperze, protože to může ovlivňovat disociaci povrchových funkčních skupin a tím i náboj povrchu. Další možnost představuje využití specifické adsorpce iontů, která při vhodném výběru iontu může významně ovlivnit náboj povrchu tím i agregátní stabilitu koloidní částice. Vhodnou skupina látek pro toto zvyšování povrchového náboje na základě specifické adsorpce představují povrchově aktivní látky (tenzidy) ionického charakteru (např. anionický dodecyl sulfát sodný, či kationický cetyltrimethylamonium bromid). Při výběru vhodného tenzidu je ovšem třeba nejprve znát znaménko povrchového náboje (resp. zeta potenciálu), protože použití opačně nabitého povrchově aktivního iontu vede k neutralizaci tohoto náboje ještě efektivněji než je tomu v případě přídavku anorganických elektrolytů. Druhou možnou cestu stabilizace koloidních disperzí představuje zabránění těsnému přiblížení koloidních částic to je princip tzv. sterické stabilizace. Při této metodě přidáváme do disperze vhodné látky, které se specificky adsorbují na povrchu částice, kde vytvářejí povrchovou vrstvu (film), aniž ovlivňují povrchový náboj částice. Jako vhodné látky této skupiny jsou používány neionické tenzidy, rovněž tak jsou ale používány polymerní látky přírodního i syntetického charakteru, v případě nanočástic kovů nejlépe s vhodným heteroatomem (N, S), zabezpečujícím dostatečně pevnou vazbu mezi povrchem částice a polymerním řetězcem. 17

3. Základní metody přípravy nanočástic stříbra a jejich modifikace Při přípravě koloidů (disperzí nanočástic), lze použít buď kondenzační metody, kdy dochází ke spojování jednotlivých atomů či molekul v homogenních soustavách do větších agregátů, nebo dispergační metody, kdy naopak velké částice hrubě disperzních soustav jsou rozptylovány za tvorby menších částic. Dispergační metody nejsou při přípravě nanočástic kovů příliš používány, praktický význam mají pouze dispergace (rozprašování) v elektrickém oblouku a především tzv. laserová ablace. Kondenzační metody, které hrají při přípravě nanočástic kovů podstatně významnější roli, lze vzhledem k použitým principům rozdělit na dvě skupiny - metody fyzikální a chemické. V případě fyzikálních metod jsou převážně používány metody založené na kondenzaci par kovů, u chemických metod je k dispozici řada reakcí, které vedou k vytvoření nerozpustného produktu. U kovů je to především redukce jejich iontových sloučenin, kde lze kromě anorganických a organických redukčních činidel použít i radikály, generované v soustavě působením ultrazvuku, světla či radioaktivního záření. Rovněž elektrolytická redukce se zdá být do budoucna významnou metodou pro produkci velmi čistých nanočástic kovů definovaných vlastností [21, 22]. Široký přehled z oblasti wet metod přípravy monodisperzních koloidů kovů a především jejich sloučenin poskytuje referát Matijeviće [23]. 3.1 Dispergační metody 3.1.1 Laserová ablace Laserová ablace (desintegrace, rozmělňování) stříbrného makroskopického materiálu (např. fólie) je experimentálně jednoduchá, všestranná s ohledem na druh kovu či druh rozpouštědla a nezanechává v systému zbytková chemická činidla [24]. Laserem desintegrované kovové nanočástice jsou velmi čisté a proto je lze s výhodou využít k základním studiím v oblasti SERS, kde přítomnost iontů na povrchu koloidních částic významně ovlivňuje adsorpční procesy, stabilitu koloidních částic a reprodukovatelnost SERS měření [25, 26]. Velikost částic stříbra připravených pomocí laserové ablace se pohybuje v rozmezí od několika jednotek do několika desítek nm a závisí na vlnové délce a intenzitě použitého laseru, na délce ozařování a použitém rozpouštědle [27, 28] 18

a rovněž na přítomnosti dalších látek a iontů jako např. chloridů [26] či tenzidů [29] v roztoku. Ozařováním již připravené disperze nanočástic laserem lze měnit velikost a polydisperzitu těchto nanočástic [30] a dokonce i jejich morfologii [31]. 3.2 Kondenzační metody 3.2.1 Chemická redukce Při chemické redukci rozpustné sloučeniny stříbra vznikají atomy Ag, spojující se při jejich dostatečném přesycení v roztoku (tedy při dostatečné síle redukčního činidla) do zárodků nové pevné fáze, které po dosažení kritické velikosti mohou dále růst za vzniku stabilních nanočástic (či koloidních částic) stříbra. Z hlediska konečné velikosti těchto částic je obvykle rozhodujícím okamžikem počáteční fáze této heterogenní reakce, kdy vzniká hlavní frakce zárodků. Polydisperzita vznikajících částic je naopak ovlivněna dalšími reakčními stadii, kdy vedle růstu stávajících zárodků mohou vznikat i zárodky nové, které následně zvyšují polydisperzitu výsledné disperze částic. Díky rekrystalizaci částic pod vlivem tzv. Ostwaldova zrání pak dochází naopak k poklesu jejich polydisperzity [32]. Důležitou roli, zejména při použití silného redukčního činidla, hraje aglomerace velmi malých, primárně vzniklých částic za tvorby stabilních částic větších rozměrů [33, 34]. Současný intenzivní rozvoj tzv. "wet" (roztokových) metod přípravy koloidů stříbra souvisí s již zmíněným objevem SERS v 70. letech 20. stol., nejprve na "plane" (rovinných) površích stříbra (stříbrné elektrody), později pak i na koloidních částicích stříbra. Průkopníky v této oblasti se stali Creighton, Blatchford a Albrecht, kteří Ag částice připravovali redukcí AgNO 3 silným redukčním činidlem (NaBH 4 ) ve vodném prostředí [35]. Při rychlém smíchání 1 ml 1mM AgNO 3 se 3 ml ice-cold 2 mm Na[BH 4 ] za intenzivního míchání tak podle jejich postupu vzniká několik měsíců stabilní disperze stříbra s velmi malými částicemi (5-20 nm), čemuž odpovídá i poloha absorpčního maxima ( surface plasmon ) o hodnotě přibližně 400 nm. Variací poměru NaBH 4 /AgNO 3 lze u tohoto postupu částečně měnit vlastnosti vznikajících nanočástic Ag (hlavně velikost a povrchový náboj) [36, 37]. Stříbrné nanočástice připravené borohydridovou redukcí nejsou ovšem vždy vhodné pro následné aplikace, zejména díky borátovému aniontu adsorbovaném na jejich povrchu. To ukazuje případ SERS studia cytochromu P-450, který na borohydridovém solu podléhá denaturaci [38]. V takových případech se osvědčuje druhý z klasických redukčních postupů podle Lee a 19

Meisela, používajícím mírnější redukční činidlo - citrátový anion, který zároveň stabilizuje vznikající nanočástice stříbra [39]. V tomto případě se nanočástice stříbra připravují smíšením 10 ml 1% roztoku citrátu sodného s 500 ml 1mM AgNO 3. Po dokončení redukce hodinovým varem jsou připraveny nanočástice, které jsou výrazně větší a polydisperznější než u borohydridové redukce. Jejich velikost se pohybuje v rozmezí 30 až 120 nm, absorpční maximum pak leží okolo 420 nm a rovněž stabilita disperze těchto citrátových nanočástic je menší než v případě borohydridové redukce. Redispergací citrátového solu ozářením laserem lze snížit průměrnou velikost nanočástic na 5 10 nm a současně zvýšit jejich stabilitu [40]. NaBH 4 nebo citrát sodný nejsou jediné používané redukční látky při přípravě nanočástic stříbra. Využít lze rovněž redukčních účinků vodíku [39, 41], peroxidu vodíku [42], hydroxylaminu [43], hydrazinu [41, 44, 45], formaldehydu a jeho derivátů [45-47], kyseliny askorbové [41, 48, 49], EDTA [50, 51], hydrogenvinanu draselného [52] i jednoduchých cukrů [41, 45]. Z tohoto hlediska i z hlediska této práce jsou pak zajímavé výsledky dosažené při přípravě nanočástic stříbra metodou vycházející z historického Tollensova postupu přípravy stříbrného zrcátka tedy redukce amoniakálního komplexního kationtu [Ag(NH 3 ) 2 ] + redukujícími cukry, např. glukózou [53]. Dosažené výsledky při použití této metody nejlépe dokumentují snímky z elektronového mikroskopu (Obr. 5). Popsány byly i velmi netradiční postupy, využívající např. redukce AgI kovovým sodíkem v kapalném NH 3 [54] nebo biologická redukce Ag + účinkem mikroorganismů Fungus Verticillium [55] či fungus Fusarium oxysporum [56]. Obr. 5: TEM snímky nanočástic stříbra připravených Tollensovou metodou při různých teplotách (A) 27, (B) 30 and (C) 35 ºC. Průměrná velikost nanočástic stříbra je pak pro jednotlivé případy ~20, ~30 a ~40 nm. 20

Požadavku přípravy Ag nanočástic s řízenou velikostí se pravděpodobně zatím nejvíce přiblížila metoda tzv. seed particles. Tak jsou označovány velmi malé Ag nanočástice (cca 10-20 nm), připravené redukcí silným redukčním činidlem (NaBH 4 ). Ty následně slouží jako zárodky pro redukci dalších Ag + iontů slabším redukčním činidlem (citrátem, kys. askorbovou) za vzniku mnohem větších částic o rozměrech až stovky nm [16, 57-59]. Výsledné nanočástice stříbra pro jeden z uvedených procesů pak ukazuje Obr. 6 [16]. Možnost řízené přípravy v jediném reakčním kroku nabízí ovlivnění redukce Ag + iontu jeho vazbou do komplexního iontu [Ag(SO 3 ) 2 ] 2- či [Ag(NH 3 ) 2 ] +. Změnou koncentrace ligandu lze pak ovlivňovat velikost vznikajících částic Ag v rozmezí 150 až 900 nm pro siřičitanový systém [60, 61] resp. 25 až 400 nm pro amoniakální systém [62] Základní problém takto připravených koloidních částic stříbra o velikosti nad 100 nm tkví v jejich agregátní nestabilitě [63]. Obr. 6: TEM snímky různých forem nanočástic stříbra připravených dvoustupňovým redukčním procesem. (S) výchozí sol připravený redukcí stříbrné soli pomocí NaBH 4. (A)-(F) nanočástice připravené následnou redukcí stříbrné soli askorbovou kyselinou na primárních nanočásticích jako nukleačních centrech. Průměrné velikosti připravených nanočástic stříbra pro jednotlivé případy jsou (S) 23,5 nm, (A) 38 nm, (B) 56 nm, (C) 75 nm, (D) 110 nm, (E) 162 nm and (F) 173 nm. Na posledním obrázku jsou prezentována absorpční spektra těchto nanočástic, tak jak závisí na jejich průměrné velikosti. V mnoha aplikacích je požadována nejen nanočástic. Ovlivnění morfologie ovšem určitá velikost ale i morfologie Ag představuje ještě větší problém, než ovlivnění velikosti částic. Jako použitelný modifikátor růstu Ag nanočástic se osvědčil částečně anilin, podporující při redukci Ag + iontů hydrazinem tvorbu hexagonálních částic, jak ukazuje Obr. 7 stejném systému spíše tyčinkové částice [64]. Při redukci citrátem pak vznikají ve ( nanorods ), které vznikají i v případě 21

