GENETICKÝ POLYMORFISMUS V HFE GENU V ČESKÉ POPULACI

UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ Katedra biochemických věd GENETICKÝ POLYMORFISMUS V HFE GENU V ČESKÉ POPULACI Diplomová práce Školitel: Doc. PharmDr. Martin Beránek, Ph.D. Hradec Králové, 2012 Bc. Barbora Červinková

Prohlašuji, že tato práce je mým původním autorským dílem. Veškerá literatura a další zdroje, z nichž jsem při zpracování čerpala, jsou uvedeny v seznamu použité literatury a v práci řádně citovány. Práce nebyla využita k získání jiného nebo stejného titulu. Souhlasím, aby byla má práce půjčována ke studijním účelům a byla citována dle platných norem. V Hradci Králové dne.. 2

Tímto bych chtěla poděkovat Doc. PharmDr. M. Beránkovi, Ph.D. za odborné vedení, ochotu, trpělivost a připomínky při zpracovávání diplomové práce. Můj dík patří také Mgr. M. Drastíkové a Bc. J. Hegerové za věcné rady a pomoc při práci v laboratoři. Barbora Červinková 3

Abstract Charles University in Prague Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Biochemical Sciences Candidate: Bc. Barbora Červinková Supervisor: Doc. PharmDr. Martin Beránek, Ph.D. Title of diploma work: Genetic polymorphism of the HFE gene in Czech population Outline: The main objective of the thesis was to map the incidence of the three mutations (C282Y, H63D, S65C) in the HFE gene in the Czech population. Consequently, the obtained results were compared with the reported occurrence in the world. Methods: The work involved the isolation of DNA from buccal swabs obtained from 167 donors (65 men, 102 women; average age for men was 31, for women 28). Isolated DNA strings were amplified by PCR methods using 5 CAG ATC CTC ATC TCA CTG 3 and 5 CTG GAT AAC CTT GGC TGT ACC CCC 3 primers for C282Y mutation, 5 GCC ACA TCT GGC TTG AAA TT 3 and 5 ACA TGG TTA AGG CCT GTT GC GCC ACA 3 primers for H63D and S65C mutations. DNA samples were treated with restriction enzymes Rsa I, Bcl I and Hinf I, for C282Y, H63D and S65C mutations, respectively. Finally, the restriction fragments were separated by gel electrophoresis (2 % agarose gel). Results: C282Y mutation was present in 0 (0 %) and 19 (11,38 %) samples as homozygote or heterozygote, respectively. Moreover, C282Y mutation was present in 3 (1,80 %) and 0 (0 %) as combined heterozygote with H63D or S65C mutation, respectively. H63D mutation was present in 3 (1,80 %) and 35 (20,96 %) samples as homozygote or heterozygote, respectively. Furthermore, H63D mutation was present in 0 (0 %) samples as combined heterozygote with S65C mutation. Mutation S65C was present in 0 (0 %) and 2 (1,20 %) samples as homozygote or heterozygote, respectively. Conclusion: The results were compared with outcomes documented in different studies around the world. We found that our results agree with the results of other studies in the Czech Republic. 4

Abstrakt Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Bc. Barbora Červinková Školitel: Doc. PharmDr. Martin Beránek, Ph.D. Název diplomové práce: Genetický polymorfismus v HFE genu v české populaci. Cíl práce: Cílem diplomové práce bylo zmapovat výskyt třech mutací v HFE genu (C282Y, H63D, S65C) u české populace. A následně porovnat získané výsledky s hodnotami hlášenými ze světa. Metody: Práce zahrnovala izolaci DNA ze stěrů bukální sliznice od 167 dárců (65 mužů, 102 žen; věkový průměr mužů byl 31 a žen 28). Získaná DNA byla následně zmnožena prostřednictvím metody PCR za použití primerů 5 CAG ATC CTC ATC TCA CTG 3 a 5 CTG GAT AAC CTT GGC TGT ACC CCC 3 pro C282Y mutaci, 5 GCC ACA TCT GGC TTG AAA TT 3 a 5 ACA TGG TTA AGG CCT GTT GC GCC ACA 3 primerů pro H63D a S65C mutace. Pomocí restrikčního enzymu Rsa I pro C282Y, Bcl I pro H63D, Hinf I pro S65C byl řetězec DNA rozštěpen a získané fragmenty byly odseparovány na 2 % agarózovém gelu metodou gelové elektroforézy. Výsledky: Mutace C282Y byla detekována u 0 (0 %) vzorků jako homozygot, u 3 (1,80 %) vzorků jako složený heterozygot s H63D, u 0 (0 %) vzorků jako složený heterozygot s S65C a u 19 (11,38 %) vzorků, jako samostatná mutace v kombinaci se zdravou alelou. Mutace H63D byla detekována u 3 (1,80 %) vzorků jako homozygot, u 0 (0 %) vzorků jako složený heterozygot s S65C a u 35 (20,96 %) vzorků, jako samostatná mutace v kombinaci se zdravou alelou. Mutace S65C byla detekována u 0 (0 %) vzorků jako homozygot a u 2 (1,20 %) vzorků, jako samostatná mutace v kombinaci se zdravou alelou. Závěr: Námi získané hodnoty byly porovnány s hodnotami ostatních studií, jak z České republiky, tak ze světa. Zjistili jsme, že naše výsledky jsou přibližně stejné jako u jiných studií v České republice. 5

