1 Přístrojové zajištění derivatizačních a detekčních metod Většina derivatizačních reakcí v kapalném fázi (homogenní prostředí) často v tzv. reaktoru (standardizované) např. Pico-Tag čistě chemické reakce (viz předchozí), také der. postupy zprostředkované enzymatickou reakci před- a post-kolonová reakce je-li derivatizační reaktor stabilní součástí chromatografu, označuje se spojení on-line x off-line alespoň výhledově se bude použití on-line metod stále více rozšiřovat, i když samozřejmě jejich použití není univerzální. Asi největší překážkou k jejich většímu využití je přístrojová náročnost a samozřejmě cena. Z hlediska přípravy vzorku vyžadují mnohem menší objemy vzorků, na druhou stranu však nejsou všechny v současnosti používané techniky vhodné k těmto účelům (např. extrakce kapalina-kapalina). Materiály pro on-line kombinaci bývají dražší, na druhou stranu jsou nižší náklady na chemikálie, např. rozpouštědla a výhodnější je menší časová náročnost. Předkolonová derivatizace off-line umožňuje drastické podmínky; není časové omezení; nemusí být 100%, ale reprodukovatelná; derivatizační činidlo mísitelné s mob. fází nebo odstranit = rozpustný pouze analyzovaný produkt; off-line lze použít ke zvýšení hydrofobicity a tím z hydrofilní matrice izolovat analyty, jež jsou předmětem zájmu, snadněji než bez derivatizace on-line podmínky a) der. činidla v mob. fázi netěkavá a chemicky stálá b) vznikající produkty rozpustné v mob. fázi c) musí probíhat v malém objemu d) relativně rychlé výhody: nevýhoda: menší množství vzorku všechny složky systému, tj. derivatizační reagencie, rozpouštědla a všechny produkty rozpustné v dané mobilní fázi a eluovatelné daným analytickým systémem Postkolonová derivatizce off-line zřídka používané jímání frakcí, obtížná automatizace (stanovení fosfátu ve fosfolipidech). Bohužel k tomuto systému off-line jsme velmi často tlačeni přístrojovou dostupností (např. MALDI, ale i NMR atd.) on-line v současnosti nejběžnější spřažení metod (viz dále); tyto kombinace zachovávají separační účinnost použité analytické metody, kterou jinak velmi potlačíme systémem off-line (sběrem frakcí) Derivatizace biol. vzorků v homogenním prostředí problematická (tvorba sraženin) = úprava před analýzou (viz předchozí přednáška) nebo derivatizace na pevné fázi (zakotvena na nosiči) Výhody: Postkolonové reaktory 1. použít publikované separační postupy 2. vznik vedlejších produktů není tak závažný jako u předkolonové derivatizace 3. reakce nemusí probíhat kvantitativně a reakční produkty nemusí být stálé. Reakce ale musí být reprodukovatelná, potřebujeme 2. čerpadlo
2 A) Otevřený tubulární reaktor Nejjednodušší trubička (skleněná, křemenná, nerez. ocel, polytetrafluoroethylen PTFE) stočená do kruhu nebo podobně, ještě lepší spirálně stočený. Rychlé reakce (do 1 min), při použití spletených reaktorů (spletená vlákna) až několik minut B) Náplňové reaktory trubice z nerez. oceli plněná nosičem (většinou skleněné perličky 10-15 µm), reakční doba 0,5-4 min). Dnes: spíše aktivní nosič než inertní materiál ionexy, redoxní činidla, nosiče obohacené katalyzátorem nebo nosiče s imobilizovanými enzymy = označ. reaktory s tuhou fází C) Reaktory se segmentovaným tokem v analyzátorech s kontinuálním průtokem (1969 - AA) Přerušení, segmentace, sloupce protékající kapaliny vzduchem nebo inertním plynem brání difůzi separované zóny. K segmentaci lze také použít nemísitelné kapaliny (voda-organika). 2 nejdůl. faktory ovlivňující účinnost reaktoru jsou smáčivost stěny a segmentační frekvence. Lze využít reakce probíhající až desítky minut použití v praxi zejména tam, kde fungují jako extrakční soustava velkou pozornost výběru rozpouštědel smáčivost trubice má velký význam na účinnost zařízení před vstupem do detektoru je třeba odstranit segmenty plynu (org. kapaliny) T separátory využívají rozdílné povrchové smáčivosti různých materiálů (PTFE-sklo; vatička PTFE) membránové separátory nejdřív PTFE membrána, nyní sendvič (střední část z PTFE, obě sousední z oceli) D) Reaktory z porézních a dutých vláken odstraňují problém vznikající z nedokonalého mísení efluentu s reagenciemi, minimální příspěvek k rozšíření