ÚSTAV FYZIKÁLNÍ BIOLOGIE JIHOČESKÁ UNIVERZITA V ČESKÝCH BUDĚJOVICÍCH ZPRÁVA O UKONČENÍ PROJEKTU Projekt Název projektu: Multilocus sequence analysis as a tool for robust phylogeny in heterocytous cyanobacteria Průběh řešení projektu : V průběhu řešení projektu byly splněny všechny hlavní cíle stanovené v původním návrhu. Bylo shromážděno několik desítek izolátů málo prostudovaných zástupců terestrických heterocytózních sinic r. Scytonema, Brasilonema, Microchaete, Tolypothrix a dalších, a přibližně 20 environmentálních vzorků obtížně kultivovatelných sinic r. Stigonema a Petalonema pro amplifikaci z izolovaných buněk (single cells). Vzorky pocházejí z široké škály geografických oblastí včetně málo prostudovaných tropických oblastí (Filipíny, Havajské ostrovy, Kostarika) a lokalit v temperátním pásmu (Evropa, USA). V úvodní části projektu byla podrobně zpracována fylogeneze celé skupiny (Nostocales) na základě všech kvalitních (> cca 800 bp) sekvencí z databáze GenBank a vlastních sekvencí získaných před zahájením a v průběhu práce na projektu. Tato fylogenetická studie představuje dosud nejkompletnější a nejaktuálnější přehled o evoluci heterocytózních sinic a bude využita v několika připravovaných publikacích a v důležité monografii řádu Nostocales (viz výsledky). Na základě výsledků této předběžné analýzy byly vybrány vhodné kmeny pro testování multilokusové analýzy (Tab. 1., Obr. 1.). Hlavním cílem projektu byla optimalizace multilokusové fylogenetické analýzy pro použití na vzorky terestrických heterocytózních sinic. V průběhu projektu byly na fylogeneticky reprezentativním výběru kmenů testovány primery a PCR protokoly pro amplifikaci pěti široce využívaných lokusů s použitím dříve publikovaných prací s vlastními úpravami (Tab. 2.). Dosud byla optimalizována amplifikace a sekvenace tří různých markerů.
Dalším cílem projektu bylo zavedení metod izolace jednotlivých buněk (single cells) obtížně kultivovatelných zástupců pro molekulární analýzu. Tato metodika byla úspěšně optimalizována pro relativně širokou škálu vzorků r. Stigonema, u kterých se zdařilo z izolovaných buněk amplifikovat gen pro 16S rrna (Obr. 1., Tab. 1.). Vzhledem k náročné optimalizaci izolace buněk a navazujících PCR protokolů nebyly u těchto vzorků dosud studovány ostatní markery. Byly též učiněny pokusy o amplifikaci celého genomu z buněk metodou multiple displacement amplification (MDA, Ishoey et al. 2008). Tato metoda přinesla úspěch pouze u jednoho vzorku a bude vyžadovat další optimalizaci. Dosažené výsledky: Byla zpracována celková fylogenetická analýza heterocytózních sinic na základě všech dostupných dat z databáze GenBank a vlastních nepublikovaných sekvencí zástupců méně prostudovaných čeledí Microchaetaceae, Stigonemataceae, Rivulariaceae a Scytonemataceae. Výsledky fylogenetické analýzy budou mimo vlastního projektu a navazujících studií použity pro 2 další publikace, které jsou v současnosti v recenzním řízení nebo v přípravě do tisku: 1. Komárek J. & Mareš J. (2012): Modern taxonomy (2011) of freshwater planktic heterocytous cyanobacteria. - Submitted to Hydrobiologia. 2. Komárek J. (2012): Cyanoprokaryota. 3. Teil: Nostocales. Süβwasserflora von Mitteleuropa 19/3. - Spektrum Akademischer Verlag, Elsevier GmbH, München, in prep. Na základě stromu byli vybráni zástupci fylogenetických větví, které dosud nebyly studovány pomocí multilokusové analýzy (viz Obr. 1.). Vybrané kmeny posloužily k testování zvolených markerů, které se běžně využívají zejména ve studiích zaměřených na planktonní typy heterocytózních sinic (Rajaniemi et al. 2005, Lyra et al. 2005, Moreira et al. 2011). Doposud byla provedena optimalizace PCR pro tyto testovací kmeny a sekvenace 3 vybraných lokusů - rbclx, rpoc1 a nifd (viz. Tab. 2. a 3.). Fungující protokoly budou využity v nejbližší době pro konstrukci statisticky robustního fylogenetického stromu heterocytózních sinic a dále v následných podrobných studiích jednotlivých skupin (Scytonemataceae, Stigonemataceae, Microchaetaceae, Rivulariaceae).
