in vitro diagnostika Delsa Max nový přístroj k charakterizaci nanočástic Instalace prvního 5laserového sorteru MoFlo XDP v České republice Vysokokapacitní třídění jako nástroj pro moderní šlechtění fotosyntetických mikroorganismů Diagnostika AKI (akutního poškození ledvin) pomocí močových indikátorových proteinů: Index A1m/Alb? EuroMedLab 2013 Informační magazín IN VITRO DIAGNOSTIKA 24-2013
S Michalem Zahradníčkem o vědeckotechnickém parku 4MEDi Vizualizace 4MEDI- PrimeCell otevře v Ostravě největší evropské centrum Moderní terapie pro vývoj lidských buněk za jednu miliardu Kč Ing. Michal Zahradníček, MBA Michal Zahradníček ukončil ekonomická studia na Univerzitě v Darmstadtu (Německo) a současně na VUT v Brně v roce 1993. Poté zahájil svou pracovní kariéru coby provozní ekonom v ČSAD Ostrava a.s. Stal se rovněž asistentem tamního generálního ředitele pro strategii. Studium MBA dokončil v roce 2001 na Manchester Metropolitan University (UK). Jeho posledním zaměstnaneckým poměrem před odchodem do privátního sektoru byla pozice finančního ředitele pro region CEE v mezinárodní skupině Arjo Wiggins Appleton (UK, Francie). Od roku 2001 se věnuje investicím do oblastí s vysokým inovativním potenciálem, a to nejen na území našeho státu. V letech 2005 2006 působil jako poradce pro zdravotnictví a zdravotní reformu Ministerstva financí Slovenské republiky. V roce 2006 založil biotechnologickou společnost PrimeCell Therapeutics a.s., a představil tak České republice nové obory moderní terapie a regenerativní medicína. V současné době je u nás i v zahraničí spoluvlastníkem a investorem několika inovativních podniků působících ve sféře biomedicíny, nanotechnologií, IT a energetiky. Ve firmě PrimeCell Therapeutics a.s. je majoritním vlastníkem. Současně zde zastává pozici předsedy dozorčí rady. Tuto roli vykonává také v případě 2 dceřiných společností Národní Centrum Tkání a Buněk a.s. a 4MEDi Centrum buněčné terapie a diagnostiky a.s. V roce 2004 získal titul Manažer roku střední firmy udělovaný Českou manažerskou asociací. Od roku 2009 je členem výboru České golfové federace. Je duchovním otcem projektu Hraj golf, změň život, jehož cílem je umožnit hrát golf co nejširší části české populace. Několik let provozuje dětskou surfařskou školu v Portugalsku a Maroku. V letech 2005 2010 byl členem Rady expertů České manažerské asociace. Mnoho let podporuje Český paralympijský výbor. Hovoří čtyřmi jazyky. 1. Hlavním cílem projektu 4MEDi je aplikovat výsledky vědy a výzkumu do praxe. Které instituce a subjekty jsou do něj začleněny a jakým způsobem? Mezi hlavní partnery biotechnologického centra 4MEDi ve sféře vědy a výzkumu patří 4MEDi aktuální stavba - září 2013 Ostrava Fakultní nemocnice Ostrava, Zdravotní ústav se sídlem v Ostravě, Národní Centrum Tkání a Buněk a.s. a Spadia Lab. Na projektech v této oblasti je však spolupráce plánována také s mnoha jinými fakultními nemocnicemi a univerzitami v České republice. Podrobnější informace naleznou čtenáři na stránkách www.natic.cz. V současné době firma PrimeCell Therapeutics a.s., která vědeckotechnický park 4MEDi buduje, jedná s dalšími významnými zahraničními společnostmi a výzkumnými centry (především z USA, Ruska a Dálného východu), jež se zapojí do oblasti vědy a výzkumu. 4MEDi představuje první translační centrum v České republice. Jinými slovy lze říci, že je centrum budováno s cílem zajistit transfer, aplikaci a tržní využití výsledků základního a aplikovaného výzkumu v několika medicínských a biotechnologických oborech. Do celého translačního procesu budou zahrnuty jak spolupracující subjekty české akademické a komerční, tak ty zahraniční. Naše multiobopokračování na str. 4