Obr. 7: TEM snímek nanočástic stříbra připravených redukcí Ag 2 SO 4 hydrazinem za přítomnosti anilinu. náhrady anilinu o-anisidinem [64]. Vznikající částice jsou ovšem ve všech případech silně heterodisperzní. Silver nanocubes byly připraveny při redukci AgNO 3 ethylenglykolem za přítomnosti polymerního stabilizátoru polyvinylpyrrolidonu (PVP) [65]. Změnu morfologie malých sférických nanočástic, připravených borohydridovou redukcí, na triangulární destičky a nanovlákna se podařilo iniciovat zahříváním jejich disperze pod refluxem opět v přítomnosti PVP a citrátu [66]. 3.2.2 Fotochemická redukce a radiolýza Při fotochemické redukci je obvykle v reakčním systému přítomen vedle stříbrných iontů a případných stabilizátorů navíc vhodný prekurzor radikálů, které jsou poté vlastním redukčním činidlem. Použitelný je např. aceton, který po excitaci UV zářením reaguje s 2-propanolem za vzniku ketylových radikálů, redukujících stříbrné ionty na kovové stříbro. Při stabilizaci polymery (polyethylenimin) nebo tenzidy (Triton X-100) lze získat velmi malé nanočástice s úzkou velikostní distribucí [67, 68]. Kromě acetonu může jako fotocitlivá látka sloužit acetofenon [69], benzofenon [70] či askorbová kyselina [71]. Z hlediska řízené syntézy nanočástic stříbra je zajímavé zjištění, že světlo může rovněž vyvolávat velikostní a tvarovou transformaci již vyredukovaných nanočástic [72]. Při radiolýze vzhledem k vysoké energii použitého záření lze přímo ozařovat vodný roztok stříbrné soli bez nutnosti přídavku dalších látek, protože při ozařování vysoce energetickým zářením dochází k tvorbě hydratovaných elektronů a atomárního vodíku schopných redukovat ionty stříbra. Současná tvorba OH radikálů, které částice stříbra reoxidují, celý redukční děj zpomaluje, přičemž výsledný pozvolný růst nanočástic poskytuje téměř monodisperzní soustavy s velmi malými částicemi [73]. Přesto lze i při radiolýze obdobě jako u fotolýzy využít vhodný prekurzor radikálů, např. 2-propanol [74, 75]. 22

3.2.3 Redukce působením ultrazvuku Ultrazvuk může být mimo své známé dispergační účinky využit i v kondenzačních metodách, protože jeho působením dochází k rozkladu vody za vzniku vodíkových a hydroxylových radikálů. Ty reakcí s vhodnými organickými molekulami poskytují další radikály, které jsou následně vlastními redukčními činidly pro stříbrné ionty přítomné v roztoku. Touto redukční metodou připravené stříbrné částice jsou obdobně jako u předchozích fotochemických metod velmi malé (okolo 10 nm) s poměrně úzkou velikostní distribucí [76]. 3.3 Povrchová modifikace nanočástic stříbra a jejich stabilizace Problém dlouhodobé stabilizace proti agregaci u nanočástic kovů, tedy i stříbra, má v praxi několik možností řešení. První z nich představuje imobilizaci částic na vhodném substrátu používány jsou polymerní substráty s vhodnými funkčními skupinami (kyano, amino resp. thiolové) [77, 78], ale i anorganické substráty jako silikagel [79, 80] či alumina [81], použít lze i obyčejné mikroskopické sklo [82], lépe je povrch skla vhodně modifikovat např. organosilany [51, 83]. Na skleněný substrát lze zakotvit i koloid předem modifikovaný vhodnou látkou, vytvářející následně s povrchem skla pevnou chemisorpční vazbu (tzv. Ag colloid adsorbate films), použity byly jak porphiny [84] tak i jiné heterocyklické sloučeniny [85]. Jako substrát pro aplikaci Ag nanočástic ve spektroskopii lze využít dokonce i filtrační papír [86]. Další jednoduchou metodu přípravy nanostrukturních tenkých vrstev pro spektroskopické aplikace (SERS) představuje zachycení částic stříbra na polykarbonátových membránách, na nichž lze současně provést i separaci částic podle velikosti [87]. Další možnost stabilizace nanočástic stříbra spočívá ve vytvoření ochranné adsorpční vrstvy přímo na povrchu stříbrné nanočástice. Z organických nízkomolekulárních látek lze použít již dříve zmíněný citrátový anion [88], ale také 2-merkaptobenzothiazol [89], merkaptooctovou kyselinu [90], nenasycené karboxylové kyseliny C 16 až C 20 [91], 4-methoxy benzoovou kyselinu [92], 3-aminopropyltrimethoxysilan [93, 94], S donorové ligandy jako xantháty, thiokarbamáty a trithiokarbonáty [95] či některé povrchově aktivní látky jako např. kationické polyelektrolyty [96]. Aplikačně zajímavou možnost, z hlediska přípravy nových materiálů s nelineárními optickými vlastnostmi, představují barviva, kdy při tvorbě adsorpčních vrstev dochází současně 23

k významným změnám spektrálního chování jak samotných nanočástic tak i adsorbovaných molekul barviva [97-99]. Povrch nanočástic lze modifikovat použitím i anorganických látek, zejména hydratovaného SiO 2, který je mimořádně odolný vůči koagulaci i při vysokých koncentracích vodných disperzí a navíc tvoří porézní vrstvu, umožňující interakci Ag nanočástic s okolím. Vytvoření ochranné vrstvy SiO 2 lze po aktivaci povrchu realizovat např. hydrolýzou křemičitanu sodného [100] nebo tetraethoxysilanu [101]. Při použití polymerních látek jako povrchových modifikátorů postačuje ke stabilizaci i velmi tenká povrchová vrstva, např. u kopolymeru polystyren/methakrylát postačuje vrstvička o tloušťce pouhých 2 nm, takže lze zachovat i původní optické vlastnosti nanočástic [102]. Nejpoužívanějším polymerním stabilizátorem je ale pravděpodobně PVP [41, 47, 52, 65, 66, 70, 103-105], velmi dobře se osvědčují i jeho kopolymery, např. kopolymer vinylalkohol-n-vinylpyrrolidon [41]. Při stabilizaci polymery lze jako redukční činidlo pro stříbrné ionty použít přímo radikály produkované iniciátorem polymerace, jako je tomu v případě použití polystyrenu [106] či poly(methylmethakrylátu) [107] jako povrchového modifikátoru. 4. Základní aplikační oblasti nanočástic stříbra Hlavní oblasti využití nanočástic stříbra, stejně jako jiných kovů, souvisí s jejich nelineárními optickými vlastnostmi [108, 109] a katalytickými schopnostmi, závislými výrazně na jejich velikosti [110]. Nelineární optické chování nanočástic kovů je dáno existencí již diskutovaného povrchového plasmonu [111-113], jehož existence úzce souvisí s povrchem zesíleným Ramanovým rozptylem (SERS) [114], povrchem zesílenou absorpcí v IR (SEIRA) [115] i povrchem zesílenou fluorescencí [116], efekty využitelnými zejména v oblasti značení biologických vzorků [117]. SERS samotná je tak pravděpodobně jedinou metodou sdružující možnosti stopové analýzy a současné identifikace chemické struktury analytu [118]. V současnosti se z aplikačního hlediska v případě nanočástic stříbra dostávají do popředí zájmu biologické účinky nanočástic stříbra, zejména jejich vysoká antibakteriální aktivita. V souvislosti s rostoucí rezistencí bakteriální kmenů vůči klasickým antibiotikům vzrůstá poptávka po nových typech antibiotik, kam lze zařadit i nanočástice stříbra. Jejich popularita v neodborné veřejnosti ovšem dnes poněkud 24

předběhla vědecký výzkum a tak přes dosud neujasněný mechanismus působení na živé organismy i nejasnosti okolo účinků nanočástic stříbra v životním prostředí i na člověka lze zakoupit poměrně široký sortiment výrobků modifikovaných nanočásticemi stříbra nejen ve formě léčivých (homeopatických) přípravků. ale i předmětů denní potřeby (textilie, zubní kartáčky atd.). 4.1 Antibakteriální aktivita nanočástic stříbra Ten vykazuje proti některým bakteriím (např. E. coli, S. aureus) srovnatelnou aktivitu s antibiotiky [119, 120], konkrétní aplikační možnosti ukázaly úspěšné testy s antibakteriální úpravou textilních materiálů [121]. Ne všechny výsledky v oblasti antimikrobiální aktivity nanočástic stříbra jsou však jednoznačné a i mechanismus tohoto jevu je dosud spíše v oblasti spekulací [122]. Antibakteriální aktivita stříbra je známa již z dob starých Egypťanů a jeho sloučeniny byly používány k léčbě infekcí ještě během prvé poloviny 20. stol. [123]. Objev antibiotik mezi světovými válkami znamenal rychlý ústup od používání sloučenin stříbra v humánní medicíně, pravděpodobně i díky jejich toxicitě, projevující se typickými příznaky změny barvy pokožky argyrie [124-128]. Ve většině sledovaných případů ukládání stříbra v těle nevyvolává zjevné zdravotní obtíže [124, 128, 129], i když se samotná argyrie začíná projevovat při poměrně vysokých jednorázových dávkách 4-6 g stříbra, resp. při dlouhodobě udržovaných koncentrací nad 300 ppb v krvi [130-134], přičemž jako normální hladina se uvádí 10 ppb [134]. V případě silných případů argyrie jsou degenerativně postiženy zejména vnitřní orgány jako játra, ledviny a srdce [128, 131], pozorována byla rovněž inhibice proliferace keratinocytů a fibroblastů [135, 136]. Ovšem mnoho prací publikovaných v posledním období 10 až 15 let ukazuje, že při běžných aplikacích (zejména ve formě povlaků na protetických náhradách), nedochází k závažným intoxikačním problémům, protože obzvláště kovová forma stříbra vykazuje na rozdíl od iontové poměrně nízkou cytotoxicitu a vysokou biokompatibilitu [137-143]. Za poměrně krátké období masového používání antibiotik k léčbě mikrobiálních infekcí došlo k výraznému nárůstu rezistence mnoha patogenních bakteriálních kmenů vůči této skupině léčiv [7] a tak se při hledání jejich nových, účinnějších alternativ objevuje na scéně opět stříbro [144], právě díky jeho nízké toxicitě při vysoké antibakteriální aktivitě [123, 125, 134, 145, 146]. Bakterie jsou velmi citlivé vůči iontovému stříbru, 25