Obsah diplomové práce 1. Úvod a cíle diplomové práce...8 Teoretická část...9 2. Metabolismus železa...9 2.1. Transferin... 10 2.2. Hemoglobin... 10 2.3. Feritin... 11 2.4. Porucha metabolismu železa... 11 2.5. Hepcidin... 12 3. Genetická onemocnění asociovaná s přetížením organismu železem... 14 3.1. Klasická hereditární hemochromatóza... 15 3.2. Juvenilní hereditární hemochromatóza... 15 3.3. Hereditární hemochromatóza třetího typu... 16 3.4. Hereditární hemochromatóza čtvrtého typu... 16 3.5. Epidemiologie geneticky podmíněné hemochromatózy... 16 4. HFE gen... 19 4.1. Popis a lokalizace HFE genu... 19 4.2. Funkce HFE genu... 19 5. Mutace v HFE genu... 21 5.1. Mutace C282Y v HFE genu... 21 5.2. Mutace H63D v HFE genu... 22 5.3. Mutace S65C v HFE genu... 22 5.4. Asociace mutací s vybranými onemocněními... 22 5.5. Frekvence mutací ve zdravé populaci... 24 5.6. Frekvence mutací u postižených hemochromatózou... 31 6. Diagnostika hereditární hemochromatózy... 34 6.1. Kandidát pro vyšetření... 34 6

6.2. Biochemické laboratorní testy... 34 6.3. Molekulárně-biologické laboratorní testy... 35 6.4. Metody molekulární biologie... 36 6.4.1. PCR... 36 6.4.2. Real-time PCR... 38 6.4.3. PCR-RFLP... 38 6.4.4. Sekvenování... 39 7. Terapie hereditární hemochromatózy... 42 Praktická část... 48 8. Použité materiály a přístroje... 48 8.1. Chemikálie... 48 8.2. Přístroje... 50 8.3. Vzorky DNA... 50 8.4. Odběrový materiál... 50 9. Metodiky... 52 9.1. Izolace DNA... 52 9.2. Polymerázová řetězová reakce... 52 9.3. Restrikční polymorfismus délkových fragmentů... 53 9.4. Gelová elektroforéza... 54 9.5. Statistické metody... 57 10. Výsledky... 58 11. Diskuse... 60 12. Závěr... 64 13. Seznam zkratek... 65 14. Literatura... 67 7

1. Úvod a cíle diplomové práce Hereditární hemochromatóza patří mezi časté geneticky podmíněné onemocnění u evropské populace. Jedná se o chorobu, která je charakterizována zvýšeným hromaděním železa v organismu. To je nejdříve ukládáno do jater a v pozdějších stádiích i do ostatních vnitřních orgánů a kůže. Toto onemocnění postihuje rovnoměrně obě pohlaví, častěji se ale manifestuje okolo 40. roku života u mužů. První zmínky o této chorobě jsou datovány od roku 1935, kdy byla označena jako tzv. bronzový diabetes. Gen zodpovědný za její vznik byl, ale popsán mnohem později až v roce 1996. Do dnešní doby bylo popsáno mnoho mutací v tomto genu, z nichž nejčastěji jsou s hereditární hemochromatózou spojeny mutace C282Y, H63D a S65C. Vyšetření mutací probíhá metodami molekulární biologie, nejčastěji kombinací metod PCR-RFLP s detekcí metodou gelové elektroforézy. Včasné vyšetření je velice důležité pro dobrou prognózu onemocnění. V opačném případě může dojít k rozvoji jaterní fibrózy nebo až ke vzniku hepatocelulárního karcinomu. Cílem této diplomové práce bylo provést rešerši dostupné literatury o výskytu výše zmíněných mutací ve světě a v České republice u zdravé i postižené populace. Dále získat informace o nejčastěji se vyskytujících nemocech spojených s mutacemi v HFE genu a seznámit se s různými vyšetřovacími postupy používanými k jejich analýze. V rámci této práce byl proveden také vlastní výzkum vyšetření C282Y, H63D a S65C mutací u zdravých dobrovolníků v České republice. Získané výsledky byly dále porovnány s výsledky ostatních studií provedených v celém světě. 8