OBSAH S Michalem Zahradníčkem o vědeckotechnickém parku 4MEDi E. Králová Delsa Max nový přístroj k charakterizaci nanočástic M. Polčík Velikostní výběr fragmentů nukleových kyselin pomocí kitu Agencourt SPRIselect M. Máša Instalace prvního 5laserového sorteru MoFlo XDP v České republice R. Vlček Vysokokapacitní třídění jako nástroj pro moderní šlechtění fotosyntetických mikroorganismů J. Červený, D. Búzová 2 6 8 10 11 Nové monoklonální protilátky pro průtokovou cytometrii P. Kružík Lineage-PE Cocktail Liquid (2 ml, 100 testů, objednací číslo B29559) P. Kružík Nová reagencie pro studium buněčné signalizace a fosfoepitopů P. Kružík Nová verze průtokového cytometru sorteru MoFlo AstriosEQ P. Kružík Nové verze přístrojů se software pro Windows 7 P. Kružík Vitamín D T. Tietze, I. Mičíková Přímé stanovení kortizolu ve slinách na soupravě Access Beckman Coulter I. Mičíková, T. Tietze Stanovení sérových markerů v diferenciální diagnostice časného karcinomu prostaty R. Fuchsová Diagnostika AKI (akutního poškození ledvin) pomocí močových indikátorových proteinů: Index A1m/alb? Klinický význam vysoké koncentrace alfa-1-mikroglobulinu: slibný marker AKI? J. Granátová Kongres Human Reproduction 13. 16. března 2013, Benátky R. Kučera Setkání uživatelů systémů Beckman Coulter fotoreprotáž 7. 9. dubna 2013, Dolní Morava I. Mičíková Launch nového pipetovacího automatu Biomek 4000 22. 24. dubna 2013, Praha E. Králová Stretnutie užívateľov prietokových cytometrov spoločnosti Beckman Coulter 21. 23. apríla 2013, Modra J. Smolka 19. setkání distributorů manuálních imunoanalytických souprav 13. 16. května 2013, Praha H. Krátká EuroMedLab 2013 19. 23. května 2013, Milán V. Novák Vzhůru na Brčálník! T. Tietze křížovka Kde se můžeme setkat 12 12 13 13 13 14 15 16 18 19 20 24 26 27 28 29 30 31 32 in vitro diagnostika Časopis vydává a distribuuje Beckman Coulter Česká republika s.r.o., Radiová 1, 102 27 Praha 10, www.beckman.cz Časopis připravují Ing. Kateřina Kožaná Ing. Eva Králová Ing. Hana Krátká Mgr. Pavel Kružík Ing. Kateřina Sikorová, Ph.D. Ing. Petr Suchan Mgr. Patrik Šaf RNDr. Jozef Smolka Do časopisu přispěli Ing. Eva Králová RNDr. Martin Polčík, CSc. RNDr. Martin Máša, Ph.D. Ing. Roman Vlček Ing. Jan Červený, Ph.D. Centrum výzkumu globální změny AV ČR, v.v.i. RNDr. Diana Búzová, Ph.D. Centrum výzkumu globální změny AV ČR, v.v.i. Mgr. Pavel Kružík Mgr. Ing. Tereza Tietze Ing. Mgr. Ivana Mičíková MUDr. Radka Fuchsová FN Plzeň a LF v Plzni, UK v Praze MUDr. Jana Granátová Thomayerova nemocnice PharmDr. Radek Kučera, Ph.D. FN Plzeň, Beckman Coulter Česká republika s.r.o. RNDr. Jozef Smolka Ing. Hana Krátká Ing. Vratislav Novák, Ph.D. Ing. Kateřina Kožaná Ivan Šarkan - autor křížovky Ing. Stanislav Čermák - autor tajenky Grafik Jiří Adámek Náklad čísla 2000 výtisků Informační magazín IN VITRO DIAGNOSTIKA 24-2013 3
rové centrum tak umožní praktickým lékařům, biologům a vědcům finalizovat vývoj a aplikovat konečné produkty pacientům. 4MEDi logicky navazuje na činnost našich laboratoří v Brně (Národní Tkáňové Centrum a.s.), které jsou v provozu již od roku 2010. 2. Jaký je rozpočet tohoto projektu a z čeho bude financován následný chod centra v Ostravě po jeho dostavění? Investice do centra činí 0,7 1 mld. Kč. Již nyní registrujeme poptávku po našich službách. Předpokládáme proto další rozšíření infrastruktury, a to jak na území České republiky, tak v Evropě (v tomto případě bude záležet především na tom, od kterého evropského státu získáme lepší investiční pobídky). Je důležité zmínit, že centrum 4MEDi představuje technologicky nejvyspělejší infrastrukturu pro vývoj a výrobu produktů a léčivých přípravků z lidských buněk ve střední a východní Evropě, což je velkou atrakcí pro české i zahraniční investory. Také strategická poloha České republiky znamená přidanou hodnotu. Centrum 4MEDi a jeho chod je pouze jedním kolečkem v celém soukolí výrobního procesu. Daleko důležitější jsou pro nás dodávky produktů směrem k českým