k zastavení jejich růstu postačuje již koncentrace okolo 35 ppb [130]. Samotný antimikrobiální efekt je velmi pravděpodobně způsoben irreverzibilní vazbou iontů stříbra na membrány, enzymy a nukleové kyseliny [125, 134, 147, 148]. Tyto skutečnosti vedly v prvé fází k využití stříbra hlavně pro vytvoření baktericidních povrchů na lékařských nástrojích jako jsou kathetery [149-151]. Obdobně jsou stříbrné povlaky testovány jako prostředek pro snížení infekčních problémů při operativních náhradách srdečních chlopní či endoprotéz [133, 134, 152]. Například klinická studie na pokusech s králíky prokázala významné snížení pooperačních komplikací způsobených bakterií Staphylococus aureus při použití endoprotézy galvanicky pokryté stříbrem. I přes zvýšení obsahu stříbra ve vnitřních orgánech (játra, ledviny) nebyly v rámci provedené tříměsíční studie pozorovány na těchto orgánech viditelné degenerativní změny [153]. Obdobné výsledky u lidských pacientů prokázala nedávná studie stejného týmu, která prokázala nízkou koncentraci Ag v krvi pacientů okolo 56,4 ppb, neohrožující zdraví pacienta [154]. Do klinické praxe pronikají zejména obvazy impregnované sloučeninami stříbra (zejména se sulfadiazinem) [136, 155-157], či stříbrné kompozity jako dentální materiály [158] či speciální tmely pro ortopedické operace [159, 160]. V oblasti léčby těžkých popálenin dnes obvazové materiály ošetřené desinfekčními přípravky na bázi sloučenin stříbra, resp. jeho nanočástic představují velmi efektivní způsob léčby poranění bez komplikací způsobených infekcemi [161-164]. Ve srovnání s antibiotiky byla rezistence bakterií vůči iontovému stříbra prozatím pozorována jen v několika málo případech a tak zatím nepředstavuje významnou komplikaci z hlediska použitelnosti sloučenin stříbra jako antibakteriálního prostředku [161, 165, 166]. Navíc doposud nebyl vůbec pozorován výskyt rezistence bakterií vůči koloidnímu stříbru, resp. nanočásticím stříbra. To může souviset s odlišným mechanismem působení různých forem stříbra na bakterie, kdy se nemohou uplatnit buněčné detoxikační mechanismy, které si živé organismy vyvinuly proti iontům těžkých kovů [167-169]. Díky neexistující rezistence bakterií vůči destruktivním účinkům nanočástic stříbra, objevující se již při velmi nízkých koncentracích řádově v jednotkách ppm [170], zintenzivňuje se v posledních letech výzkum v oblasti syntézy nanočástic stříbra, vykazujících tuto vysokou antibakteriální aktivitu [170-177]. Publikované výsledky studia antibakteriální aktivity nanočástic stříbra ukazují mimo jiné na fakt, že antibakteriální aktivita je silně závislá na velikosti nanočástic a vzrůstá s poklesem jejich rozměru [170, 172, 173] a rovněž tak se ukazuje, že mimo rozměr 26

hraje významnou roli i morfologie nanočástic nejvyšší aktivitu vykazují nanočástice tvaru komolého trojbokého jehlanu [175]. Protože pro mnohé aplikace (např. biomedicínské či v oblasti přípravy syntetických materiálů) ne zcela vyhovují fyzikálně chemické parametry holých nanočástic stříbra, jsou s ohledem na udržení jejich vysoké antibakteriální aktivity v chemicky složitých prostředích testovány rovněž kompozitní materiály zejména s polymerními materiály PMMA [160] či hydrogelem PVA-PVP [178], v kompozitech se však mohou vyskytovat i další formy stříbrných nanočástic např. Ag 2 O v kompozitu s SiO 2 [158]. Rozmach studia antibakteriální aktivity nanočástic stříbra ovšem sleduje jejich ještě rychlejší rozšířené v praxi, kdy mnohé materiály obsahující nanočástice stříbra s cílem jejich antibakteriální úpravy lze nalézt přímo na pultech obchodů. Typický případ představují textilní materiály upravené nanočásticemi stříbra, které vykazují vysokou odolnost proti bakteriální kolonizaci a s ní spojenými doprovodnými jevy (zápach apod.) [121]. Rychlý přenos nanočástic stříbra do v oblasti nových antibakteriálních materiálů a dezinfekčních prostředků tak předbíhá výzkumnou praxi [161], což může mít za následek budoucí komplikace související zejména s dopadem zvýšené koncentrace tohoto kovu v životním prostředí obdobně, jako je tomu u jiných těžkých kovů [179, 180]. K obecné toxicitě těžkých kovů musíme navíc přidat potenciální nebezpečí nanočásticové formy kovu, jejíž šíření v přírodním prostředí je zatím jen těžko předpověditelné a tak se stává objektem studia nového oboru nanotoxikologie [181, 182]. 4.2 Povrchem zesílená Ramanova spektroskopie Fleischmannův objev SERS v roce 1974 na stříbrné elektrodě [5] či spíše jeho znovuobjevení na koloidech stříbra v roce 1977 Creightonem [183] znamenal vznik nové výzkumné a analytické metody, umožňující strukturní studium a rovněž velmi citlivou detekci molekul a iontů při koncentracích řádu až piko či dokonce femtomolů na litr. Povrchové zesílení Ramanova signálu při adsorpci molekuly na koloidní částici či nerovném (drsném) povrchu kovu je dáno dvěma příspěvky elektromagnetickým a chemickým. Elektromagnetický mechanismus, odpovědný za většinu případů povrchového zesílení, je spojen s existencí již zmíněného povrchového plasmonu [184-188], kdy je v těsném okolí kovové nanočástice vybuzeno elektrické pole o intenzitě o několik řádu vyšší než bylo původní elmg. pole budícího záření (viz Obr. 8). 27

Obr. 8: Znázornění zesílení elektromagnetického pole v těsné blízkosti nanočástic stříbra o různých tvarech a velikostech ozářené světlem o vlnové délce uvedené v pravém dolním rohu obrázku (a) sférická částice o rozměru 19 nm; (b) nanodisk o průměru 40 nm a tloušťce 9 nm; (c) a (d) triangulární nanoprisma o průměru 60 nm a tloušťce 12 nm. Převzato z práce Hao et al., J. Fluorescence 2004. Chemický mechanismus, přinášející ve specifických případech dodatečné zesílení asi dvou až tří řádů, je spojen s přenosem náboje mezi adsorbovanou molekulou a kovovým povrchem (i hladkým) a lze jej pozorovat i v klasické Ramanově spektroskopii jako tzv. rezonanční zesílení optická resonance energetických hladin mezi orbitaly adsorbované molekuly a elektrony v kovu mohou vyústit v resonanční přenos náboje, který je příčinou dodatečného tzv. resonančního či charge transfer zesílení Ramanova jevu. Mnozí autoři proto případ uplatnění obou mechanismů zesílení současně označují jako surface enhanced resonance Raman spectroscopy (SERRS) [189-191]. SERS resp. SERRS lze ve výzkumné praxi použít ke studiu adsorpce jak jednoduchých organických molekul adsorbovaných na povrchu nanočástic Ag, jako např. 1,10-fenanthrolinu [192], p-nitrothiofenolu [193], 1,4-dihydrazinofthalazinu [194], mastných kyselin [195], thyminu a jeho derivátů včetně AZT (viz Obr. 9) [196] či 28

Obr. 9: FT-Ramanova spektra AZT v (a) pevném stavu; (b) vodném roztoku (0.01 M) a (c) SERS AZT (10-5 M, ph 6.0). nukleových bází a jejich derivátů včetně mononukleotidů [197-199]. Metoda je použitelná i pro studium složitějších biomolekul, např. ovalbuminu [200], cytochromu c, polypeptidů a proteinů [36, 201], ale i pro kinetická studia na těchto molekulách (např. interakce kyslíku s hemoglobinem [202]). Přes potíže s reprodukovatelností signálu, související s přípravou a nutnou aktivací Ag solu [203, 204], se SERS díky své specifičnosti, vysoké citlivosti a materiálové i časové nenáročnosti dostává do oblasti zájmu praktické analýzy. Lze ji využít jako čistě detekční metodu např. v oblasti sekvenční analýzy DNA [205, 206] či kapilární elektroforéze [207], ale i pro kvantitativní stanovení pikomolárních množství průmyslově i biologicky významných sloučenin, např. indiga [208], metalloporfyrinů [209], léčiv [210]. Popsáno bylo její použití i v případě složitějších stanovení přímo v medicínské praxi, jako xanthopterinu u pacientů s některými typy rakoviny [211] či při diagnostice rozsahu poškození mozku u pacientů s poraněním hlavy za pomoci stanovení EAAs ( excitatory amino acids ), uvolňujících se z poškozených neuronů [212]. Zajímavou oblastí možného využití SERS představují metody detekce bakterií a plísní [213]. Vysoké zesílení SERS resp. SERRS se stalo spolu s metodami fluorescenční spektroskopie základem tzv. single molecule spectroscopy [214]. Možnosti tohoto nového oboru naznačila SERRS studie roztoku rhodaminu G6 o koncentraci 8x10-16 mol dm -3 [215, 216] či krystalové violeti o obdobně nízké koncentraci [217]. Jiné studie ukázaly, že maximální povrchové zesílení řádu 10 14 až 10 15 dosahují jen částice určité velikosti, nazvané hot particles [6]. Optimální rozměr těchto částic je navíc podle stejných autorů závislý na vlnové délce laseru použitého k excitaci, přibližně v rozmezí 200 nm až 70 nm pro vlnové délky 488 až 647 nm [87, 218-220]. Významnější roli v tak velkém zesílení hraje ale pravděpodobně spíše agregace jednotlivých Ag nanočástic [221]. Single molecule detection byla realizována i s biologicky významnými molekulami jako je adenin [222], Fe-protoporphyrin IX 29