Teoretická část 2. Metabolismus železa Železo je důležitý biogenní prvek vyskytující se ve všech živých buňkách od jednobuněčných organismů po savce. Schopnosti atomu železa lehce vázat a uvolňovat elektron se využívá v mnoha vitálních a biochemických reakcích probíhajících v organismu např. při buněčném dýchání, přenosu kyslíku ke tkáním, syntéze DNA aj 1. Pro přenos železa slouží v organismu hlavně bílkovinné transportéry. Rozlišujeme dvě skupiny těchto transportérů, a to hemové a nehemové. Mezi hemové řadíme hemoglobin, myoglobin, tkáňové enzymy aj. Mezi nehemové patří transferin, feritin, oxido-redukční enzymy aj. Kvantitativně nejvýznamnější látkou obsahující železo je hemoglobin sloužící pro transport kyslíku 2. Tělo zdravého dospělého člověka obsahuje 35-45 mg železa na 1 kg hmotnosti, tzn. celkem 3,5-4,5 g železa na organismus. Z toho 2,1 3 g železa jsou obsažené v hemoglobinu, 1 g tvoří zásobní železo, 0,005 g se nachází v plazmě, myoglobin ve svalech a enzymy obsahují stejně po 0,2 g železa. Pokud množství zásobního železa klesne pod 1 g, zvýší se jeho vstřebávání z potravy. Celkově je více železa obsaženo v organismu mužů než žen 2. Denně lidské tělo absorbuje z potravy 1-2 ng železa 22. Mezi příjmem železa a jeho ztrátami (buňkami střevní sliznice, menstruací, krevními ztrátami) je nastavená za fyziologických podmínek rovnováha. Ta je udržována přesnou regulací činnosti buněk, které železo z potravy vstřebávají, spotřebovávají (během erytropoézy) a skladují (hepatocyty, tkáňové makrofágy). Vstřebávání železa probíhá v menší míře v distálních částech tenkého střeva, ale rozhodující funkci pro metabolismus železa má duodenum. V duodenu je alkalické ph a díky tomu probíhá lépe oxidace železa, důležitá pro jeho vstřebávání 2. Hlavním orgánem, který je úzce spjat s koloběhem železa v organismu, jsou játra. Je v nich syntetizována většina proteinů účastnících se transportu železa a jsou bohatou zásobárnou železa. Tento koloběh železa v organismu je naznačen na obrázku č. 1. 9

Obrázek č. 1 Koloběh železa ve zdravém organismu 3 2.1. Transferin Do jater se železo dostává nejčastěji pomocí transferinu dále pak cirkulujícího hemoglobinu, hemu a feritinu. Železo navázané na transferin je nejdříve dopraveno do kostní dřeně, zásobáren železa tzv. poolů a hepatocytů a jeho zbylá část se vyloučí (močí, stolicí, ve formě výstelky cév). Na hepatocyty se transferin váže přes transferinový receptor a proniká do nich endocytózou. Rozlišujeme dva typy transferinových receptorů a to transferinový receptor 1 (TfR1) a transferinový receptor 2 (TfR2). Transportu železa do jater se účastní převážně TrF1, který s transferinem vytváří komplex. Železo je během přenosu do hepatocytů uvolněno z transferinu a redukováno z trojmocného na dvojmocné 3,4. 2.2. Hemoglobin V plazmě se železo vyskytuje ve vazbě na hemoglobin, který se následně váže na bílkovinný přenašeč haptoglobin nebo se štěpí na hem. V komplexu s haptoglobinem je vychytáván makrofágy a během jeho degradace v lysozomech se štěpí na hem a globin. Z hemu je železo uvolněné při jeho degradaci hemoxigenázou 1, dalším produktem této reakce je biliverdin. Hem, uvolněný z hemoglobinu při jeho štěpení v krevní plazmě, se váže na další z řady bílkovinných přenašečů, hemopexin. Jejich komplex je vychytáván na receptorech pro hem-hemopexin a degradován v lysozomech. Hem je následně štěpen hemoxigenázou 1 3,4. 10