pacientům, díky nimž můžeme zachránit či zkvalitnit jejich život. Zájem o produkci regenerativní medicíny rychle roste. Za klinický výzkum stovek výrobků se utratí celosvětově cca 300 500 mld. Kč. Naším intenzivním zájmem je, aby alespoň část z tohoto gigantického objemu skončila v naší zemi. Je zřejmé, že má translační centrum 4MEDi reálnou ambici stát se obrovským poskytovatelem přípravků a produktů regenerativní medicíny, ale také zadavatelem velkého objemu subdodávek především v oblastech laboratorních vyšetření nebo analýz, například genetických či mikrobiologických, jež jsou nezbytné pro jakoukoliv výrobu produktů využívajících lidské buňky. Fluorescenční mikroskopie kmenových buněk rostoucích na 3D póréznich nosičích 3. 4MEDi rozšiřuje kapacity výzkumu a vývoje nových postupů a léčivých přípravků s využitím lidských buněk, biotechnologických postupů a moderních materiálů. Kolik vznikne nových pracovních míst? Počítá se rovněž se zapojením zahraničních odborných pracovníků? Díky centru 4MEDi vznikne přibližně 200 odborných pracovních pozic pro vědce a výzkumníky v oborech biologie, medicíny a materiálového inženýrství. Mezinárodní partneři a spolupráce se zahraničními komerčními a současně akademickými subjekty je jedním z našich klíčových cílů. Navíc plánujeme, jak již bylo řečeno, rozšíření podobné infrastruktury, jakou je 4MEDi, i mimo území České republiky. 4. Buněčná terapie je stále považována za technologii budoucnosti. Jsou již v dnešní době pro české pacienty některé aplikace dostupné? Terapie s využitím lidských buněk není otázkou budoucnosti, ale již se stala skutečností. Například Národní Centrum Tkání a Buněk a.s., které je dceřinou společností PrimeCell Therapeutics a.s., nyní vyrábí přípravek pro léčbu poranění kloubní chrupavky, a to přímo z buněk pacienta. Konkrétně se jedná o chondrocyty, tedy chrupavčité buňky z kloubní chrupavky. Do dnešního dne bylo touto metodou úspěšně odléčeno téměř 400 osob. V současné době také finalizujeme přípravy produktu, určeného k léčbě kritické ischemie dolních končetin, právě z kmenových buněk pacienta. Tento výrobek, jenž je ve výzkumu od roku 2009, předpokládáme uvést na trh ihned po otevření 4MEDi. Obecně bychom chtěli veřejnosti ročně přinést 1 2 produkty moderní terapie a regenerativní medicíny. Výsledky výzkumu kmenových buněk se nachází ve velmi pokročilé fázi. Dávají tak možnost bojovat se stále větší škálou onemocnění, např. infarktem myokardu nebo diabetem. Značně daleko jsou rovněž studie léčby defektu zraku s využitím kmenových buněk. 3D kultura kmenových buněk na nanovlákenném nosiči 4 5. Jak si stojí česká a evropská věda a medicína v oblasti terapie kmenovými buňkami ve srovnání s USA, Jižní Koreou a Japonskem? USA, Jižní Korea a Japonsko jsou tygry v tomto oboru a jejich výsledky jsou opravdu daleko. Jedná se o země, kde se tento druh léčby vyvíjí nesrovnatelně delší dobu. Také jejich prostředí umožňuje rapidní rozvoj vědy. Buněčná či moderní terapie jsou zde již téměř běžnými lékařskými postupy. Dalo by se říci, že budoucnost medicíny vidí právě v tomto přístupu. Proto i jejich vlády nahlíží na uvedené metoty s velkým respektem a přijímají řadu strategických opatření. Moderní terapie a regenerativní medicína jsou součástí tamních