[223], hemoglobin [224] či křenové peroxidázy [225]. Detekovat lze takto i buněčné proteiny přímo v jediné buňce [226]. Mikroskopické uspořádání experimentu umožňuje snížit excitační intenzity a zatěžovat tak méně studovanou molekulu [227]. Využití technologie AFM iniciovalo vznik nové metody nazvané Tip Enhanced Raman Spectroscopy (TERS) [228], s jejíž pomocí lze provést oddělené studium elmg. příspěvku povrchového zesílení (tip) a chemického (substrát), na kterém je adsorbována studovaná molekula) [229]. Zmiňované vysoké zesílení dosažené v SERS úzce souvisí s problémem aktivace Ag nanočástic, spočívající pravděpodobně v jejich částečné agregaci [219, 230]. Mezi běžně používaná aktivační činidla patří halogenidy (mimo fluorid) či některé anionty oxokyselin halogenů [197, 199, 225, 231-233]. V některých případech studia biologicky významných molekul se jako aktivátor osvědčují i organické molekuly, např. poly(llysin) nebo spermin [206, 234, 235]. 4.3 Další oblasti využití nanočástic stříbra 4.3.1 Analytické aplikace a nanosenzory Na předchozí podkapitolu zabývající se využitím nelineárních optických vlastností nanočástic stříbra v oblasti SERS úzce navazuje tato část, věnovaná analytickým aplikacím nanočástic stříbra v podobě nanosenzorů. Analytické aplikace nanočástic stříbra mohou být mimo přímé využití SERS založeny rovněž na vysoké hodnotě absorpčního koeficientu v maximu povrchového plasmonu, jako je tomu u metody stanovení kyseliny askorbové, jejíž redukční účinky jsou využity ke generaci nanočástic stříbra a jejich následné vysoce citlivé detekci [236]. Vysokou citlivost rovněž poskytuje závislost polohy absorpčního maxima povrchového plasmonu na dielektrických vlastnostech okolního prostředí (adsorpční vrstvy) a případně i na náboji stříbrných nanočástic [237, 238]. Těchto principů bylo využito při konstrukci nanobiosenzoru pro stanovení streptavidinu [239] nebo nanobiosensoru pro immunoassay metodu stanovení antibiotinu [240]. Další možnosti vývoje nových biosenzorů a analytických metod využitelných přímo v mikrobiologii rovněž nabízí modifikace nanočástic barvivy citlivě detekovatelnými metodou SERS [241, 242] či několikanásobné zesílení fluorescence (metal-enhanced fluorescence) barviv samotných 30

[243-245]. Obdobný jev je využitelný analyticky i u fluorescenčně značených molekul, např. inzulinu [246], proteinů [247] či DNA oligomerů [248]. 4.3.2 Využití nanočástic stříbra v elektronice a informačních technologiích Rozměry stříbrných nanočástic i jejich již zmíněné unikátní optické a elektrické vlastnosti je rovněž předurčují pro aplikace v mikro a nanoaplikacích v elektronice. Stříbrné nanočástice lze přímo využít pro realizaci 3D mikroelektromechanických systémů a elektrických obvodů jednoduchou metodou inkoustového tisku [249, 250]. Další možnosti nabízí syntéza stříbrných nanodrátků pokrytých izolační vrstvou SiO 2 [251], které jsou rovněž vhodné pro konstrukci mikroelektronických obvodů. Optické vlastnosti nanočástic stříbra lze využít pro konstrukci nových materiálů pro ukládání dat na optické bázi [252] či vývoji barevné holografie [253]. 4.3.3 Využití nanočástic stříbra v katalýze Velký povrch a vysoká povrchová energie předurčují nanočástice kovů a tedy i stříbra pro použití v oblasti katalýzy. Nanočástice stříbra jsou vhodnými katalyzátory jak pro oxidaci organických látek, např. ethylenu na ethylenoxid [254, 255], ale ukazují se i možnosti jejich využití při redukční degradaci fenolů [256]. Katalytickou aktivitu nanočástic stříbra lze regulovat pomocí jejich velikosti, neboť na rozměru nanočástic závisí i jejich redox potenciál, jak prokázaly výzkumy provedené při kinetických studií redukce organických barviv [257, 258]. 31

5. Použité experimentální postupy Použité chemikálie. V této práci publikované výsledky představují přehled nejdůležitějších poznatků získaných za období téměř 10 let vědecké práce v oblasti zaměřené na přípravu a praktického použití nanočástic stříbra. Z tohoto důvodu je tento seznam použitých chemických látek omezen jen na nejdůležitější a do jisté míry specifické látky, použité při uvedených činnostech zejména jako redukční činidla resp. jako modifikátory připravených nanočástic stříbra. V úloze redukční látky byly použity tři skupiny chemických sloučenin, lišící se zejména svou redukční silou: a) redukující cukry nejslabší redukční činidla použitá v této práci z nich byli vybráni nejběžnější zástupci: z monosacharidů glukóza a fruktóza, z disacharidů maltóza a laktóza. b) organické látky ze skupiny fotografických vyvolávacích látek skupina středně silných redukčních činidel typu hydrochinonu (HQ) a 1,4-fenylendiaminu (PPD) a jejich derivátů, jako další pak látka nesoucí hydroxy i aminoskupinu na benzenovém jádře - N-methyl-1,4-aminofenol (známý pod obchodním názvem Metol). c) jednoduché anorganické a organické sloučeniny mající charakter nejsilnějších redukčních činidel z nich nejsilnější tetrahydridoboritan sodný (NaBH 4 ), dále hydrazin (N 2 H 4 ) a formaldehyd (HCHO). V úloze modifikátorů připravených nanočástic stříbra pak byly použity povrchově aktivní látky (PAL), jinak též tenzidy a rovněž polymerní, ve vodě rozpustné látky: a) ze skupiny PAL byl použit dodecyl sulfonát sodný (SDS, anionický tenzid) a dále Tween80 (oxyethylenát acylsorbitanu, neionický tenzid). b) ze skupiny polymerních látek to byl polyethylenglykol (PEG) o různé průměrné molekulové hmotnosti udané přímo číslem společně se zkratkou názvu polymeru (např. PEG 10000) a dále polyvinylpyrrolidon (PVP) opět s různými hodnotami průměrné relativní molekulové hmotnosti, která se ale v tomto případě udává jako násobek tisíce (např. PVP360 představuje polymer o průměrné relativní molekulové hmotnosti 360.000). Příprava nanočástic. V rámci studia přípravy a možností praktických aplikací nanočástic stříbra byla vyvinuta originální metoda přípravy nanočástic stříbra. Ta je založena na redukci roztoku stříbrné soli v komplexujícím prostředí, umožňujícím řídit 32

průběh redukce a tím i parametry vznikajících nanočástic jak výběrem redukčního činidla, tak i výběrem vhodného ligandu a jeho koncentrace v reakčním systému. V realizovaných experimentech byla studována redukce stříbrné soli v prostředí siřičitanového aniontu resp. v amoniakálním prostředí. Protože stabilita komplexního aniontu [Ag(SO 3 ) 2 ] 3- je vysoká (pk dis = 8,68), je nutno při jeho redukci na atomární Ag použít silné redukční činidlo. V provedených studiích v tomto komplexujícím prostředí byly použity jako nejslabší redukční látky organické sloučeniny typu hydrochinonu a 1,4-fenylendiaminu, známé jako fotografické vyvolávací látky a dále pak silnější redukční činidla jako formaldehyd, hydrazin a tetrahydridoboritan sodný. V amoniakálním prostředí, kde vzniká o něco méně stabilní komplexní kation [Ag(NH 3 ) 2 ] + (pk dis = 7,03) lze využít pro jeho redukci i tak slabá redukční činidla jako jsou redukující cukry. Protože redox potenciál většiny použitých redukčních činidel závisí na ph (redukce probíhá v alkalické oblasti, obvykle při ph vyšším než 10), byla úpravou jeho hodnoty řízena rychlost celé reakce (z důvodu dosažení reakční doby kratší než 5 min). Jako hlavní řídící parametr z hlediska přípravy stříbrných nanočástic byl zvolen výběr komplexotvorného činidla a jeho koncentrace, která se v realizovaných experimentech pohybovala v rozmezí koncentrací 0,005 až 0,2 mol dm -3. Výsledná velikost vznikajících nanočástic stříbra se dá rovněž do jisté míry ovlivnit počáteční koncentrací stříbrné soli v roztoku. Protože tato koncentrace ale rovněž významně určuje celkovou reakční rychlost, byla standardně používána koncentrace 2,5 10-4 mol dm -3 pro systém se siřičitanem jako komplexotvorným činidlem a 10-3 mol dm -3 pro případ amoniaku jako komplexotvorného činidla v reakčním systému. Z důvodu zjednodušení kinetických studií byla koncentrace redukčního činidla udržována ve vysokém přebytku oproti koncentraci stříbrné soli, v siřičitanovém systému to byla koncentrace 2 10-3 mol dm -3 a v amoniakálním systému 10-2 mol dm -3. V případě realizace povrchové modifikace nanočástic stříbra za účelem modifikace jejich povrchového náboje resp. zvýšení jejich agregační stability byly do systému přidávány vybrané ionické i neionické tenzidy (SDS, Tween) a rovněž vybrané polymerní látky (PEG, PVP), využívané běžně v praxi za účelem stabilizace koloidních disperzí. Studium přípravy nanočástic stříbra redukcí komplexní sloučeniny stříbra vybraným redukčním činidlem probíhalo v upraveném titračním nástavci ze spektrofotometru Specol v kyvetě o objemu 30 ml za míchání elmg. míchadlem. Reakce probíhala za laboratorní teploty bez temperování, tedy při teplotě 23±2 ºC. Její průběh byl sledován 33