2.3. Feritin Další možností transportu železa do jater je feritin. Feritin je protein skládající se z 24 podjednotek tvořících dutinu pro uložení železa. Feritin rozlišujeme ve dvou formách a to tkáňový a plazmatický. Plazmatický feritin prakticky neobsahuje železo. Tkáňový feritin slouží jako skladiště zásobního železa, pokud dojde k tkáňovému poškození je uvolněn do krve a vychytáván játry. Uvnitř hepatocytů dochází k jeho metabolizaci a uložení 4. Játra jako zdroj železa mohou uvolnit rychle jeho velké množství vázané v hepatocytech ve formě feritinu nebo hemosiderinu, a v Kupfferových buňkách. Hlavní a jedinou známou transportní bílkovinou regulující transport železa z buněk přes membránu hepatocytů je ferroportin 1 (FP1). FP1 je exprimován většinou buněk v organismu, zejména hepatocyty, enterocyty a Kupfferovými buňkami. Pokud se železo začne v organismu hromadit, zvyšuje se exprese FP1 na hepatocytech a Kupferových buňkách. Naopak na enterocytech se jeho exprese sníží, aby se zabránilo zvýšenému vstřebávání železa z potravy 4. 2.4. Porucha metabolismu železa Při poruše metabolismu železa může vzniknout jeho nedostatek nebo naopak nadbytek. Nadbytek i nedostatek železa mají za následek závažná poškození organismu. Nedostatkem železa trpí na světě až jedna miliarda lidí, v našich podmínkách je mírný nedostatek poměrně častý hlavně u žen. Příčiny lze rozdělit do čtyř hlavních skupin: nedostatečný příjem železa v potravě, nedostatečné vstřebávání železa při nemocech trávicího ústrojí, zvýšené ztráty železa krvácením a zvýšená spotřeba železa zvláště v období růstu a těhotenství. Nedostatek železa vede po vyčerpání jeho zásob v organismu ke vzniku tzv. sideropenické anemie. Při sideropenické anemii se tvoří menší erytrocyty (mikrocyty) s nižším obsahem hemoglobinu (hypochromní erytrocyty). V krvi klesá koncentrace sérového feritinu a stoupá množství transferinu a exprese transferinových receptorů na hepatocytech. Transferin je kvůli nízké hladině železa v plazmě málo saturovaný. K léčbě pacientů se sideropenickou anemií se používá podávání železa až do doplnění jeho zásob 5. Při nadbytku se železo hromadí v buňkách a orgánech a poškozuje celý organismus. K poškozování organismu dochází tvorbou volných kyslíkových radikálů, 11