národních strategií, což umožňuje výrazný progres dané sféry a především rychlejší uvedení produktů na trh, tj. směrem k pacientům. Česká věda a výzkum jsou globálně v některých oblastech konkurenceschopné a naše výsledky jsou porovnatelné s výsledky jinde ve světě. Čelíme však, díky svému členství v Evropské unii, několika legislativním bariérám, které prodlužují cestu výrobku ke svému spotřebiteli. Samozřejmě, že veškeré kroky spojené s uvedením produktů tohoto oboru na trh a tím možností využít nové metody při léčbě nemocných, jsou velmi obtížné, a to jak z finančního, tak časového hlediska. Věříme, že se situace postupně ustálí a evropský regulátor nebude přistupovat k mnohdy nesmyslným požadavkům, jež jsou v rozporu s potřebou pacientů, jak se ukazuje na trzích zmíněných výše. 6. Mezi naše čtenáře patří lidé z výzkumných, ale převážně klinických laboratoří. Mohou se i oni nějakým způsobem zapojit do výzkumu nebo klinického testování? Jak si vybíráte a co musí splňovat pracoviště, s nímž se rozhodnete spolupracovat? Veškerá naše spolupracující pracoviště musí splňovat velmi přísné legislativní požadavky související s nakládáním s lidskými buňkami a tkáněmi. Povolení, jako je například statut odběrového zařízení, díky kterému pak subjekt může odebírat lidské buňky či tkáně a následně s nimi manipulovat, ať už pro případ výzkumu či výroby, uděluje Státní ústav pro kontrolu léčiv, a to na základě striktního auditu. Mezi organizace, s nimiž v oblasti vědy a výzkumu kooperujeme, patří především velké fakultní nemocnice. V případě potenciální spolupráce oslovujeme vždy jednotlivě daná zdravotnická zařízení na základě jejich specializace a zkušeností. Možnosti spolupráce jsou však veliké. Kupříkladu Národní Centrum Tkání a Buněk a.s. je rozděleno do čtyř oddělení oddělení moderní terapie, buněčné terapie, 3D kultura kmenových buněk na nanovlákenném nosiči tkáňové terapie a materiálového inženýrství, přičemž každé z nich se zabývá výzkumem a vývojem nových produktů. Se zahájením provozu centra 4MEDi se tyto možnosti dále rozšíří, a to o diagnostiku, farmakologii, toxikologii, molekulární genetiku apod. Bude-li mít kdokoliv zájem o spolupráci, rádi to uvítáme. Neustále hledáme nové možnosti v oblasti diagnostiky. Tento trend bude pravděpodobně pokračovat ještě mnoho let. Jsme otevřeni všem inovacím. Invence, nové postupy a nápady patří k naší každodenní práci. Vědeckotechnický park 4MEDI je spolufinancován z programu OPPI Prosperita. ING. MICHAL ZAHRADNÍČEK, MBA PRIMECELL THERAPEUTICS A. S. JÁCHYMOVA 26/2, 110 00 PRAHA 1 e-mail: michal.zahradnicek@primecell.cz EVA KRÁLOVÁ e-mail: ekralova@beckman.com Nanovlákenné nosiče ve skenovacím elektronovém mikroskopu Informační magazín IN VITRO DIAGNOSTIKA 24-2013 5
Delsa Max nový přístroj k charakterizaci nanočástic Společnost Beckman Coulter se již od svých samých začátků věnuje vývoji a výrobě přístrojů k měření vlastností nano a mikročástic. Nejnovějším reprezentantem v tomto ohledu je přístroj Delsa Max, který měří velikosti, elektrokinetický (zeta) potenciál a molekulové hmotnosti nanočástic. Delsa Max pracuje na principu rozptylu laserového záření. Dodává se ve dvou variantách Delsa Max Core a Delsa Max Pro. Druhá z nich může být rozšířena o Delsa Max Assist. Delsa Max Core měří velikosti nanočástic a jejich molekulové hmotnosti. Svazek z laseru s vlnovou délkou 658 nm a nastavitelným výkonem 10 100 mw vstupuje do měřené kapaliny s nanočásticemi. Rozptýlené záření je detekováno dvěma detektory pod úhlem 90. Jeden měří dynamický rozptyl světla, z něhož se určí difuzní koeficient částic. Z tohoto koeficientu je pak, pomocí Einsteinovy formule pro Brownův pohyb, stanoven jejich hydrodynamický průměr. Druhý detektor měří statický rozptyl, který vypovídá o molekulové hmotnosti nanočástic. Obrázek č. 1: Delsa Max Pro a Delsa Max Assist Delsa Max Core pracuje s velmi malým množstvím vzorku může být minimálně 1,25 µl. Zásluhou korelátoru snímajícího 512 kanálů současně jsou měřící časy velmi krátké, minimálně je to 1 sekunda. Přístroj porovnává velikosti částic v rozsahu 0,4 nm až 5 µm, rozsah měřitelných molekulových hmotností se pohybuje v rozmezí 300 Da až 106 Da. Rozsah teplot vzorku při měření činí -15 150 C v křemenné kyvetě a -15 80 C v plastikové kyvetě na jedno použití. Verze Delsa Max Pro je určena pro měření velikostí nanočástic a jejich zeta potenciálu. Laserový paprsek