separovaných zón vlákna (trubičky) ze spletených PTFE vláken v nádobce plněné vhodným činidlem (např. alkalizace NaOH konverze na UV absorbující produkty) E) Fotochemické reaktory nefluoreskující na fluoreskující nebo elektroaktivní produkty kapilára křemenná, temperovaná (teplotní fluktuace reakční kinetika) F) Zdvojené reaktory každý reaktor na jiném principu 1 ohřátím k hydrolýze 2 ozářením na fluoreskující produkty G) Enzymové reaktory zakotvená fáze na nosičích (agarosa, celulóza, polyakrylamid, sklo, silikagel) nejobvyklejší úprava povrchu nosiče aminopropylem a následná aktivace glutaraldehydem, pak se koordinuje enzym jako ligand Aplikace zásadně rychlé reakce
3 Redoxní reakce pro elekrochemickou detekci (amperometrie, coulometrie, potenciometrie) nebo pro přímé převedení analytu na fluoreskující sloučeninu vitamin K redukcí vyniká hydrochinon (flourimetricky) postkolonová generace jodu nebo bromu I nebo Br reagují se separovanými látkami a přebytek halogenu je detekován amperometricky často používána je postkolonová oxidace vedoucí ke vzniku fluoreskujících produktů aminocukry redukční vlastnosti, např. redukují měďnatou sůl bis(1,10-fenanthrolinu), vzniklý bis(1,10-fenanthrolin) měďný se amperometricky reooxiduje na Ag/AgCl elektrodě Hydrolytické reakce např. kortisol na fluoreskující produkty účinkem HCl Chemiluminiscenční reakce citlivé a selektivní stanovení řady látek vázaných (hydrofobně) na bílkoviny nebo fosfolipidy 3 systémy využívající: 1) deriváty kys. šťavelové (peroxyoxalátová), 2) lucigenin, 3) luminol Termálně iniciované reakce AA ninhydrin Komplexotvorné reakce pomalé = málo rozšířené nepřímá fluormetrie iontů kovů (viz následující přednáška o stanovení kovů Postkolonové on-line derivatizační reakce viz tab. Enzymové reakce Imobilizované enzymy (předkolonové úpravy), např. β-glukoronidáza k analýze estriolových glukuronidů produkt estriol
4 Detektory Absorbance molární extinkční koeficient je specifický pro každou molekulu UV cutoff sole a aditiva zvýšení vlnové délky a absorbance a) fixní vlnová délka b) variabilní vlnová délka c) skenující (rychle skenující 10-20x /s) d) photodiode array (výhoda spektrum, obr.) výhody vysoká citlivost, selektivita X univerzálnost (200 nm), nízké pozadí umožňuje gradientovou eluci, nedestruktivní, snadné nevýhody analys musí absorbovat, vln. délka ne pod cutoff, odpověď je rozdílná pro jednotlivé látky Index lomu (Refractive Index) porovnává index lomu čisté mobilní fáze s fází obsahující analyt; může být positivní i negativní 3 způsoby: deflekce (ohyb), Fresnel odraz a interference deflekce měří difrakci (ohyb) světelného paprsku procházejícího skrz celu Fresnel odraz měří intenzitu odraženého paprsku na rozhraní kapaliny a skleněného bloku. Dva světelné paprsky prochází skleněným hranolem a pak jdou do dvou foto cel (referenční a vzorková), detektor měří rozdíly mezi jejich ohybem světla interferometrický design využívá spliterů (štěpení) k rozdělení paprsku před vzorkovou a referenční celou a jeho znovu-spojení při detekci. Jestliže je rozdíl v jejich obsahu rozdíl v optické délce - může být konstruktivní nebo destruktivní Aplikace: size-exclusion chromatography (izokrat. separace), polymery a proteiny, cukry. Skoro pro všechny látky (mimo ty, které mají index lomu podobný jako mob. fáze), nedestruktivní, střední citlivost vhodné pro preparativní chromatografii, změna s teplotou (změna hustoty), zpětný tlak rovněž mění hustotu Fluorescenční přirozená fluor. benzen a deriváty (bílkoviny tryptofan, tyrosin jako UV) absorbuje energii ve specifické vlnové délce (excitační), dosahuje excitovaný stav a pak se vrací do původního stavu emisí světla při delší vln. délce (emisní λ) Vysoká selektivita (2 vln. délky) a citlivost (laser!!!!) hlavní nevýhoda- rozdílné vln. délky pro každou látku, derivatizace Elektrochemické detektory měří elektrická data z roztoků pomocí 2 elektrod Amperometrické nejčastější pod názvem amperometrická detekce, kdy vzorek prochází elektrolytickou reakcí - po aplikaci konstatního napětí je měřen výsledný proud v čase. Pro látky které jsou snadno oxidovatelné nebo redukovatelné (aromatické aminy a fenoly) extrémně selektivní pouze molekula, která je oxidovatelná nebo redukovatelná pracovní napětím může být detekována mob. fáze elektrochemicky inertní, disociovatelný elektrolyt