oxidací proteinů, lipidů i nukleových kyselin a v neposlední řadě jeho samotným ukládáním železa v orgánech. Přebytečné železo se hromadí hlavně v játrech, kde vzniká jeho zásobní forma hemosiderin, dále pak v kůži, srdci, kloubech, slinivce břišní a jiných endokrinních žlázách. V játrech dochází při nejtěžším postižení ke vzniku cirhózy a následně k hepatocelulárnímu karcinomu. Předpokladem vzniku cirhózy může být vrozená vloha pro fibrogenezi. Hromaděním železa ve slinivce břišní vyvolá zánik buněk Langerhansových ostrůvků a tím dojde ke snížené tvorbě inzulinu, vzniká dieabetes mellitus. Tento typ diabetu byl dříve nazýván bronzový a to kvůli typickému tmavohnědému zbarvení kůže získanému v důsledku ukládání melaninu. Při poškození myokardu v důsledku nahromadění železa může vzniknout kardiomyopatie a arytmie, tento stav často vyústí až k srdečnímu selhání. V kloubech způsobuje železo zvýšenou bolestivost a při poškození žláz s vnitřní sekrecí bývá časté ovlivnění reprodukčních schopností. Nadbytek železa je způsoben jeho zvýšeným příjmem potravou, jeho nadměrným vstřebáváním, zvýšeným katabolismem hemoglobinu u hemolýz a při neefektivní erytropoéze, při poruchách jeho transportu z buněk 5,6. Zvýšené ukládání železa doprovází nejen onemocnění hemochromatózu, ale dále ho můžeme nalézt u anemických onemocnění př. thalasemie, aplastická anemie, sideropenická anemie, u polytransfundovaných pacientů červenými krvinkami, při alkoholismu, při chronickém onemocnění jater typu hepatitid a těžkých hepatopatií, u onemocnění porfyria cutanea tarda, při metabolickém syndromu (spojen se zvýšenou hladinou železa i feritinu v játrech) a u hemodialyzovaných pacientů. Mezi vzácnější typy onemocnění spojené s tímto projevem patří aceruloplasminemie, atransferinemie a neonatální hemochromatóza 20. Studiemi bylo prokázáno, že v našich podmínkách jsou nejčastěji postiženi přetížením železem anemičtí pacienti po mnohačetných transfúzích a pacienti s hereditární hemochromatózou 5,6. 2.5. Hepcidin Nový pohled na regulaci metabolismu železa přineslo v roce 2000 objevení hepcidinu. Polypeptidový hormon hepcidin je kódován genem HAMP, který leží v oblasti 19q13. Hepcidin je jako polypeptid syntetizován v játrech, enterocytech a monocyto-makrofágovém systému. Jeho funkce v makrofázích je antimikrobiální a mezi jeho další účinky patří regulace extracelulárního metabolismu železa, kdy může 12

navodit až degradaci jediného exportéra železa a to ferroportinu, na který má schopnost se vázat. Ferroportin slouží pro transport železa z buňky a pro jeho následné skladování. Koncentrace hepcidinu v organismu úzce koreluje se vstřebáváním železa, jejich závislost je nepřímo úměrná. Při jeho zvýšené exkreci klesá transport železa přes bazolaterální membránu enterocytů a dochází k zadržování železa v monocyto-makrofágovém systému. Na syntézu hepcidinu mají vliv kostní morfologické proteiny, stavy hypoxie a anemie, zánět (přesněji jím produkované cytokiny) a výše zmíněná hladina železa v organismu. Pokud není v organismu optimální množství hepcidinu dochází ke vzniku patologických stavů - nízké hladiny mohou vyvolat stav přetížení železem (hemochromatóza, hepatitida C) a naopak jeho vyšší množství může způsobit onemocnění typu anémie nebo chronické choroby ledvin. Předpokládá se, že úloha hepcidinu ve vztahu k hemochromatóze by mohla být stejně významná a důležitá, jako role inzulinu při diabetu. Přesto je přesný popis mechanismu interakcí mezi HFE proteinem, hepcidinem a ferroportinem dodnes nejasný 6,7. Obrázek č. 2 Vztah hepcidinu a ferroportinu k železu ve zdravém (A) a nemocném (B) organismu 7 13

3. Genetická onemocnění asociovaná s přetížením organismu železem Genetické onemocnění spojené s nadměrným ukládáním železa v různých tkáních organizmu se souhrnně nazývají hemochromatóza. Jedná se o chorobu, jež je pravděpodobně zakořeněna v populaci již od dob starých Keltů. Dnes se domníváme, že zvýšené hromadění železa v těle mohlo představovat biologickou výhodu v období velkých krevních ztrát při válečných zraněních 3. První poznámky o tomto onemocnění se datují k roku 1865, kdy ho Trousseau popsal jako zvláštní formu diabetu s pigmentací kůže. V roce 1889 onemocnění čítající příznaky cirhózy jater, bronzové kůže a diabetu mellitu Recklinghausen označil, jako hereditární hemochromatózu. K těmto znakům se postupně přidávaly další, jako poškození srdce a žláz s vnitřní sekrecí (Scheldon v roce 1935) a postižení kloubů (Schumacher v roce 1964) 12. V roce 1996 byl objeven HFE gen zodpovědný za její vznik. Později bylo zjištěno několik typů hemochromatóz, které se liší nejen mutacemi v různých genech, ale také klinickými projevy. Dnes rozlišujme hereditární hemochromatózu (HHC), juvenilní hemochromatózu, hemochromatózu třetího, čtvrtého a pátého typu 3. Pátý typ vzniká na podkladě mutací v genu FTH1, který kóduje těžký polypeptidový řetězec feritinu. Tato mutace je v posledních letech hlášena z Japonska, kde byla prokázána ve spojitosti s autosomálně dominantní formou HHC 26. Za zmínku stojí i tzv. africká a neonatální hemochromatóza. U afrického typu onemocnění, dříve nazývaného Bantu sideróza s nejasnou dědičností, se předpokládalo, že je ovlivněné konzumací piva vařeného v železných nádobách. Později bylo zjištěno, že nepostihuje jen černochy, kteří požívají toto pivo a žijí v subsaharských oblastech Afriky, ale i afroameričany 3,6. Tato forma siderózy se liší od HHC, tím že se železo nadměrně ukládá nejen do jater, ale i do kostí 23. Neonatální hemochromatóza je onemocnění, postihující novorozence nebo ještě nenarozené plody, vznikající pravděpodobně na aloimunitním podkladě spojené s velmi vážnou prognózou. Pokud se onemocnění začne manifestovat ještě u nenarozeného plodu, vede často k potratu, časnému porodu, popřípadě k retardaci růstu novorozence. Po narození selhávají játra (často má již novorozenec rozvinutou cirhózu jater), hromadící se železo začíná poškozovat orgány - pankreas, srdce, štítná žláza, sliznice úst a nasofaryngu. Jediným řešením této komplikované situace je chelatační terapie (reaguje jen 10-40 % nemocných) a transplantace jater 18. 14