o vlnové délce 532 nm (a výkonem laseru 50 mw) je rozptylován nanočásticemi v kapalném prostředí. Rozptýlené světlo je detekováno soustavou 31 detektorů měřících současně. Podobně jako u Delsa Max Core je velikost stanovována pomocí dynamického rozptylu světla. Analýza signálu u zeta potenciálu se provádí metodou Phase Analysis Light Scattering (PALS). Geometrie je blízká uspořádání zpětného rozptylu s úhlem větším než 170. Minimální množství vzorku činí 45 µl pro měření velikosti a 170 µl u zeta potenciálu. Rozsah velikostí nanočástic při měření zeta potenciálu je 1 nm až 15 µm. 6 Obrázek č. 2: Zobrazení rozdělení velikostí nanočástic v software Delsa Max
Teplotní rozsah se pohybuje v rozmezí 4 70 C. Delsa Max Pro se dá propojit s dalšími zařízeními, jako je např. autosampler u HPLC. Pro odstranění případných bublin v měřící cele lze k přístroji integrovat Delsa Max Assist, který zvýšením tlaku v systému potlačí jejich tvorbu. U řady aplikací, kdy k tvorbě bublin dochází v důsledku přiložení elektrického pole na vzorek, je natlakování jediná možnost, jak experiment úspěšně provést. Uživatelsky přístupný software umožňuje nastavení přístroje, analýzu dat a jejich export. Obsahuje také databázi hodnot indexů lomu, viskozit a dielektrických konstant pro 200 nejběžněji používaných rozpouštědel. Může být nainstalován na více počítačích tak, aby všichni uživatelé v dané skupině mohli nezávisle pracovat i se svými dříve naměřenými daty. Svými parametry (přehled hlavních parametrů naleznete v tabulce), především malým množstvím vzorku a rychlostí měření, je Delsa Max přístroj zaměřený na výzkum proteinů. Ale dobře se dá použít také u dalších aplikací v biologii a výzkumu nanočástic. Samozřejmostí je kvalifikovaný servis a aplikační podpora s techniky lokalizovanými v České republice. Delsa Max Core Rozsah měřených velikostí (průměr částic) 0,4 nm až 5 µm Rozsah molekulových hmotností 300 Da až 106 Da Rozsah měřených teplot -15 150 C (křemenná kyveta) -15 80 C (plastová kyveta) Minimální množství vzorku 1,25 µl Minimální doba měření 1 sec Citlivost 0,1 mg/ml lysozomů Delsa Max Pro Rozsah měřených velikostí (průměr částic) 0,4 nm až 5 µm Rozsah velikostí u měření zeta potenciálu 1 nm až 15 µl Rozsah měřených teplot 4 70 C Minimální množství vzorku velikosti 45 µl Minimální množství vzorku zeta potenciál 170 µl Minimální doba měření 1 sec MARTIN POLČÍK e-mail: mpolcik@beckman.com Citlivost velikosti Citlivost zeta potenciál 0,1 mg/ml lysozomů 1 mg/ml lysozomů Novinka v laboratorní automatizaci Beckman Coulter prezentuje nový automatizační prvek robotické rameno SCARA, které se používá k přenášení laboratorních destiček. Uchopení lze provádět za kratší i delší hranu destiček (portrait a landscape). Maximální rozsah pohybu ve vertikálním směru je 750mm s rychlostí až 500mm/sec. Nejvýšší přenášená hmotnost je 1kg. Reprodukovatelnost je 0.3mm. Přístroj lze integrovat do automatizačních systémů pomocí řady rozhraní RS 232, TCP/IP, RS 485 a digitální I/O. Informační magazín IN VITRO DIAGNOSTIKA 24-2013 7
Velikostní výběr fragmentů nukleových kyselin pomocí kitu Agencourt SPRIselect Standardním procesem pro výběr určitých velikostí fragmentů nukleových kyselin (NK) nebo amplikonů cdna pro Next Gene sekvenování (NGS) je jejich vyřezání z agarosového gelu po provedené elektroforetické separaci. Tento postup je ale časově náročný a nedovoluje jednoduše zpracovat větší množství vzorků. Beckman Coulter za tímto účelem vyrábí kit Agencourt SPRIselect založený na technologii SPRI (Solid Phase Reverse Immobilization) s použitím paramagnetických kuliček. SPRI technologie byla vyvinuta ve Whitehead Institutu (MA, USA) a poprvé byla použita v projektu HUGO (sekvenování lidského genomu) pro izolaci a přečištění NK. Komerčně je používána v kitech Agencourt, z nich je např. AMPure XP