na základě rostoucí turbidity vznikající disperze nanočástic stříbra za pomoci jednoduchého kolorimetrického uspořádání, využívajícího jako detektor fotočlánek příslušného titračního nástavce a jako zdroj světla vysoce svítivou LED diodu emitující záření o vlnové délce 660 nm a intenzitě 1500 mcd. Charakterizace nanočástic. Měření velikosti vznikajících nanočástic stříbra ve vodné disperzi včetně jejich polydisperzity bylo prováděno na přístroji Zetasizer Zeta Plus (fy Brookhaven), využívající metodu dynamického rozptylu světla (DLS). Veškeré hodnoty průměrné velikosti částic a s ní spojené doplňující údaje jsou tak v této práci primárně uváděny jako výsledky tohoto měření. V některých případech jsou uváděny výsledky průměrných velikostí částic získaných manuálně z TEM snímků, v těchto místech je vždy přímo uvedeno, že se jedná o hodnotu získanou tímto způsobem. Přístroj Zeta Plus byl rovněž použit pro měření zeta potenciálu připravených nanočástic stříbra. V tomto případě je měřená veličina vyhodnocována na základě měření elektroforetické pohyblivosti stříbrných nanočástic, určené opět prostřednictvím DLS. Kontrolní měření velikosti částic bylo prováděno za využití snímků z transmisní elektronové mikroskopie (TEM), pořízených jak za pomoci el. mikroskopu Opton Zeiss, tak mikroskopu Philips CM12 a nejnověji el. mikroskopu Jeol JEM 2010. Část vzorků byla podrobena mikroskopické analýze za pomoci mikroskopie atomárních sil (AFM), realizované na mikroskopu Explorer fy. Thermomicroscopes. Další verifikace nanočásticového charakteru připravených nanočástic stříbra byla prováděna metodou UV/VIS spektroskopie na spektrofotometrech Helios α (Thermo Unicam) a Specol S600 (Analytic Jena AG). Tato metoda byla využita rovněž při sledování rychlosti agregace disperzí nanočástic stříbra v případě provádění stabilizačních studií na základě modifikace nanočástic stříbra tenzidy a polymery. Kontrolní stanovení obsahu stříbra ve vzorcích připravených disperzí pak bylo realizováno metodou AAS na přístroji Avanta Σ, fy GBC. Antibakteriální aktivita. Antibakteriální aktivita modifikovaných a nemodifikovaných nanočástic stříbra byla testována za využití standardní mikrodiluční metody, jejíž pomocí se určuje tzv. minimální inhibiční koncentrace (MIC) antibakteriální látky. Testování bylo prováděno na mikrotitračních destičkách postupem, kdy byla testovaná disperze nanočástic stříbra naředěna v rámci geometrické řady 2x až 128x přídavkem 100 µl Mueller-Hintonova kultivačního média inokulovaného testovaným bakteriálním kmenem o koncentraci 10 5 to 10 6 CFU ml -1. Hodnota MIC byla odečítána po 24 hod inkubace při 37 C jako minimální koncentrace 34

testované látky, která inhibovala růst bakterií v testu. Stejným způsobem bylo vždy provedeno kontrolní testování obdobně koncentrovaného vzorku iontového stříbra a v případě, že byly použity, byly testovány i samotné roztoky modifikátorů. Ve vybraných případech byla tato stanovení doplněna stanovením minimální baktericidní koncentrace (MBC), což je minimální koncentrace látky, která ničí bakterie přítomné ve vzorku. Jako standardy byly použity dále uvedené bakteriální kmeny ze sbírky MU Brno (Czech Collection of Microorganisms, Czech Republic): Staphylococcus aureus CCM 3953, Enterococcus faecalis CCM 4224, Escherichia coli CCM 3954 a Pseudomonas aeruginosa CCM 3955. Dále byly k testování použity i bakteriální kmeny izolované z klinického materiálu Fakultní nemocnice Olomouc: Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus epidermidis, methicillin-resistentní Staphylococcus epidermidis, methicillin-resistentní Staphylococcus aureus (MRSA), vancomycinresistentní Enterococcus faecium (VRE) a ESBL-positivní Klebsiella pneumoniae. Testování antibakteriální aktivity bylo prováděno na specializovaném pracovišti Ústavu mikrobiologie Lékařské fakulty Univerzity Palackého v Olomouci pod vedením Prof. M. Koláře. Testování environmentální toxicity. V rámci primárního testování biologické aktivity připravených nanočástic stříbra bylo mimo testování antibakteriální aktivity provedeno i testování environmentální toxicity těchto nanočástic na běžně k tomuto účelu užívaném mikroorganismu Paramecium caudatum (Trepka velká). K testování byla použita laboratorní kultura mikroorganismu získaná z MU Brno. Vlastní toxicita nanočástic stříbra byla určována na základě stanovení hodnoty LT 50, tedy doby, za kterou při dané koncentraci nanočástic stříbra zahyne právě polovina studovaného mikroorganismu. Ke kultuře mikroorganismu Paramecium caudatum (koncentrace 200-300 jedinců na 1 ml) v množství 1 až 5 ml v testovací zkumavce bylo přidáno adekvátní množství koncentrované disperze nanočástic stříbra (o koncentraci 200 mg Ag/l). Po promíchání obsahu zkumavky bylo 200 µl vzorku přeneseno na mikroskopické podložní sklíčko opatřené mřížkou o velikosti 1 x 1 cm a mikroorganismy byly sledovány v optickém mikroskopu při 40x zvětšení. 35

6. Výsledky a diskuze 6.1 Příprava nanočástic stříbra v komplexujícím prostředí siřičitanu V případě použití siřičitanového aniontu jako komplexotvorného prostředí pro stříbrný kation bylo s většinou použitých redukčních látek dosaženo velikostí odpovídajících obecně koloidním částicím stříbra, spíše než nanočásticím. Velikost částic klesala pod sto nanometrů pouze při použití těch nejsilnějších redukčních činidel, jako je tetrahydridoboritan sodný, hydrazin či formaldehyd. Při všech experimentech přitom byl vzhledem k požadované podmínce udržení prakticky konstantní reakční rychlosti měněno ph v rozmezí hodnot 9,5 až 12,5 Britton-Robinsonovým pufrem tak, aby reakční čas pro celkovou redukci přítomných stříbrných iontů nebyl delší než 300 s. Koloidní částice stříbra vznikající redukcí komplexní sloučeniny [Ag(SO 3 ) 2 ] 3- v systému, kde jako redukční činidlo jsou použity látky typu hydrochinonu (HQ) či p-fenylendiaminu (PPD), jsou převážně sférické, při větších rozměrech (nad 300 až 400 nm) se však objevují i hexagonální částice. Při koncentracích siřičitanu v systému pod 0,05 mol dm -3 je povrch připravených stříbrných částic výrazně nepravidelný (viz Obr. 10). Velikost vznikajících částic byla při všech experimentech silně ovlivněna koncentrací Na 2 SO 3 v reakčním systému, pro uvedené typy redukčních látek se tyto velikosti pohybují v rozmezí 180 až 760 nm (viz Tab.1). Získané hydrosoly stříbra jsou poměrně málo stabilní a během minut až hodin od přípravy agregují. Povrchový náboj částic je ovlivněn pravděpodobně adsorpcí siřičitanového aniontu, o čemž svědčí záporná hodnota jejich zeta potenciálu. Ta se pohybovala od hodnoty -50 mv pro nejvyšší koncentraci siřičitanu až po 15 mv pro nejnižší použitou koncentraci siřičitanu v reakčním systému pro všechny zde použité redukční látky. Tab. 1: Vztah mezi velikostí vyredukovaných částic stříbra (d) a koncentrací Na 2 SO 3 v reakčním systému při redukci komplexní sloučeniny [Ag(SO 3 ) 2 ] 3- vybranými organickými redukčními látkami. c(na 2 SO 3 ) HQ 1 PPD 2 Metol 3 [mol.dm -3 ] d [nm] h.w. [nm] d [nm] h.w. [nm] d [nm] h.w. [nm] 0,2 450 110 760 210 680 140 0,1 340 85 320 95 405 105 0,05 235 90 210 85 220 75 0,02 205 80 200 80 200 70 0,01 1950 85 205 75 200 60 0,005 210 85 190 85 195 60 1 HQ = hydrochinon 2 PPD = 1,4-fenylendiamin 3 Metol = N-methyl-1,4-aminofenol 36

Obr. 10: TEM snímky částic stříbra připravených redukcí komplexního aniontu [Ag(SO 3 ) 2 ] 3- Metolem. Koncentrace siřičitanu byla nastavena pro jednotlivé případy na hodnoty a) 0,2; b) 0,1; c) 0,05; d) 0,02; e) 0,01 a f) 0,005 mol dm -3. ph reakčního systému bylo udržováno v rozsahu 9 to 12.5 pro udržení reakční doby okolo 150 s. Získané výsledné velikosti připravených koloidních částic stříbra ukazují na výrazný vliv koncentrace komplexotvorného činidla, který souvisí se změnou redox potenciálu stříbrné elektrody. Tu lze pro iontovou sílu 0,5 mol dm -3 a 25º vyjádřit vztahem [259]: E (AgL/Ag) = 0,301 0,0525. ln c L + 0,0234. ln c AgL (7) Další proměnnou do celého reakčního systému přináší samotná redukční látka, jejíž síla klesá v pořadí HQ > Metol > PPD (viz Tab. 2). Tab. 2: Srovnání standardních redox potenciálů hydrochinonu, metolu a p-fenylendiaminu. Redukční látka E 0 [ V ] hydrochinon (HQ) 0,700 N-methyl-1,4-aminofenol (Metol) 0,747 1,4-fenylendiamin (PPD) 0,846 Při vyjádření změny redox potenciálu stříbrné elektrody pro použité koncentrace siřičitanu v reakčním systému pak vychází téměř dvojnásobná změna hodnoty této veličiny, významně ovlivňující průběh celého redukčního děje (viz Tab. 3), jak je patrné z kinetických křivek zaznamenaných při vlastní reakci (viz Obr. 11) Nutno ovšem uvážit, že samotný rozdíl redox potenciálů použitých redukčních systémů nehraje 37

jedinou rozhodující roli z hlediska řízení velikosti připravených částic stříbra. To souvisí s faktem, že redox potenciál použitých redukčních látek závisí na ph, které bylo při vlastních experimentech měněno v rozsahu 3 jednotek a tak ovlivnilo jak redox potenciál redukční látky, tak i celkový rozdíl redox potenciálů obou zúčastněných redox systémů. Obr. 11: Kinetické křivky průběhu redukce Ag + v prostředí siřičitanového aniontu za použití redukční látky HQ pro koncentraci Na 2 SO 3 v systému a) 0.2, b) 0.1, c) 0.05, d) 0.02, e) 0.01 a f) 0.005 mol.dm -3. Tab. 3: Srovnání redox potenciálu stříbrné elektrody pro různé koncentrace siřičitanu Hodnoty redox potenciálů byly spočteny pomocí rovnice 20. v systému. c ( Na 2 SO 3 ) [ mol.dm 3 ] Redox Ag elektrody [ V ] 0,2 0,191 0,1 0,228 0,05 0,264 0,02 0,312 0,01 0,349 0,005 0,391 38