5 vysoká citlivost modifikace pulzní amperometrie Coulometric (voltametrický) modifikace amper., totální konverze všech molekul reakcí způsobeno velkou pórezní grafitovou pracovní elektrodou nebo pomalým průtokem mob. fáze; citliva metoda, ale produkuje mnoho šumu = limita detekce obdobná Vodivostní detekce elchem. detekce k detekci iontů. Roztok bohatý na ionty je lepší vodič proudu než roztok málo ionty. Konstantní napětí v cele detektoru a měří se proud v čase. Hlavně pro analýzu organických a anorganických iontů eluovaných z iontově-výměnných kolon. Citlivé, ale neselektivní Aplikace: katecholaminy Radioaktivní pevná nebo průtoková cela (scintilační koktejl) Rozptyl světla Mnohaúhlový rozptyl laserového světla (Multi-Angle Laser Light Scattering Detector) interakce světla a hmoty když světlo udeří do hmoty, způsobí dočasný dipól v molekule který osciluje ve frekvenci dopadajícího světla. Když se molekula vrací do původního stavu, emituje světlo v různých směrech Celkový rozptyl světla je přímo úměrný molek. hmotnosti a koncentraci (software v sérii s UV či RI k určení koncentrace) Určení Mw větší než 10.000 (není přesné pro menší než 5.000) Evaporative Light Scattering (odpařovací rozptyl světla) univerzální detektor, k detekci všech látek méně těkavých než mob. fáze výtok z kolony zmlžen (nebulizován), vytvořena jednotná mlha která je zahřáta k odstranění těkavého rozpouštědla netěkavý analyt prochází skrz celu, kde rozptýlí paprsek ze zdroje světla Aplikace: cukry, lipidy (x jiné metody); kompatibilita s gradientem výhody: univerzálnost, gradient, nezávislý na teplotě nelineární kalibrační křivka Corona Detekce nabitého aerosolu (Charged Aerosol Detector) Měření náboje spojeného s částicí analytu. Náboj je v přímém poměru k množství analytu ve vzorku. Detekce netěkavých analytů včetně těch bez chromoforu. Odpověď detektoru nezávisí na optických vlastnostech analytu (jako u UV/VIS detekce) nebo ionizovatelnosti (jako u MS hmotnostní spektrometrie) Postup: 1) Přeměna analytu na částice (rozprášení, odpaření rozpouštědla) 2) Proud kladně nabitého plynu se srazí s částicemi analytu náboj je přenesen na částice (větší částice, větší náboj); náboj získá plyn (N 2 ) průchodem skrz vysokonapěťový platinový korónový nabíječ (corona charger)
6 3) Částice jsou převedeny do kolektoru kde je změřen vysoce citlivým elektrometrem. Alternativa k ostatním detektorům (hlavně netěkavé analyty: od lipidů po proteiny, DNA, oligosaccharidy, aminokyseliny, cukry, léčiva, ba i ionty), Univerzální detektor, citlivost až pikogramy. Nepřímá detekce princip fyzikální náhrada přidávané, dobře detekovatelné složky (chromoforu, fluoroforu nebo iontu) sledovaným analytem. Nejjednodušším mechanismem je zředění mobilní fáze vstupujícím analytem Univerzálnost nepřímá UV nejběžnější; do mobilní fáze se přidává UV-aktivní látka -proba fig 4.1 smysl zobrazení píků je určován druhem anal. vzorku. Analyty, které nenesou žádný náboj a nebo mají stejný náboj jako proba negativní píky, nenabité analyty poskytují positivní píky, pokud jsou tak polární, že se eluují před systémovým píkem obr. 4.2 Smysl píku závisí na náboji solutu a jeho retenci relativně k použité probě a je nezávislý na množství dávkované látky (obr. 4.3, tab. 4.1) Pokud má analyzovaný solut podobné detekční vlastnosti jako přidaná proba výsledek je součet detek. vlastností proby a solutu (DOPA, dihydroxyfenylalanin obr. 4.4) Volba složek aby sledovaný analyt byl eluován v těsné blízkosti proby (docílíme jak změnou koncentrace použité proby, tak změna hydrofobních vlastností tuhé fáze (čím vyšší obsah alkylů v solutu, tím hydrofobnější musí být proba a tím méně hydrofobní musí být adsorbent) CE: kationty (nízké ph) imidazol, N,N-dimethyl benzylamin, on-column chelatace (hydroxymáselná kys.) anionty obrátit EOF chromát, pyromelitat, benzoát, naftyl sulfonát Spřažené techniky spřažené techniky kombinace separačního potupu s technikou založenou na zcela odlišném principu nebo kombinace dvou