Tato práce je věnována hlavně klasické formě hereditární hemochromatózy, neboť jen ona je spojena s výskytem mutací v HFE genu ostatní typy jsou známé, jako non-hfe hemochromatózy a poměrně vzácné. 3.1. Klasická hereditární hemochromatóza Příčinou HHC je porucha regulace vstřebávání železa, vyvolaná chybnou syntézou HFE proteinu v důsledku mutací v HFE genu. Bylo popsáno již mnoho typů mutací s různou frekvencí výskytu, vzácné typy jsou například E168X, W169X, Q238P a naopak velmi časté C282Y, H63D, S65C 26. Až u 80 % nemocných bylo potvrzeno, že onemocnění vzniklo na podkladě mutace C282Y 12. Popisům nejčastějších typů mutací se dále důkladněji věnuje kapitola 5. Na počátku vzniku onemocnění je železo ukládáno v buňkách parenchymatózních orgánů a později v retikuloendotelu. Nejčastěji se železo akumuluje v játrech, kde v důsledku porušení lysozomů, zvýšené peroxidaci lipidů a přeměně aktivovaných hvězdicovitých buněk na fibroblasty se zvýší tvorba vaziva. Dochází také k aktivaci Kupfferových buněk, které začnou zvýšeně produkovat kyslíkové radikály, a přispívají tak k nekróze hepatocytů. Akumulace železa v hepatocytech má za následek jejich odumírání (sideronekróza) popřípadě apoptózu. Apoptóza hepatocytů je úměrná obsahu železa v játrech 3. S touto poruchou je dále spojen vyšší výskyt onemocnění typu kožní porfyrie, chronická hepatitida B a C, karcinom jater 18. 3.2. Juvenilní hereditární hemochromatóza Prvotním pojmenováním této choroby bylo HHC druhého typu. Později byl název upřesněn a to proto, že postižené geny nepatří do rodiny HFE. Rozlišujeme dva typy mutací pro toto onemocnění - mutace genu pro hemojuvelin (1q21) vyvolávající typ onemocnění 2A a mutace v genu pro hepcidin (19q13) vyvolávající typ onemocnění 2B. K akumulaci železa dochází buď následkem inaktivace hepcidinu (2B) nebo snížením jeho exprese (2A) 3. Jedná se o relativně vzácné autosomálně dědičné onemocnění, postihující rovnoměrně obě pohlaví a manifestující se mezi 20. a 30. rokem života. Toto onemocnění je charakteristické hypogonadotropním hypogonadismem spojeným 15