Obr. 12: Závislost limitní velikosti Ag částic připravených redukcí komplexního aniontu [Ag(SO 3 ) 2 ] 3- pomocí HQ, PPD a Metolu na koncentraci siřičitanu v reakčním systému. Tvar závislosti velikosti připravených částic stříbra je nelineární a závisí na typu použité organické redukční látky (viz Obr. 12). Na těchto závislostech je znatelný zlom v dalším poklesu velikosti připravených částic stříbra okolo koncentrace siřičitanu 0,02 mol dm -3. Tato změna může souviset s faktem, že při daných koncentračních poměrech dochází při této koncentraci k přechodu mezi tvorbou různých typů komplexních aniontů stříbra ze složení [Ag(SO 3 ) 2 ] 3- (Kd = 2,1 10-9, 25 C) na [Ag 2 (SO 3 ) 3 ] 4- (K d = 2,5 10-6, 25 C) [260]. O tři řády nižší stabilita tohoto druhého komplexního aniontu zvyšuje koncentraci volných stříbrných iontů přístupných redukci. Tím dochází k prudkému nárůstu redukční rychlosti v prvotní fázi reakce a dochází tak k tvorbě většího počtu zárodků nové fáze a tím i k pozorovanému zlomu v závislosti velikosti vznikajících stříbrných částic na koncentraci siřičitanu. Uvedený vliv koncentrace siřičitanu na změnu stechiometrie komplexní stříbrné sloučeniny by se měl teoreticky projevit při dalším snižování koncentrace siřičitanu, protože zde existuje ještě možnost tvorby nejjednodušší komplexní částice o složení [Ag(SO 3 )] -. Ovšem vzhledem k použití Britton-Robinsonova pufru ve studovaném reakčním systému a rovněž alkalické hodnotě ph systému nelze snižovat koncentraci siřičitanu pod limitní použitou hranici 0,005 mol dm -3 bez nebezpečí tvorby špatně rozpustných sloučenin stříbra. Pro objasnění pozorované závislosti velikosti vyredukovaných stříbrných částic na koncentraci siřičitanu je třeba vzít na pomoc teorii tvorby a růstu nové fáze [261, 262]. Podle této teorie vzniká v roztoku zárodek nové fáze pouze za termodynamicky vhodných podmínek, charakterizovaných zejména hodnotou přesycení. Na tomto přesycení je závislá frekvence vzniku zárodků nové fáze J podle vztahu (8): J WC = J 0 exp (8) ( kt ) 39

kde J o je preexponenciální faktor a W c je energie tvorby zárodku o kritické velikosti, vyjádřená vztahem (9): ( V ) 2 m 2 3 16πσ W C = (9) 3 µ kde σ je hodnota povrchové energie nově vznikající fáze, V m je její molární objem a µ je rozdíl chemických potenciálů látky ve stabilní makrofázi a ve výchozí fázi [263].Tento rozdíl je určen právě přesycením roztoku látky, vytvářející novou fázi. Klesající koncentrace siřičitanu v systému tak zvyšuje na základě disociační rovnováhy komplexu [Ag(SO 3 ) 2 ] 3- koncentraci volných iontů Ag + v systému a tím se zvyšuje i přesycení vzhledem k množství vyredukovaných atomů Ag za jednotku času. Proto s poklesem koncentrace ligandu SO 2-3 v systému dochází ke zvýšení frekvence vzniku zárodků nové fáze a tudíž vyredukované atomy Ag se musí v konečné fázi rozdělit mezi větší množství rostoucích částic. To při limitovaném obsahu stříbrných iontů v systému vede ke zmenšení velikosti vznikajících stříbrných částic. Pro potvrzení úvah o vlivu dosaženého stupně přesycení na tvorbu zárodků stříbrných částic byly provedeny další experimenty, při nichž byla v reakčním systému s hydrochinonem jako redukční látkou měněna koncentrace stříbrné soli. Při snižování koncentrace dusičnanu stříbrného z hodnoty 2,5 10-4 mol dm -3 až na 5 10-5 mol dm -3 (při koncentraci hydrochinonu a siřičitanu v reakčním systému 0,05 mol dm -3 a ph = 10,60 ± 0,05) docházelo k lineárnímu poklesu průměrných velikostí částic stříbra přibližně od 160 nm k 90 nm (určeno z TEM). Pozorovanou závislost velikosti vyredukovaných částic stříbra na koncentraci dusičnanu stříbrného je možné snadno vysvětlit právě využitím výše uvedených závěrů z teorie tvorby nové fáze. Pokud bude změna koncentrace AgNO 3 dostatečně malá na to, aby došlo k výrazné změně frekvence vzniku zárodků nové fáze, bude při všech testovaných koncentracích vznikat řádově konstantní počet zárodečných center. Oprávněnost uvedeného předpokladu podporuje jednoduchý výpočet ukazující, že při snížení koncentrace iontů stříbra v uvedeném rozsahu klesá redox potenciál stříbrné elektrody z hodnoty 0,26 V pro koncentraci AgNO 3 2,5 10-4 mol dm -3 na 0,23 V pro koncentraci AgNO 3 5 10-5 mol dm -3 (dle rovnice (20)). Na vzniklých rostoucích zárodcích částic stříbra pak probíhá ukládání dalšího vyredukovaného stříbra energeticky méně náročným heterogenním mechanismem. Při konstantním počtu rostoucích částic s klesající koncentrací AgNO 3 pak klesá i průměrná velikost částic stříbra (viz Tab. 4). 40

Tab. 4: Srovnání přibližného počtu částic připravených redukcí komplexu [Ag(SO 3 ) 2 ] 3- hydrochinonem pro různé koncentrace dusičnanu stříbrného. Hmotnost stříbra a počet částic se vztahuje na 25 ml reakčního roztoku. Průměrná velikost částic byla určena na základě TEM snímků. c ( AgNO 3 ) [ mmol.dm 3 ] Průměrná velikost částic [ nm ] Hmotnost stříbra [ mg ] Počet částic 0,25 160 0,674 2,995. 10 10 0,15 130 0,404 3,347. 10 10 0,1 110 0,269 3,678. 10 10 0,075 100 0,202 3,676. 10 10 0,05 90 0,135 3,999. 10 10 Výrazně odlišné výsledky redukce stříbrného iontu v prostředí komplexujícího siřičitanového aniontu byly pozorovány v případě použití silných redukčních činidel - tetrahydridoboritanu sodného, hydrazinu a formaldehydu. Výsledky závislosti velikosti částic stříbra na koncentraci siřičitanu získané z měření velikosti částic metodou DLS odpovídaly výsledkům získaným při redukci slabšími organickými redukčními činidly typu fotografických vyvolávacích látek (viz Obr. 13). Velikost připravených částic stříbra se tak zdánlivě pohybovala od asi 220 nm až po 680 nm. Jak ale ukázaly kontrolní snímky z TEM, skutečná velikost primárních částic stříbra byla podstatně menší (méně než 100 nm viz Obr. 14). Snímky z TEM (viz Obr. 15) ukázaly, že nanometrické, primárně vyredukované částice stříbra za podmínek experimentu prakticky okamžitě agregují za vzniku útvarů o rozměrech stovek nm. Obr. 13: Závislost průměrné velikosti částic stříbra připravených redukcí Ag + pomocí a) NaBH 4, b) N 2 H 4 a c) HCHO na koncentraci siřičitanu c s v reakčním systému. Obr. 14: Závislost velikosti částic stříbra připravených redukcí Ag + pomocí NaBH 4 na koncentraci siřičitanu v reakčním systému. Velikosti částic určeny z DLS a) po 1 min od přípravy, b) po 5 min od přípravy a c) z TEM. 41

Obr. 15: TEM snímky částic stříbra připravených redukcí Ag + v prostředí siřičitanu pomocí NaBH 4. Koncentrace siřičitanu v reakčním systému a) 0,2; b) 0,1; c) 0,05; d) 0,02; e) 0,01; f) 0,005 mol.dm 3. Při hledání příčiny po důvodu tak silného agregátního chování primárních nanočástic stříbra, připravených silnými redukčními činidly, se jako rozhodující faktor ukázal přítomný pufr. Proto další fáze experimentů s tímto systémem byla vedena ve směru zjištění možnosti změny velikosti výsledných částic stříbra a jejich agregátní stability změnou koncentrace pufru. Protože v této fázi použité silné redukční látky nevykazují tak strmou závislost své redukční síly na ph, tak jako slabší redukční látky typu hydrochinonu či fenylendiaminu, bylo složení celého systému zjednodušeno použitím čistě borátového pufru namísto původně používaného Britton-Robinsonova pufru. Variací koncentrace tohoto borátového pufru od nulové hodnoty až po původní koncentraci pufru v systému (0,025 mol dm -3 ) bez významné změny ph reagujícího systému (variace v rozmezí 10,35 až 10,55 jednotek) došlo k výrazné změně v průběhu závislosti rozměru připravených částic stříbra na koncentraci siřičitanu, jak ukazují jednotlivé grafy na obr. 16 pro studované koncentrace siřičitanu v rozmezí 0,005 až 0,02 mol dm -3. 42

Obr. 16: Závislost velikosti nanočástic stříbra připravených redukcí stříbrné soli pomocí NaBH 4 v prostředí borátového pufru o koncentraci c b pro různé koncentrace siřičitanu v reakčním systému: a) 0,02, b) 0,01 a c) 0,005 mol dm -3. Při vyšších koncentracích siřičitanu se již efekt pufru na velikost vznikajících částic stříbra neobjevoval, z čehož lze soudit, že rozhodující roli v destabilizaci vznikajících nanočástic stříbra, hraje koncentrace protiiontů a tedy neutralizace povrchového náboje částic, tak jak předpovídá teorie DLVO. Koncentrace protiiontu, v tomto případě jednomocného kationtu Na +, přesahuje koagulační práh okolo hodnoty 0,05 mol dm -3. Kation Na + je vnášen do systému jak z Na 2 SO 3, tak i z Na 2 B 4 O 7 a nakonec i z NaOH, dodávaného pro úpravu ph na konečnou hodnotu okolo 10,5. Výsledky těchto pokusů tak naznačují, že v případě silných redukčních činidel se vliv komplexotvorného činidla na velikost vznikajících nanočástic stříbra uplatňuje jen minimálně, v případě siřičitanu jako ligandu je regulovatelné rozmezí velikosti nanočástic stříbra asi 20-50 nm. Navenek pozorovaný zdánlivý nárůst velikosti stříbrných částic nad 100 nm pak souvisí s agregací těchto primárních částic při zvýšené iontové síle reakčního systému, resp. zvýšené koncentraci protiiontu. Nanočásticový charakter připravených částic stříbra byl pak potvrzen nejenom hodnotami získanými měřením metodou DLS a potvrzenými z TEM (Obr. 17), ale další potvrzení přinesla naměřená UV/Vis spektra disperzí těchto nanočástic. V nich se objevuje výrazný absorpční pík povrchového plasmonu při vlnové délce 390-410 nm, charakteristický pro dobře separované (neagregované) částice stříbra o rozměrech menších než 100 nm (viz Obr. 18). Současně ovšem rychlý pokles tohoto absorpčního maxima v čase ukázal, že tyto nanočástice jsou bez další úpravy ve vodné disperzi stabilní pouze několik desítek hodin. Na závěr této subkapitoly tak lze na základě získaných výsledků konstatovat, že prostředí siřičitanu není příliš vhodné pro redukční přípravu stabilních nanočástic stříbra. Těžiště této metody spočívá spíše v přípravě submikrometrických částic stříbra, 43

které lze v případě požadavku na reprodukovatelnou přípravu disperze tak velkých částic s nízkým stupněm polydisperzity připravit jinými metodami jen obtížně. Obr. 17: TEM snímky částic stříbra připravených redukcí Ag + pomocí NaBH 4 v prostředí siřičitanového aniontu o koncentraci 0,005 mol dm -3. Měnící se koncentrace borátového pufru v reakčním systému pak procházela hodnotami a) 0,025; b) 0,015; c) 0,0135; d) 0,001 a e) 0 mol.dm -3. Obr. 18: UV/Vis spektra vodných disperzí částic stříbra připravených redukcí silnými redukčními činidly v prostředí siřičitanu pro různé koncentrace borátového pufru: a) 0,025; b) 0,015; c) 0,01; d) 0,005 a e) 0,001 mol dm -3. Jako redukční látky byl použit NaBH 4 (A) a N 2 H 4 (B). 44