doporučovaný všemi výrobci NGS pro přípravu knihoven fragmentů NK. Povrch SPRI kuliček je pokryt karboxylovými skupinami, které oproti běžně používaným silanovým povrchům výrazně snižují nespecifickou vazbu jiných biomolekul. Spolu s uniformní velikostí kuliček (1 µm ± 8 %) je zajištěna vysoká čistota a reprodukovatelnost výtěžků (> 90 %) eluovaných NK. Oproti soupravám na bázi kolonek lze kity Agencourt lehce používat jak manuálně pro jednotlivé vzorky, tak pro velké množství celý proces automatizovat pomocí pipetovacích stanic Biomek od společnosti Beckman Coulter. Souprava SPRIselect je vhodná pro purifikaci libovolného výběru velikostních fragmentů v rozsahu 150 800 bp. Kit obsahuje jen lahvičku suspenze SPRI kuliček ve vazebném pufru (obr. č. 1). Dodávané objemy jsou 5 ml (PN B23317), 60 ml (PN B23318) a 450 ml (PN B23319). K jeho použití není potřeba centrifuga, ani vakuová pumpa, jen magnet, pipety, zkumavky a etanol. Trik s výběrem různých velikostních fragmentů NK spočívá v proměnlivých poměrech objemu suspenze SPRI kuliček k objemu výchozího vzorku. Obecně platí, že se na SPRI kuličky váží přednostně delší fragmenty NK, zvyšováním poměru objemu suspenze SPRI kuliček vzhledem k objemu vzorku se zvětšuje vazba kratších fragmentů Obrázek č. 1: Balení soupravy Agencourt SPRIselect NK. Nastavením určitých poměrů objemu suspenze SPRI kuliček vzhledem k objemu vzorku umožňuje volit rozsah kratších nebo delších fragmentů NK. Výběr delších fragmentů NK (Left Side Selection) Na elektroforegramu (obr. č. 2) jsou barevně znázorněny velikostní distribuce fragmentů NK z výchozího vzorku fragmentované gdna 8
(červená křivka, 20 ng/µl) po separaci pomocí kitu Agencourt SPRIselect. U křivek jsou uvedeny použité násobky objemu suspenze SPRI kuliček smíchávaných v prvním kroku protokolu, a to vzhledem k objemu vzorku (obr. č. 3). Navázané fragmenty NK na paramagnetických kuličkách se po imobilizaci na stěny zkumavky pomocí magnetu promyjí etanolem a eluují. Větší koncentrace SPRI kuliček má za následek širší výběr směrem k menším velikostem fragmentů (obr. č. 2). Výběr kratších fragmentů NK (Right Side Selection) Pro získání kratších fragmentů se v prvním kroku protokolu smíchají v grafu (obr. č. 4) uvedené násobky objemu suspenze SPRI kuliček se vzorkem. Po separaci na magnetu se supernatant s nenavázanými fragmenty NK přenese a smíchá s nadbytkem nové suspenze SPRI kuliček. Provede se promytí etanolem a eluce NK. Menší koncentrace SPRI kuliček v prvním kroku separace (obr. č. 5) má za následek širší výběr směrem k větším velikostem fragmentů. Obrázek č. 2: Elektroforegram velikostní distribuce vzorků po výběru větších fragmentů NK (Left Side Selection) Výběr volitelného rozsahu fragmentů velikosti 150 800 bp (Double Size Selection) Kombinací obou postupů pak volíme libovolný rozsah fragmentů velikostně mezi 150 800 bp. Nejprve se provede výběr větších fragmentů (Left Side Selection), následně pak selekce menších fragmentů (Right Side Selection). Obecné pravidlo pro tento postup zní, že poměr objemu SPRI kuliček v prvním kroku (Left Side Selection) musí být vždy větší než v druhém kroku (Right Side Selection). Obrázek č. 3: Postup separace větších fragmentů NK (Left Side Selection) Více informací o soupravách Agencourt naleznete na stránkách: www.beckman.cz/agencourt, nebo www.beckman.cz/spriselect. Agencourt, AMPure, Biomek a SPRI jsou registrované obchodní značky společnosti Beckman Coulter, Inc. MARTIN MÁŠA e-mail: mmasa@beckman.com Obrázek č. 4: Elektroforegram velikostní distribuce vzorků po výběru kratších fragmentů NK (Right Side Selection) Obrázek č. 5: Postup separace kratších fragmentů NK (Right Side Selection) Informační magazín IN VITRO DIAGNOSTIKA 24-2013 9