s hypotyreózou, hepatomegalií, insuficiencí nadledvin, sníženým hladinami hormonů prolaktinu a somatotropinu, smrt nastává často infarktem myokardu 3. 3.3. Hereditární hemochromatóza třetího typu Choroba je vyvolaná mutací v genu kódující transferinový receptor 2 (7q22). Již bylo popsáno několik druhů mutací - substituční bodové, ukončující předčasně translaci (tzv. nonsense) i ty které inkorporují jiné aminokyseliny do bílkovinného řetězce (tzv. missense) a také posunové (tzv. frameshift). Nejčastěji se ale vyskytují tyto čtyři - E60Y, Y250X, M172K a AVAQ594-597del 26. Akumulace železa je pravděpodobně způsobena snížením koncentrace hepcidinu, kvůli porušené funkci transferinového receptoru 2 3. Tato forma autosomálně recesivního dědičného onemocnění je taktéž vzácná a její příznaky se vyskytují u mladších osob. Průběh je však lehčí než u juvenilní formy, ale těžší než u klasické formy HHC. 3.4. Hereditární hemochromatóza čtvrtého typu Též nazývaná ferroportinová choroba je vyvolána mutacemi v genu SLC40A1 (2q32) kódujícím ferroportin. Exprese hepcidinu zde není snížena, naopak může být i zvýšena. Od roku 2001 byly prokázány mutace A77D, N144H a mnohé další. Toto autosomálně dominantní onemocnění se vyskytuje nejčastěji ze všech non-hfe hemochromatóz. Pacienti v důsledku nadměrného ukládání železa do tkání trpí jaterní cirhózou, diabetem a arytmií 3. 3.5. Epidemiologie geneticky podmíněné hemochromatózy Mutace v HFE genu se vyskytují rovnoměrně u mužů i žen. Přesto jsou mezi muži a ženami značné rozdíly v laboratorních nálezech i klinickém obrazu. HHC se výrazně častěji projeví u mužů. Předpokládá se, že s nižším výskytem u žen souvisí vliv menstruačního cyklu popř. těhotenství a porodu 3. Při postižení HFE genu začíná ukládání železa již v dětském věku, ale fyzikální nálezy u mladších nemocných jsou obvykle zcela fyziologické 3. Klinicky se onemocnění začíná manifestovat až mezi 40. a 50. rokem života, kdy tělo nemocného už obsahuje 15 až 20-ti násobně více železa, než tělo zdravého dospělého jedince 12. 16

Všeobecně lze konstatovat, že symptomy provázející toto onemocnění jsou velmi odvislé od věku pacienta, rasy, pohlaví a zásad jeho stravování 19. Různé klinické projevy a stupně závažnosti onemocnění lze dále možná odvodit z přidružených patologií v jiných genech, zapojených do metabolismu železa například v HAMP na chromozomu 19 a HJV na chromozomu 1. Tyto patologie je možné pravděpodobně označovat jako modifikátory onemocnění. Některé studie naznačují, že klinický obraz pacienta může být dále ovlivněn polymorfismy genů kódujících haptoglobin a tumor nekrotizující faktor 7. Klinický obraz posledního stádia plně rozvinuté hemochromatózy je charakteristický poškozením všech výše zmiňovaných orgánů, kde se železo ukládá. Projevy jsou doplněny o slabost a únavu, časté bolesti břicha a úbytek hmotnosti 3. 17

Onemocnění Porušený gen Produkovaný protein Dědičnost onemocnění Funkce proteinu Postižení orgánů První projevy onemocnění Typ 4 Ferroportinová choroba SLC40A1 Ferroportin Autosomálně dominantní Možné ovlivnění vylučování železa ze střevních, jaterních a placentárních buněk. Malé 4. až 5. dekáda života Upravené podle New England Journal of Medicine, 350; 23, June 3, 2004: Classifications as defined by OMIM (Online Mendelaian Inheritance in Man) Typ 1 Klasická HHC HFE HFE Autosomálně recesivní Přerušení vazby mezi transferinem a železem. Možná regulace působení hepcidinu. Různé 4. až 5. dekáda života Typ 2A Juvenilní HHC HJV Hemojuvelin Autosomálně recesivní Neobjasněná. Možná regulace působení hepcidinu. Velké 2. až 3. dekáda života Typ 2B Juvenilní HHC HAMP Hepcidin Autosomálně recesivní Regulace uvolnění železa ve střevních a krevních buňkách. Velké 2. až 3. dekáda života Typ 3 HHC související s TfR2 TfR2 Transferinový rp 2 Autosomálně recesivní Možné ovlivnění příjmu železa hepatocyty. Různé 4. až 5. dekáda života 18