6.2 Příprava nanočástic stříbra v komplexujícím amoniakálním prostředí Z chemické praxe asi nejznámější komplexující prostředí pro stříbrné kationty představuje roztok amoniaku ve vodě. Na rozdíl od případu prostředí siřičitanového aniontu, kde vzniká komplexního anion [Ag(SO 3 ) 2 ] 3-, v prostředí amoniakálním vzniká o něco méně stabilní komplexní kation o složení [Ag(NH 3 ) 2 ] +. Jeho disociační konstanta má hodnotu K d = 9,3 10-8, proto je schopen poměrně silně vázat stříbrný ion, obzvláště při dostatečné koncentraci amoniaku v roztoku. Pro porovnání koncentrace volného kationtu Ag + v roztoku uvedených dvou komplexotvorných činidel o koncentraci 0,1 mol dm -3 (a celkové koncentraci stříbrné soli 0,001 mol dm -3 ) vychází pro prostředí siřičitanu v prvním přiblížení (ideální roztok) koncentrace volného Ag + asi 2 10-10 mol dm -3, kdežto pro amoniakální prostředí 9 10-9 mol dm -3. Tato hodnota představuje téměř 50x vyšší koncentraci volného stříbrného iontu v roztoku, než je tomu v případě siřičitanového komplexujícího prostředí. Toto zvýšení koncentrace volného stříbrného iontu má za následek takový posun redox potenciálu stříbrné elektrody (přibližně 100 mv pro 25ºC), že k redukci této komplexní sloučeniny v roztoku postačují i podstatně slabší redukční činidla, než tomu bylo v případě komplexního aniontu [Ag(SO 3 ) 2 ] 3-. Proto lze při syntéze částic stříbra v amoniakálním prostředí použít i redukující cukry, např. glukózu, čímž se dostáváme k reakci historicky známé jako Tollensova reakce, resp. reakce přípravy stříbrného zrcátka [264]. Vzhledem v předchozí subkapitole prezentovaným výsledkům experimentů, zaměřeným na hledání možnosti řízení velikosti částic stříbra vznikajících při redukci komplexního stříbrného iontu vhodnou redukční látkou, se zdá být výhodnější využití slabšího redukčního činidla, které pravděpodobně poskytuje větší variabilitu regulace velikosti vznikajících částic změnou koncentrace komplexotvorného činidla. Proto širší výběr redukčních látek v případě amoniakálního komplexujícího prostředí může hrát v nalezení konečného cíle tedy přípravy stabilních nanočástic stříbra - významnou roli. Skutečně vlastní experimenty zaměřené na redukci komplexního kationtu [Ag(NH 3 ) 2 ] + v prostředí amoniaku řadou redukujících cukrů ukázaly širokou variabilitu velikosti částic v závislosti jak na koncentraci amoniaku, tak i na použitém redukujícím cukru. Redukční potenciál redukujících cukrů je obdobně, jako u v předchozí části diskutovaných fotografických vyvolávacích látek, silně závislý na ph (viz cyklický voltamogram glukózy na Obr. 19). Proto bylo nutno při těchto experimentech v zájmu udržení konstantní reakční rychlosti (kontrolované dosažením celkové reakční doby nižší než 5 min) s rostoucí koncentrací amoniaku v systému zvyšovat i jeho ph. Použitý 45

rozsah ph se pohyboval od přibližně 11 (pro nejnižší koncentraci NH 3 až po 12,5 (pro nejvyšší použitou koncentraci NH 3 ). Z řady dostupných redukujících cukrů byly pro experimenty vybrány nejběžnější zástupci monosacharidů a disacharidů glukóza, galaktóza, xylóza, arabinóza, ribóza a fruktóza z řady monosacharidů a maltóza a laktóza jako zástupci disacharidů. Rozsah koncentrací komplexotvorného činidla byl v tomto případě použit stejný jako v případě siřičitanového komplexujícího prostředí tedy v oblasti 0,005 až 0,2 mol dm -3. Vzhledem k nižším reakčním rychlostem, dosahovaných při redukci s redukujícími cukry, byla ale zvýšena koncentrace stříbrné soli v systému na hodnotu 10-3 mol dm -3, tedy 108 mg Ag/l výsledné disperze. Obr. 19: Cyklický voltamogram glukózy na Pt elektrodě při rychlosti scanu 50mV/s v amoniakálním pufru o ph a) 10,35 a b) 11,70. Získané výsledky závislosti velikosti připravených částic stříbra (měřených DLS) na koncentraci amoniaku v reakčním systému v prvé fázi experimentů naznačily možný široký rozsah dosažitelných velikostí částic stříbra od cca 20 nm až po stovky nm (viz Tab. 5). Pouze fruktóza, v experimentech jediný zástupce ketóz, se vymyká z tohoto rozpětí velikostí připravovaných částic stříbra. Ani při nejnižší koncentraci amoniaku 46

v systému, tedy 0,005 mol dm -3, se v tomto případě nepodařilo připravit skutečné nanočástice, protože nejmenší dosažitelná velikost vyredukovaných částic stříbra se pohybovala okolo 150 nm. Tab. 5: Závislost velikosti částic stříbra připravených redukcí komplexního kationtu [Ag(NH 3 ) 2 ] + vybranými redukujícími cukry na koncentraci amoniaku v reakčním systému. redukující cukr koncentrace amoniaku [ mol dm -3 ] 0,005 0,01 0,02 0,035 0,05 0,1 0,2 d / h.w. * d/ h.w. * d / h.w. * d/ h.w. * d / h.w. * d/ h.w. * d / h.w. * monosacharidy glukóza 44/13 52/18 52/20 304/140 318/138 394/165 453/246 fruktóza 149/37 158/52 182/71 250/93 303/127 363/153 395/187 disacharidy maltóza 25/8 30/9 32/10 290/95 286/99 213/75 262/91 laktóza 35/11 41/12 41/13 286/96 282/106 168/59 186/63 * d značí průměrnou hodnotu velikosti stříbrné částice v nm určené z DLS a h.w. značí pološířku distribuční křivky rozdělení velikosti těchto částic v disperzi rovněž určené z DLS Získané výsledky zejména při použití disacharidů jako redukčních látek znamenaly významný průlom v oblasti přípravy nanočástic stříbra zejména z hlediska reprodukovatelnosti této metodiky a rovněž tak nízkého stupně polydisperzity připravených disperzí nanočástic stříbra zejména při nejnižší koncentraci amoniaku v reakčním systému. Navíc ohromnou devizu této metody představuje dlouhodobá stabilita disperze připravených nanočástic, která se pohybuje v oblasti měsíců až dokonce roků, což je patrně důsledek vysoké hodnoty zeta potenciálu (a tedy i povrchového náboje) těchto nanočástic okolo hodnoty 25 mv. Kvalita dosažených výsledků této nově navržené syntetické metody nanočástic stříbra umožnila jejich publikaci v prestižním materiálovém časopise Journal of Materials Chemistry v roce 2005 [62]. Ovšem ani tato metoda neposkytuje zcela optimální výsledky z hlediska možnosti řízení velikosti připravovaných částic stříbra. Grafické znázornění závislosti velikosti připravených částic stříbra na koncentraci amoniaku (Obr. 20) ukazuje na velmi strmý nárůst této velikosti až na hodnoty několika stovek nm v okolí koncentrace amoniaku v reakčním systému přibližně 0,03 mol dm -3. Experimenty z této oblasti byly 47

navíc podstatně hůře reprodukovatelné a vznikající částice i přes již uvedenou vysokou hodnotu zeta potenciálu (okolo -25 mv, prakticky konstantní pro výsledky všech realizovaných experimentů) vykazovaly na rozdíl od nanočástic připravených při nižší koncentraci amoniaku podstatně nižší časovou stabilitu (řádově desítek minut, maximálně jednotek hodin). Obr. 20: Závislost velikosti částic stříbra připravených redukcí komplexního kationtu [Ag(NH 3 ) 2 ] + vybranými redukujícími cukry na koncentraci amoniaku c am v reakčním systému. Jako redukující cukry byly použity v případě (A) glukóza (a) a galaktóza (b), v případě (B) pak fruktóza (a) a maltóza (b). Prudký nárůst velikosti částic stříbra v reakčním systému při vzrůstu koncentrace amoniaku na hodnotu 0,035 mol dm -3 a vyšší se stal objektem dalšího studia reakčního mechanismu příslušného redukčního děje. Jako modelový redukující cukr byla vybrána glukóza a s ní bylo provedeno podrobné zmapování vlivu jak koncentrace amoniaku, tak i dalších reakčních proměnných na změnu velikosti vyredukovaných částic stříbra. V rámci tohoto podrobného rozboru vlivu jednotlivých reakčních podmínek na Obr. 21: Závislost velikosti částic stříbra připravených redukcí Ag + glukózou v amoniakálním prostředí (koncentrace 0,01 mol dm -3 ) na ph reakčního systému. výsledné částice stříbra se jako další významný faktor projevila hodnota ph reakčního systému. Bylo zjištěno, že při konstantní koncentraci amoniaku v reakčním systému 48