a více separačních technik důležitost multi*dimenzionálnosti Hmotnostní detektor hmotnostní detektor univerzální, strukturální informace, interface k HPLC, nyní za atmosférického tlaku - účely: 1) přeměnit analyt v roztoku na ionty v plynné fázi (ESI, APCI i APPI) produkuje ionty za atmosférického tlaku; rozdíl jak jsou ionty tvořeny 2) odstranění HPLC rozpouštědla; k zamezení kolizí iontu analytu s rozpouštědlem vakum (typicky 10-5 torru); jakmile je iont vytvořen ionty v mobilní fázi dopraveny do MS skrz kapiláru a sérii clon, které redukují tlak systému; ionty jsou filtrovány a detekovány na základě poměru hmota k náboji Ionizace elektrosprejem produkce iontů začíná s nabitými polárními analyty v HPLC rozpouštědle. LC eluent je rozprášen
7 (nebulizován) do komory za atmosférického tlaku v přítomnosti silného elektrostatického pole a vyhřátého sušícího plynu. Eluent špička jehly vysoké napětí a tlak proudu plynu aerosol nabitých kapének; odpařování nabitý analyt migruje k povrchu, kapénka exploduje menší nabité kapénky; když aerosol analytu dosáhne kritického rozměru (10 nm) ionty analytu vytrženy z kapénky do plyné fáze; tyto ionty jsou přitahovány a prochází skrz kapiláru do hmotnostního analyzátoru Vhodnost: velké biomolekuly (proteiny, peptidy, oligonukleotidy); mají často více než 1 náboj, proto lze analyzovat až 150 000 (3000 m/z) Chemická ionizace x ESI tvoří ionty v plynné fázi (spíš než v HPLC eluentu) analyt musí mít určitou těkavost. HPLC eluent je zmlžen ve vyhřívané komoře (analyt i solvent vypařen); korónový výboj ionizuje páry rozpouštědla ( vybíjené elektrony) ionty rozpouštědla předají náboj molekulám analytu chemickými reakcemi (chemická ionizace) Vhodnost: široká oblast polárních a nepol. látek, Mw menší než 1.500, ne pro nestabilní látky, normal-phase HPLC, protože většinou nepolární látky Fotoionizace Relativně nová metoda, jako při APCI vybíjecí lampa produkuje fotony v úzké oblasti ionizačních energií (opatrně zvolena k ionizaci co největšího množství molekul analytu a přitom k minimalizaci ionizace molekul rozpouštědla) vzniklé ionty jdou skrz kapiláru do hmotn. analyzátoru Možnosti uspořádání ESI Pufry a mobilní fáze Detektory Quadrupól 4 paralení tyče ve čtverci; ionty analytu jdou skrz; napětí na tyče generuje elektromagnetické pole toto pole určuje, který poměr hmota/náboj iontů projde filtrem v daném čase, nejjednodušší a nejlevnější 2 módy: scan a SIM Time-of-flight stejná elektromagnet. síla je aplikována na všechny ionty ve stejném čase, udělí jim akceleraci k letu dolů trubicí; lehčí ionty cestují rychleji a dosáhnou detektor první poměry hmota/náboj iontů jsou určeny dle času příletu široké hmotnostní spektrum, přesné stanovení Iontová past z kruhové elektrody a dvou uzávěrů = dohromady komůrka; ionty vstupující do komůrky jsou chyceny elektromagnetickým polem. Jiné pole může být aplikováno k selektivnímu vypuštění iontů z pasti. Výhoda může sloužit k mnohonásobné hmot. detekci bez dalšího hmotnostního analyzátoru Jiná spřažení: s ICP-MS (inductively coupled), AAS, AES, NMR atd, ale i SPE, mikrodialýza
8 GC detekce MS FTIR infračervená spektroskopie (Fourierova transformace); složky separované GC postupují do světelné trubice kde absorbují infračervené záření vycházející ze zdroje; Fourierova transformace interferogramu poskytuje IR spektrum, které lze použít jak k detekci dané látky, tak k její identifikaci, příp. určení čistoty FID flame ionization detection plamenový ionizační detektor ECD electron-capture elektron zachycení FPD flame photometric det. plamenový fotometr NPD nitrogen phosphorus det. (dusík fosfor detekce) TCD thermal conductivity det. (tepelně vodivostní det.) MALDI-MS (Matrix assisted laser desorption/ionization /TOF time-of-flight makromolekulární látky jsou uloženy do lože nízkomolekulární matrice (značný přebytek, látky schopny absorbovat světlo laserového paprsku). Po krátkém ozáření laserem dochází k iradiaci vzorku a k současné desorpci a ionizaci sledované látky, která vykazuje minimální nebo žádnou absorpci při vlnové délce použitého laseru peptidy, proteiny, nukl. kys., glykokonjugáty bílkovin matrice: kys. hydroxyskořicová