Instalace prvního 5laserového sorteru MoFlo XDP v České republice Počátkem letošního roku naše společnost nainstalovala první 5laserový buněčný sorter MoFlo XDP v České republice, a to v laboratoři Centra pro výzkum globální změny AV ČR v Drásově u Brna. Ta se intenzivně zabývá pokročilým studiem fotosyntetických mikroorganismů a jejich potenciálním praktickým využitím v blízké budoucnosti. Systém MoFLo XDP je v dané konfiguraci vybaven lasery 488 nm (modrý), 642 nm (červený), 405 nm (fialový), 561 nm (žlutý) a 594 nm (oranžový) s regulací jejich výkonů, 11 detektory pro fluorescence, 4cestným sortováním a ochranou vytříděných částic (buněk) proti kontaminaci. Široké spektrum vlnových délek laserů umožňuje uživateli volitelně měnit optimální excitační podmínky v závislosti na druhu fluorochromu analyzovaného fotoautotrofního organizmu (mikrořasy). Otevřená koncepce sorteru navíc zabezpečí maximální jednoduchost a flexibilitu při výměně optických filtrů a tím velmi jednoduchou optimalizaci celého experimentu. Díky skutečně vysoké dosahované čistotě sortovaných populací (více než 99 %) a zároveň vysoké viabilitě a vitalitě je možné vytříděné buňky dále snadno kultivovat či provádět jiné pokročilé analýzy. ROMAN VLČEK e-mail: rvlcek@beckman.com 10
Vysokokapacitní třídění jako nástroj pro moderní šlechtění fotosyntetických mikroorganismů Řasy a sinice (dále jen mikrořasy) nabyly v posledních letech na významu pro svůj potenciál k produkci cenných molekul od terapeutických proteinů až po biopaliva. Tyto produkty nacházejí využití zejména v oblasti výživy a zdravotnictví, zejména s ohledem na kompatibilitu a bezpečnost pro lidský organismus. Mezi další významné produkty patří vedle vitamínů, antioxidantů, antibiotik a různých druhů pigmentů také obnovitelné zdroje biopaliv jako např. biovodík, uhlovodíky, bioethanol a lipidy. Většina mikrořas produkuje tyto sloučeniny přirozeně. Jsou to však zároveň organizmy vhodné pro genetickou manipulaci a pro použití vysokokapacitních analytických metod, např. vysokoprůtokovou neinvazivní analýzu optických signálů. Mikrořasy jsou navíc jedinečné pro svou schopnost získávat obnovitelnou energii pomocí procesu fotosyntézy v kombinaci s řízenou optimalizací mikrořasových kultivací, což je činí potenciálně cennými organizmy pro ekonomicky efektivní využití v průmyslovém měřítku výrobních procesů 21. století. Z nepřeberného množství mikrořas (k dnešnímu dni jsou evidovány desetitisíce druhů) je nutné identifikovat a optimalizovat konkrétní kandidáty pro získání cílového produktu. To je jeden z cílů Oddělení adaptačních biotechnologií Centra výzkumu globální změny AV ČR, které využívá potenciálu nově vybudované infrastruktury zahrnující baterii deseti moderních fotobioreaktorů a mikroskopie v průtoku s vysokým rozlišením spolu s třídičkou buněk jako inovativní platformy k optimalizaci a šlechtění mikrořas. Konkrétně lze funkci baterie bioreaktorů popsat jako řízený centralizovaným systémem, jenž umožňuje optimalizaci podmínek vedoucích k rychlému nalezení produkčního optima s využitím multidimenzionální validace dat z průtokové cytometrie a mikroskopie s vysokým rozlišením. V dalším kroku jsou pak za pomoci vysokokapacitní třídičky buněk aplikovány techniky šlechtění pro vybranou skupinu (podpopulaci) kultivovaných buněk na základě identifikovaných optimálních podmínek pro akumulaci žádaného produktu. Vybraná podpopulace buněk je následně znovu kultivována v bioreaktorech a případně dále šlechtěna s cílem ověřit dlouhodobou stabilitu a zachovat vybrané vlastnosti v této nové populaci, dokud nebude dosaženo vyšlechtění nové populace super-mikrořas. Centrum výzkumu globální změny AV ČR, v.v.i. vzniklo v Brně v lednu 2011. Svou činností navazuje na téměř dvacetiletou tradici základního výzkumu problematiky globální změny, uhlíkového cyklu a ekofyziologie produkčních procesů rostlin, který byl realizován na Ústavu systémové biologie a