dochází k prudkému nárůstu velikosti vyredukovaných částic stříbra přibližně okolo hodnoty ph 12,5, jak ukazuje modelová závislost pro systém s koncentrací amoniaku 0,01 mol dm -3 (Obr. 21). Původní hypotéza spojovala tuto náhlou změnu velikosti částic stříbra se změnou mechanismu oxidace redukujícího cukru (změna adsorpčního módu cukru na kovovém povrchu při vysokém ph [265]). Ta se zřejmě podle zde provedené voltametrické studie odehrává právě v oblasti ph blízké hodnotě, kde dochází k náhlému nárůstu velikosti částic stříbra (viz Obr. 19). Rozsáhlé zmapování vlivu ph a koncentrace amoniaku na velikost částic stříbra připravených v tomto komplexujícím prostředí redukcí glukózou (viz konturový graf na Obr. 22) ukázala skutečně, že se oba efekty z hlediska hodnot ph, kde k nim dochází, sobě velmi podobají. Obr. 22: Trojrozměrný konturový graf znázorňující vliv koncentrace amoniaku a ph na velikost částic stříbra vznikajících redukcí Ag + v amoniakálním prostředí glukózou. Následná elektronmikroskopická studie částic stříbra vznikajících v této soustavě za různých podmínek koncentrace amoniaku a ph však neprokázala existenci tak rozměrných částic stříbra v reakčním systému s vysokými hodnotami ph, ale naopak přítomnost agregátů primárních nanočástic stříbra (viz Obr. 23). Tak byla potvrzena druhá možná hypotéza o nárůstu velikosti částic stříbra při vysokých hodnotách ph vlivem agregace primárních nanočástic stříbra díky zvýšené koncentraci jednomocného kationtu Na +. Ten je do reakčního systému dodáván v podobě NaOH, jímž byla řízena 49

hodnota ph. Zde se tak ukázala univerzální platnost mechanismu rychlé koagulace vyvolané přídavkem elektrolytů, popsané teorií DLVO jako tzv. neutralizační mechanismus koagulace - neutralizace povrchového náboje koloidních částic vlivem zvýšené koncentrace elektrolytu. Konečné potvrzení tohoto mechanismu nárůstu velikosti částic stříbra vlivem přídavku elektrolytu bylo realizováno zvýšením ph primárně připravené stabilní disperze nanočástic stříbra následovaným velmi rychlou koagulací za vzniku agregátů velikosti odpovídající jejich přímému vzniku v reakčním systému během redukce stříbrného kationtu. Obr. 23: TEM snímky ilustrující agregaci nanočástic stříbra vzniklých v amoniakálním systému redukcí glukózou při vysoké hodnotě ph=12,7. Nanočásticový charakter připravených částic stříbra redukcí stříbrné soli redukujícími cukry v amoniakálním prostředí, stejně jako jejich agregaci při vyšších hodnotách ph prokázala i UV/Vis spektra. V případě samostatně dispergovaných nanočástic stříbra se v těchto spektrech objevuje charakteristická intenzivní absorpce světla okolo vlnové délky 400-420 nm, která uděluje disperzi těchto nanočástic intenzivní oranžové zabarvení (Obr. 24). Tato intenzivní absorpce je důkazem existence povrchového plasmonu, který je spojen právě s rozměrem kovových nanočástic pod 100 nm (Obr.25). Obr. 24: Fotografie vodných disperzí částic stříbra připravených redukcí Ag + v amoniakálním prostředí maltózou. Zleva doprava: disperze nanočástic stříbra o velikosti cca 25 nm; disperze koloidních částic stříbra o velikosti cca 120 nm; disperze agregátů nanočástic stříbra o velkosti cca 400 nm. 50

Obr. 25: UV/Vis spektra nanočástic stříbra připravených redukcí Ag + v amoniakálním prostředí glukózou (A), fruktózou (B) a maltózou (C). Koncentrace amoniaku v reakčním systému byla pro všechny redukční látky a) 0,2; b) 0,1; c) 0,05; d) 0,02; e) 0,01 a f) 0,005 mol dm -3. Na rozdíl od nanočástic stříbra připravených redukcí silnými redukčními činidly v prostředí siřičitanu jsou nanočástice stříbra připravené v amoniakálním prostředí i při obdobných částicových parametrech (velikost a velikostní distribuce částic) podstatně stabilnější. Stabilitu vodných disperzí nanočástic stříbra připravených redukcí stříbrného iontu maltózou při koncentraci amoniaku v systému 0,005 mol dm -3 a ph=11,2 lze počítat na měsíce až roky, což velmi dobře dokumentuje stabilita UV/Vis spekter této disperze (Obr. 26). Důvodem této mimořádné stability je zcela jistě vysoká hodnota zeta potenciálu těchto nanočástic, která činí asi 25 mv, na rozdíl od přibližně 15 mv naměřených pro disperzi nanočástic stříbra připravenou redukcí pomocí NaBH 4 v prostředí o koncentraci 0,005 mol dm -3 siřičitanu. Ovšem polydisperznější systémy nanočástic stříbra připravené v amoniakálním prostředí redukcí jinými redukujícími cukry (např. glukózou) již takovou stabilitou neoplývají, i když zeta potenciál těchto částic se pohybuje na stejných hodnotách jako u disperze připravené redukcí maltózou. Disperze nanočástic stříbra připravených redukcí stříbrného iontu maltózou při koncentraci amoniaku v systému 0,005 mol dm -3 vyniká výbornými částicovými parametry - při průměrné velikosti okolo 25 nm (určené z DLS) je zde zachována velmi úzká velikostní distribuce blížící se monodisperznímu systému (index polydisperzity v optimálním případě klesá k hodnotám 0,06 až 0,08), jak dokumentují i snímky z TEM a AFM (Obr. 27). Tyto vynikající parametry společně s dlouhodobou stabilitou předurčují tuto disperzi k využití v praktických aplikacích, o kterých bude pojednáno v dalších kapitolách. Malý rozměr částic a jejich výborná stabilita se uplatňují zejména v oblasti využití antibakteriální aktivity nanočástic stříbra v této oblasti bylo dosaženo vynikajících výsledků srovnatelných plně s výsledky jiných světových pracovišť. 51

Obr. 26: Časová stabilita UV/Vis spekter vodných disperzí nanočástic stříbra připravených redukcí Ag + v amoniakálním prostředí o koncentraci 0,005 mol dm -3 za pomoci maltózy (A) a glukózy (B). Doba stání disperze po její přípravě činila a) 0 hod, b) 24 hod, c) 1 měsíc, d) 3 měsíce a e) 6 měsíců. Obr. 27: TEM snímky nanočástic stříbra připravených v amoniakálním prostředí o koncentraci 0,005 mol dm -3 redukcí glukózou (a) a maltózou (b) a AFM snímek (c) stejné disperze nanočástic stříbra jako je TEM na obr. 27 b). 52

6.3 Modifikace nanočástic stříbra tenzidy a polymery Praktické aplikace nanočástic stříbra vyžadují použití systémů se stabilními částicovými parametry bez ohledu na prostředí, ve kterém jsou tyto částice aplikovány. Přes dobrou stabilitu disperzí nanočástic stříbra připravených redukcí stříbrného iontu v amoniakálním prostředí maltózou, jak bylo referováno v minulé kapitole, není tato disperze stabilní za všech podmínek. Velká změna ph, přebytek elektrolytů, ale i některých organických látek (tzv. polyelektrolytů) vedou k destabilizaci disperze a následné koagulaci stříbrných nanočástic. Tomuto procesu se v praxi brání povrchovou modifikací nanočástic, obvykle látkami, které jsou schopny po adsorpci zvyšovat povrchový náboj částic ionické tenzidy, či mohou po adsorpci na povrchu zvyšovat energetickou bariéru proti spojování částic díky sterické repulzi neionické tenzidy a polymery. Protože zde vyvinutým postupem připravená disperze nanočástic stříbra je velmi stabilní, jsou klasické metody studia jejího agregačního chování špatně realizovatelné nutné dosažení vysoké koncentrace jednomocného kationtu, resp. při použití vícemocných kationtů dochází k jejich hydrolýze v alkalickém prostředí disperze. Proto byla pro účely studia agregátní stability připravených disperzí nanočástic stříbra navržena a odzkoušena nová metodika, využívající pro destabilizaci záporně nabitých nanočástic stříbra kationický polyelektrolyt. V tomto případě byl použit kationický polyelektrolyt poly(diallyldimethylammonium) chlorid (PDDA), který velmi účinně destabilizuje výchozí disperzi nanočástic stříbra již při velmi nízkých koncentracích v roztoku (10-5 % (w/w) roztok). To umožnilo provést tuto stabilizační studii za podmínek jen minimálních koncentračních změn původní disperze. Již při přídavku 10 µl 0,01% roztoku PDDA do 1 ml disperze (konc. PDDA 10-4 %, objemová změna disperze 1%) díky indukované koagulaci docházelo k dvojnásobnému nárůstu průměrné velikosti částic v disperzi a desetinásobné množství roztoku PDDA tuto disperzi již totálně destabilizuje za vzniku mikrometrových agregátů velmi rychle sedimentujících z původní disperze. Zjištěná kritická koagulační koncentrace (CCC) u nemodifikované disperze nanočástic stříbra pak měla hodnotu 2,4 10-5 % (w/w) PDDA (viz Obr. 28). Z takto určené hodnoty CCC lze na základě závěrů teorie DLVO odhadnout efektivní náboj, kterým použitý polyelektrolyt neutralizuje náboj povrchu stříbrné nanočástice podle vztahu: CCC = 87 10-40 /(z 6 A 2 ) (10) 53

kde z reprezentuje náboj protiiontu přidaného elektrolytu a A představuje Hamakerovu konstantu v J pro CCC v jednotkách mol dm -3. Spočtená hodnota efektivního náboje za využití hodnoty Hamakerovy konstanty párové interakce atomů Ag-Ag rovné 39 10-20 J, určené experimentálně z AFM měření, činila 20 elementárních nábojů, což představuje pouhé procento průměrné hodnoty náboje neseného polymerní molekulou PDDA (o průměrné molekulové hmotnosti 275 kda). Stanovená nízká hodnota efektivního náboje tak ukazuje i na specifiku interakce polymerního řetězce PDDA se stříbrnou nanočásticí - s největší pravděpodobností se tato interakce odehrává v tzv. tail módu, kdy je polymerní řetězec navázán na tuhý povrch pouze koncovou částí řetězce (viz Obr. 29). Obr. 28: Stanovení agregátní stability nemodifikované disperze nanočástic sříbra titrací roztokem PDDA. (A) Stanovení CCC z měření velikosti částic (DLS). (B) Změna UV/Vis spekter disperze během titrace po přídavku a) 0; b) 0,2; c) 0,4; d) 0,6; e) 0,8 a f) 0,10 ml 0,01% (w/w) roztoku PDDA. Obr. 29: Módy interakce polymerního řetězce s povrchem Ag částice. Následně byly stejným způsobem testovány i disperze nanočástic stříbra modifikované vybranými tenzidy a polymery o výsledné koncentraci modifikátorů v disperzi 1% (w/w). Pro toto testování byly použity následující látky anionický tenzid SDS, neionický tenzid Tween 80 a z polymerů pak byly použity PEG a PVP o různých molekulových hmotnostech. Z hlediska stabilizačního účinku proti agregaci vyvolané přídavkem PDDA do vodné disperze nanočástic stříbra se jako optimální stabilizátor ukázal SDS, který zásadně zvyšuje zeta potenciál nanočástic stříbra až na hodnotu okolo 50 mv. Ani maximální 54