Tabulka č. 1. Vybrané kmeny heterocytózních sinic použité v rámci projektu pro testování markerů a single-cell PCR. Název vorku Původ Izolace / Sekvence Brasilonema sp. F20B II. Filipíny 16S+ITS r, rbclx, rpoc1, nifd Scytonema sp. F26 II. Filipíny 16S+ITS r, rbclx, rpoc1, nifd Tolypothrix sp. T3 nárost, skleník, bot. zahrada Teplice 16S+ITS r, rbclx, rpoc1, nifd Scytonema hyalinum Havaj 16S+ITS r, rbclx, rpoc1, nifd Scytonema sp. F26 III. Filipíny 16S+ITS r, rbclx, rpoc1, nifd Scytonematopsis sp. Sic09 kámen, Cava Grande di Cassibile, Sicílie 16S+ITS r, rbclx, rpoc1, nifd Microchaete sp. T10 nárost, skleník, bot. zahrada Teplice 16S+ITS r, rbclx, rpoc1 Tolypothrix distorta CCALA 194 půda, květináč, Nizozemsko 16S+ITS r, rbclx, rpoc1 Stigonema cf. mammilosum 5-4 CR Stigonema mammilosum Nor. 2007 Stigonema mammilosum CDBWA Stigonema cf. tomentosum CAT1C Stigonema ocellatum CAT1 IIII Stigonema informe CAT5C Stigonema hormoides CAT3A Stigonema ocellatum NRO Stigonema cf. mammilosum CDBWD Stigonema panniforme CZ Stigonema panniforme Hawaii kámen, horský mlžný les, Kostarika kámen, potok, Norsko skalní stěna, Great vlhký kámen, Great Smoky Mts., USA vlhký kámen, Great Smoky Mts., USA kámen, Great kámen, Great mrtvé dřevo, Great kámen, Great skála, Holubovské hadce, CZ skála, ostrov Kauai, Havaj
V rámci testování metod pro analýzu izolovaných buněk (single-cells) byla úspěšně optimalizována amplifikace genu pro z buněk u 11 vybraných kmenů r. Stigonema (Tab. 1, Obr. 1.). Opakovaná sekvenace buněk ze všech vzorků potvrdila reprodukovatelnost výsedků. Fylogenetická analýza potvrdila existenci monofyletického rodu Stigonema a upřesnila jeho postavení v rámci systému sinic. Genomová amplifikace (MDA), PCR amplifikace dalších markerů, a studium dalších nekultivovatelných sinic nebyly dosud dokončeny nebo zoptimalizovány a jsou v plánu v následujícím roce. Tabulka č. 2. Testované primery pro multilokusovou analýzu. primer sekvence cíl zdroj úspěšnost* HEPF 5 -TTT GGG GTT AAC TTT TTT GGG CAT AGT C-3 mcye Jungblut & Neilan 2006? 1 HEPR 5 -AAT TCT TGA GGC TGT AAA TCG GGT TT-3 mcye Jungblut & Neilan 2006? 1 mcye-f2 5 -GAA ATT TGT GTA GAA GGT GC-3 mcye Rantala et al. 2004 - mcye-r4 5 -AAT TCT AAA GCC CAA AGA CG-3 mcye Rantala et al. 2004 - nifd552-f 5 -TCC GKG GKG TDT CTC AGT C-3 nifd Roeselers et al. 2007 78% nifd861-r 5 -CGR CWG ATR TAG TTC AT-3 nifd Roeselers et al. 2007 78% nifd-f 5 -GAT GGC GAT GTA TGC TGC TAA CAA C-3 nifd Henson et al. 2004 - nifd-r 5 -GTA CGG AAG TAA GCA ACG CAA CCT TG-3 nifd Henson et al. 2004 - CW 5 -CGT AGC TTC CGG TGG TAT CCA CGT-3 rbclx Rudi et al. 1998 100% CX 5 -GGG GCA GGT AAG AAA GGG TTT CGT A-3 rbclx Rudi et al. 1998 100% rpc/mf 5 -GGT GAR GTN ACN AAR CCA GAR AC-3 rpoc1 Seo & Yokota 2003 100% rpc/cr-1 5 -CCA GAR TAG TCN ACC CGT TTA CC-3 rpoc1 Seo & Yokota 2003 100% GB/3MF 5 -AAG CGH CCN GSN ATG TAY ATH GG-3 gyrb Seo & Yokota 2003 - GB/CR-2 5 -CCN GCN GAR TCN CCY TCN AC-3 gyrb Seo & Yokota 2003 - gyrb-f 5 -GGC ATC ATT TCA CCC AAA CCT TTG-3 gyrb vlastní design - gyrb-r 5 -ATG ACG AGC AGT TAC AGT GCC GA-3 gyrb vlastní design - * vztahuje se k 9 vybraným kmenům pro testování multilokusových markerů 1 dosud není dokončena optimalizace PCR
Obrázek č. 1. strom heterocytózních sinic (Maximum likelihood, 512 boostrap replikací, phyml GTR+G+I, 168 OTUs). Modrá čára rod Stigonema, tučně jsou vyznačeny sekvence získané po PCR amplifikaci single cells; zelené šipky fylogenetické větve, v rámci kterých již byla provedena multilokusová analýza jinými autory; červené šipky fylogenetické větve, ze kterých byli vybráni zástupci pro multilokusovou analýzu v rámci projektu.