ekologie v oblasti Rámcových programů Evropské unie již od počátku 90. let. Novou významnou aktivitou Centra je projekt Operačního programu Věda a výzkum pro inovace nazvaný CzechGlobe Centrum pro studium dopadů globální změny klimatu, jehož cílem je vybudování výzkumné infrastruktury, která umožní komplexní výzkum problematiky globální změny. Tato výzkumná infrastruktura je financována především z prostředků Evropské unie. Na řešení výzkumných programů se podílejí vědecké týmy, spolupracující se špičkovými odborníky z vědeckých a vzdělávacích institucí z nejrůznějších koutů světa. S pomocí nejmodernějších postupů a přístrojového vybavení je realizován výzkum ve třech základních segmentech působení globální změny: ATMOSFÉRA vývoj klimatu, jeho modelování EKOSYSTÉMY uhlíkový cyklus, dopady globální změny na biologickou rozmanitost SOCIO-EKONOMICKÉ SYSTÉMY dopady na rozvoj a chování společnosti. Nedílnou součástí Centra CzechGlobe jsou aktivity směřující k rozvoji inovačních technologických postupů, návrhům opatření pro adaptaci a vzdělávací činnosti. ING. JAN ČERVENÝ, PH.D. e-mail: cerveny.j@czechglobe.cz RNDR. DIANA BÚZOVÁ, PH.D. e-mail: buzova.d@czechglobe.cz CENTRUM VÝZKUMU GLOBÁLNÍ ZMĚNY AV ČR, V.V.I. DRÁSOV 470, 664 24 DRÁSOV Informační magazín IN VITRO DIAGNOSTIKA 24-2013 11
Nové monoklonální protilátky pro průtokovou cytometrii Nové monoklonální protilátky a reagencie jsou určeny jak pro základní cytometry se 488nm laserem, tak pro systémy vybavené červeným 633 640nm a fialovým 405 nm laserem. Obj. číslo Popis Fluorochrom Počet testů Klon Izotyp B25330 CD1a FITC 1 ml BL6 IgG1 mouse B30634 CD279 PE 1 ml PD1.3 IgG2b mouse B30647 CD86 PC5.5 0,5 ml HA5.2B7 IgG2b mouse B23132 Myeloperoxidase PC.5 0,5 ml CLB-MPO-1 IgG2a mouse B30641 CD62L PC7 0,5 ml DREG56 IgG1 mouse B30631 CD161 (NKR-P1) PC7 0,5 ml 191B8 IgG2a mouse B30636 CD40 APC 0,5 ml MAB89 IgG1 mouse B30639 CD62L APC 0,5 ml DREG56 IgG1 mouse B30642 CD80 APC 0,5 ml MAB104 IgG1 mouse B30633 CD279 APC 0,5 ml PD1.3 IgG2b mouse B12111 CD2 APC-AlexaFluor700 0,5 ml 39C1.5 IgG2a rat B30635 CD27 Pacific Blue 0,5 ml 1A4CD27 IgG1 mouse B09683 CD38 Pacific Blue 0,5 ml LS198-4-3 IgG1 mouse B30640 CD62L Pacific Blue 0,5 ml DREG56 IgG1 mouse B30649 CD90 Pacific Blue 0,5 ml Thy-1/310 IgG1 mouse B29559 Lineage-PE PE 100 testů B30655 IgM FITC 50 t./1 ml SA-DA4 IgG1 mouse B30657 IgM PE 50 t./1 ml SA-DA4 IgG1 mouse B30656 IgM Pacific Blue 0,5 ml SA-DA4 IgG1 mouse B30652 IgD FITC 1 ml IA6-2 IgG2a mouse B30653 IgD PE 1 ml IA6-2 IgG2a mouse Lineage-PE Cocktail Liquid (2 ml, 100 testů, objednací číslo B29559) Nová reagencie, která obsahuje monoklonální protilátky CD3, CD14, CD19, CD20 a CD56 značené fykoerytrinem. Je určena do panelu pro stanovení dendritických buněk, jež jsou na tyto znaky negativní. Negativním gatingem je možné obohatit populaci dendritických buněk pro hodnocení průtokovou cytometrií. Lineage-PE koktejl v kombinaci s CD11c a HLA-DR umožňuje odlišení mezi myeloidními dendritickými buňkami (Lineage- CD11c+ HLA DR+) a plasmacytoidními dendritickými buňkami (Lineage- CD11c- HLA DR+). Vhodným postupem pro stanovení dendritických buněk je například použití kombinace CD45-Krome Orange, HLA-DR-Pacific Blue, CD11c-PC7, Lineage-PE, CD1c-PE-Cy5.5, CD16-FITC, Clec9-APC, CD123-APC-A700 s lýzou pomocí VersaLyse s fixací. Složení mab 1 mab 2 mab 3 mab 4 mab 5 Specificita CD3 CD14 CD19 CD20 CD56 Klon UCHT1 RMO52 J3-119 B9E9 N901 Izotyp IgG1mouse IgG2a mouse IgG1mouse IgG2a mouse IgG1mouse Další možnost, jak stanovovat dendritické buňky, jsou kombinace jednotlivých monoklonálních protilátek nebo jejich koktejly. Obj. číslo Popis Fluorochrom Počet testů Klon A07405 CD14+16-FITC / CD85k-PE / CD33-PC5 FITC-PE-PC5 50 RMO52+3G8/ZM3.8/D3HL60 A07412 CD14+16-FITC / CD85k-PE / CD123-PC5 FITC-PE-PC5 50 RMO52+3G8/ZM3.8/SSDCLY107D2 12