Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy Strana 1 Mikrofluidní bioaplikace
Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy Strana 2 Mikrofluidní aplikace pro bioanalýzu Transport, dávkování, promíchávání a adresování vzorků, pufrů a dalších elektrolytů. Homogenní a heterogenní biologické interakce typu ligand-receptor. Separace biologických molekul. Detekce a kvantifikace biologických složek. Zařízení integrující některé nebo všechny předešlé kroky.
Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy Strana 3 Typická zařízení pro mikrofluidní bioaplikace Kapilární/mikrokanálkové elektroforetické a isoelektrické fokusační systémy. Dielektroforetické a elektroosmotické třídiče a koncentrátory. Mikrokanálkové struktury pro řízený elektrokinetický transport vzorků. Mikrofluidní čipy pro proteinovou analýzu s různým stupněm integrace. Vysoce integrované mikrofluidní čipy pro analýzu DNA/RNA. Mikrofluidní PCR systémy. Kontinuálně pracující biosenzory. Průtokové cytometry
Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy Strana 4 PCR polymerázová řetězová reakce Metoda používaná ke zmnožení molekuly DNA ze vzorku Ke zmnožení je dostačující jedna kopie DNA molekuly, z toho plyne citlivost metody na kontaminaci vzorku biologickým materiálem Metoda je založena na řízeném střídání teplotních cyklů, kdy dochází ke zmnožování DNA rychlostí 2 n, kde n je počet teplotních cyklů Cykly se skládají z následujících kroků denaturace dvojšroubovice DNA při 92-95 C hybridizace primeru na specifické místo ssdna 62 C syntéza komplementárního řetězce termofilní DNA polymerázou 68-80 C Řízení teplotního režimu je klíčovým problémem PCR metody V mikrofluidice je kvalitní řízení teplotního režimu umožněno vysokým poměrem teplosměnné plochy vůči reakčnímu objemu Aplikace: selektivní výběr DNA, zesílení a kvantifikace, diagnostika nemocí
Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy Strana 5 Mikrofluidní čip pro dynamickou PCR V dynamickém uspořádání protéká roztok obsahující vzorek DNA, primery, báze a DNA polymerázu opakovaně různými teplotními zónami. Amplifikace molekul DNA (cca 30 cyklů) trvá obvykle kolem 30 minut. Transport reakční směsi je obvykle proveden elektroosmoticky.
Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy Strana 6 Dynamická PCR v zařízení se segmentovaným tokem V každé červené kapce probíhá amplifikace DNA. Jednotlivé kapky jsou odděleny olejovou fází. Kapky proudí v mikrokanálech v různých teplotních zónách dochází k amplifikaci. Jedná se o kontinuální sériové uspořádání PCR. IMM Mainz.
Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy Přednáška #12 Strana 7 Digital PCR - Quantification (0, 1) https://www.thermofisher.com/cz/en/home/life-science/pcr/digital-pcr.html - Real time PCR - (1) non-specific fluorescent dyes that intercalate with any double-stranded DNA, and (2) sequence-specific DNA probes consisting of oligonucleotides that are labelled with a fluorescent reporter which permits detection only after hybridization of the probe with its complementary sequence
Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy Strana 8 Mikrofluidní čip pro stacionární PCR Ve stacionárním uspořádání je vzorek a ostatní komponenty umístěn v mikrofluidní komoře. Pomocí topných tělísek je měněna okolní teplota v požadovaných cyklech. Běžně je dosahováno rychlosti změn teploty okolo 30 C s -1. Toto uspořádání je typické pro klasické PCR systémy, kde je ovšem dosahováno mnohem pomalejších změn teploty. Mikrofluidní čipy jsou náchylnější na kontaminaci DNA kvůli vysoké vzájemné afinitě používaných konstrukčních materiálů a biologických molekul.
Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy Strana 9 Příklady komerčních PCR čipů Stacionární PCR Dynamická PCR Tradiční PCR http://www.scientificdealers.com/product/pcr-machine/26 http://www.directindustry.com/prod/eppendorf/product-22548-1479501.html
Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy Strana 10 Elektroforéza Separační metoda založená na různé pohyblivosti iontů ve vloženém elektrickém poli. Obvykle jsou separovány velké molekuly biologického původu fragmenty DNA, proteiny atd. K separaci dochází, pokud molekuly nesou odlišný efektivní elektrický náboj nebo se liší jejich molekulové hmotnosti. Nárůst molekulové hmotnosti koreluje s poklesem difúzního koeficientu složky. Separace je obvykle prováděna na stacionárním médiu (vrstvě gelu) nebo v mikrokapiláře/mikrokanálku s axiálně vloženým stejnosměrným elektrickým napětím Molekuly s odlišnou pohyblivostí se rozdělí do separovaných zón. Velikost a poloha zón vypovídají o kvantitativním a kvalitativním složení separované směsi. K elektroforetickému systému je připojen detektor.
Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy Strana 11 Princip kapilární elektroforézy v mikrofluidních systémech Odpadní rezervoár W Rezervoár mobilní fáze - pufru Směr toku separovaných částic Odpadní rezervoár B Separační kanál Detektor W S Dávkování vzorku Rezervoár vzorku Zdroj stejnosměrného elektrického napětí
Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy Strana 12 Využití elektroforézy elektroforetické kapilární pole Radiální matice separačních kanálků 96 kanálové mikrozařízení určené pro elektroforetickou separaci molekul DNA. Zařízení je opatřeno fluorescenčním detektorem. Separační kanál má průměr 200 mm. Kanálky dávkovacích zařízení mají šíři 110 mm a hloubku 50 mm. Délka separačních kanálů je 33 mm. Dávkovací zařízení
Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy Strana 13 Využití elektroforézy automatizované 96-kapilárové zařízení pro separaci DNA 96 jamkové destička se vzorky DNA Separační kapiláry Zdroj vysokého napětí Fluorescenční detektor
Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy Přednáška #12 Strana 14 Lidský genom obsahuje cca 3 bilióny bází - přibližně 25000 genů - Human genome project: completed in 2003 (trval 13 let, stál okolo - $2,7 bilionů - náročný) - Nyní orientace na zlepšení forenzních technik a ke zlepšení lidských podmínek (predikce zdravotních rizik, personalized medicine, jak gen ovlivňuje kódovaný protein a jeho funkčnost) NIH (National Institute of Health) = cena sekvenování jednoho genomu okolo 1000USD Místo, kde může mikrofluidika významě pomoci
Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy Přednáška #12 Strana 15 Sekvenování DNA: Sangerova metoda http://www.techcouncil.org/the-sanger-dna-sequencing-methods-1
Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy Strana 16 384-kanálová kapilární zařízení pro sekvenování DNA Zařízení slouží k detekci různě velkých fragmentů DNA vzniklých syntézou komplementárního řetězce DNA při sekvenování. Každá báze je označena specifickou značkou (jednou ze čtyř), jejíž přítomnost je možno detekovat pomocí laserem indukované fluorescence. Z pořadí detekovaných zón a barvy lze určit sekvenci bazí.
Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy Strana 17 Příklad komerčních sekvenovacích zařízení s integrovanou kapilární elektroforézou MegaBACE 4000 Capillary Array (jedno pole obsahuje 64 kapilár). Přístroj lze dále rozšířit.
Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy Strana 18 Využití elektroforézy příprava koncentrovaného analytu Polopropustná vrstva DF Schéma koncentrátoru Zvýšení koncentrace vzorku Přivedení vzorku DF Odvedení koncentrátu na separaci
Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy Přednáška #12 Strana 19 Next generation sequencing technology Prepare Genomic DNA Sample Attach DNA to the surface Bridge amplication Fragments become double stranded Denature the doublestranded molecules Complete amplification Determine first base Image first base Determine second base Image second base
Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy Přednáška #12 Strana 20 Sequencing over multiple chemistries Align data
Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy Strana 21 Isoelektrická fokusace Separační metoda využívající odlišnosti hodnoty isoelektrického bodu různých biomolekul. Isoelektrický bod odpovídá hodnotě ph, kdy daná molekula nese celkově nulový elektrický náboj. Pokud je hodnota ph nižší, biomolekula získává celkově kladný elektrický náboj. Pro hodnoty ph vyšší je náboj biomolekuly celkově záporný. Fokusační metoda je založena na faktu, že biologická molekula migruje v elektrickém poli pouze tehdy, pokud je její celkový elektrický náboj nenulový. Jestliže je molekula transportována do oblasti, kde hodnota ph je rovna isoelektrickému bodu, její migrace se zastaví. V tomto místě může být poté detekována. Obvykle je používáno sériové uspořádání (viz dále). Mikrofluidní systémy umožňují také paralelní uspořádání.
Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy Strana 22 Isoelektrická fokusace Klasické sériové uspořádání s imobilizovaným gradientem ph V klasickém uspořádání je vytvořen sendvič skládající se z gelových komůrek oddělených membránami. V každé komůrce je pomocí pufru nastavena určitá hodnota ph. Komůrky jsou řazeny v sérii tak, aby hodnota ph monotónně klesala nebo rostla. Na systém je vloženo elektrické pole a do některé komory je vložen vzorek obsahující biologické molekuly. Ty se poté migrují do komor, kde je hodnota ph blízká jejich isoelektrickému bodu.
Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy Strana 23 Paralelní uspořádání komor s různou hodnotou ph Isoelektrická fokusace V paralelním uspořádání jsou komůrky s rozdílně nastavenými hodnotami ph odděleny nepropustnou přepážkou. V mikrofluidice je možno vytvořit velké pole komůrek s velmi malým charakteristickým rozměrem. Kolmo k tomuto komůrkovému poli je vložen gradient elektrického potenciálu a vzorek obsahující biologické molekuly je umístěn nad a/nebo pod komorami. Biomolekuly jsou poté separovány podle svého isoelektrického bodu v odpovídajících komůrkách. Uvedené řešení výrazně urychluje fokusaci vzhledem ke krátkým transportním vzdálenostem v laterálním směru. Je možno také využít automatických detektorů.
Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy Přednáška #12 Strana 24 SDS-PAGE Western blot Nterminus antibody T Sch 250 150 100 75 50 25 10