Stav čerpání finančních prostředků: Byly vyčerpány veškeré finanční prostředky na nákup laboratorního materiálu pro molekulární analýzy podle navrženého rozpočtu, viz Tabulku č. 3. Byla zakoupena učebnice bioinformatiky Beginning Perl for Bioinformatics (Tisdall, J. 2001, O Reilly Media, USA) v hodnotě 700 Kč. Tabulka č. 3. Čerpání finančních prostředků (materiál). Popis materiálu Cena včetně DPH (Kč) Qiagen REPLI-g Mini Kit (100) - 1x 17280 Invisorb Fragment CleanUp, 250 purifications - 1x 9116 2X Red PCR Master mix; 500 reactions - 2x 12362 Rukavice latexové nezaprašované S - 40x 5680 Rukavice latexové nezaprašované M - 10x 1420 Celkem 45858 Využitelnost dosažených výsledků a navazující práce: Výsledky projektu budou použity v řadě navazujících prací v rámci dlouhodobého výzkumu evoluce a taxonomie heterocytózních sinic v naší laboratoři. Fylogenetický strom vypočtený v průběhu projektu z dat je součástí dvou publikací v recenzním řízení a nadále bude využíván jako základní srovnávací model pro další studie. Optimalizované protokoly pro amplifikaci 3 dalších markerů nám v nejbližších měsících umožní rychle shromáždit data potřebná pro tvorbu fylogenetického stromu Nostocales na základě dosud nejreprezentativnějšího datasetu (4 lokusy, přítomnost sekvencí z málo prostudovaných vývojových větví). Očekáváme odeslání těchto výsledků k publikaci v příštím roce. Multilokusová analýza bude dále využita při řešení projektu GAČR P506/12/1818 zaměřeného na fylogenezi a diverzitu čeledi Scytonemataceae. Důležitým výsledkem je také úspěšné zavedení metodiky sekvenace z izolovaných buněk u nekultivovatelných sinic r. Stigonema. Výsledky této práce budou v příštím roce připraveny k publikaci. Pokud se potvrdí využitelnost i pro další typy sinic, bude se jednat o metodický průlom v současné molekulární taxonomii sinic. V Českých Budějovicích dne 29. 11. 2011 RNDr. Jan Mareš (řešitel projektu)
Literatura: Henson B.J., Hesselbrock S.M., Watson L.E. & Barnum S.R. 2004. Molecular phylogeny of the heterocystous cyanobacteria (subsections IV and V) based on nifd. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 54:493-497. Ishoey T., Woyke T., Stepanauskas R., Novotny M. & Lasken R.S. 2008. Genomic sequencing of single microbial cells from environmental samples. Curr. Opin. Microbiol. 11:198-204. Jungblut A.-D. & Neilan B.A. 2006. Molecular identification and evolution of the cyclic peptide hepatotoxins, microcystin and nodularin, synthetase genes in three orders of cyanobacteria. Arch. Microbiol. 185:107-114. Lyra C., Laamanen M., Lehtimaki J.M., Surakka A. & Sivonen K. 2005. Benthic cyanobacteria of the genus Nodularia are non-toxic, without gas vacuoles, able to glide and genetically more diverse than planktonic Nodularia. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 55:558-568. Moreira C., Fathalli A., Vasconcelos V. & Antunes A. 2011. Genetic diversity and structure of the invasive toxic cyanobacterium Cylindrospermopsis raciborskii. Curr. Microbiol. 62:1590-1595. Rajaniemi P., Hrouzek P., Kaštovská K., Williame R., Rantala A., Hoffmann L., Komárek J. & Sivonen K. 2005: Phylogenetic and morphological evaluation of the genera Anabaena, Aphanizomenon, Trichormus and Nostoc (Nostocales, Cyanobacteria). Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 55:11-26. Rantala A., Fewer D.P., Hisbergues M., Rouhiainen L., Vaitomaa J., Borner T. & Sivonen K. 2004. Phylogenetic evidence for the early evolution of microcystin synthesis. Proc. Nat.l Acad. Sci. U S A 101:568-573. Roeselers G., Stal L.J., van Loosdrecht M.C.M. & Muyzer G. 2007. Development of a PCR for the detection and identification of cyanobacterial nifd genes. J. Microbiol. Meth. 70:550-556. Rudi K., Skulberg O.M. & Jakobsen K.S. 1998. Evolution of Cyanobacteria by exchange of genetic material among phyletically related strains. J. Bacteriol. 180:3453-3461. Seo P-S. & Yokota A. 2003. The phylogenetic relationships of cyanobacteria inferred from 16SrRNA, gyrb, rpoc1 and rpod1 gene sequences. J. Gen. Appl. Microbiol. 49:191-203.