4. HFE gen 4.1. Popis a lokalizace HFE genu HFE gen byl, jak již bylo zmíněno, prvně popsán v roce 1996 Federem a kol. Jedná se o gen z rodiny hlavního histokompatibilního komplexu a kvůli jeho vysoké homologii (asi 58 %) k HLA genům I. třídy byl původně označován jako HLA-H gen. Tento gen, dlouhý 12 kb, který je zobrazen na obrázku č. 3, je lokalizován na krátkém raménku 6. chromozomu 6p21.3. a obsahuje 7 exonů 3. 4.2. Funkce HFE genu Obrázek č. 3 Chromozom 6 25 HFE gen kóduje vznik HFE proteinu, který se skládá z 3 extracelulárních domén α1, α2, α3, transmembránové a cytoplazmatické části. Asociaci s transferinovým receptorem zajišťuje místo mezi α1 a α2 doménou. Pomocí α3 domény interaguje HFE protein s β2-mikroglobulinem, čímž vzniká heterodimer 3. Vzniklý heterodimer je transportován na povrch enterocytu střevních krypt, kde spolu s transferinovým receptorem vytváří komplex a tím reguluje jeho afinitu k transferinu s navázaným železem. Zvýšená exprese HFE proteinu byla prokázána v mnoha tkáních, kde ovlivňuje vstřebávání železa např. játra, epiteliální buňky GIT nebo v buňkách syncytiotrofoblastu 3. Na základě aktuálních informací získaných z jater o stavu nastřádaného železa, z kostní dřeně o stavu krvetvorby a ze vstřebaného železa navázaného na transferin dochází k vyzrávání dvou typů enterocytů z buněk krypt ve střevní sliznici. Prvním typem jsou buňky, které poskytují zpětnou vazbou signál organismu, že má dostatek železa. A druhým typem buněk jsou tzv. enterocyty chudé na železo. Během 19

maturace obou typů buněk dochází k ovlivnění syntézy proteinů regulujících vstřebávání železa, a to ferroportinu, hefestinu, DMT1, Dcytb (viz kapitola první) 3. Pokud dojde k poruše HFE proteinu je následkem poškození regulace metabolismu železa. Dochází k porušení regulace na úrovni tvorby komplexu HFE protein/transferinový receptor/ transferin, tím buňka přichází o informace o množství cirkulujícího železa. Tento fakt vnímá jako nedostatek železa a proto zvýší tvorbu proteinů regulujících vstřebávání železa, tím je železo nadměrně vstřebáváno z potravy. HFE protein dále ovlivňuje expresi hepcidinu v játrech, proto při jeho poškození dochází ke snížení hladin hepcidinu. To má za následek vysílání signálů pro organismus, že železa je nedostatek a vede k dalšímu hromadění 3. 20

5. Mutace v HFE genu Vzhledem k tomu, že hereditární hemochromatóza je autosomálně recesivní typ onemocnění, frekvence jejího výskytu v populaci je odvislá od frekvence výskytu homozygotů. Při mapování výskytu mutací nacházíme jak rasové tak kontinentální rozdíly. Gen bývá nejčastěji postižen třemi mutacemi - C282Y, H63D a S65C. Lokalizace těchto třech typů mutací na HFE proteinu je zobrazena na obrázku č. 4. H63D S65C Těžký α řetězec C282Y Obrázek č. 4 Popis HFE proteinu upravené podle 8 5.1. Mutace C282Y v HFE genu Jedná se o mutaci, která kvůli záměně nukleotidu guaninu za adenin v poloze 845 vede k substituci aminokyseliny tyrosin za cystein v poloze 282 a tím vzniká patologický protein. Důvodem proč mutace C282Y způsobuje přetížení organismu železem je snížení interakcí s TFR2 3,9. Tento fakt má za následek, že železo je 200-300x více vstřebáváno z potravy, než v případě zdravého organismu 19. Je obecně známo, že tato mutace postihuje nejvíce bělochy a u jiných ras se příliš nevyskytuje. Celkem je mutace C282Y společně s H63D nalezena u většiny postižených HHC. U menší části pacientů se potvrdí forma složených heterozygotů, kdy je přítomna varianta mutace buď C282Y/H63D nebo C282Y/S65C 3,9. Studie naznačují, že pacienti s přítomností homozygotní formy mutace C282Y mají vyšší hladiny feritinu 21

a klinické projevy se u nich projeví daleko dříve, než u ostatních postižených jinými mutacemi 26. 5.2. Mutace H63D v HFE genu Kromě majoritní mutace C282Y, která byla objevena jako první byla dále popsána ještě mutace H63D. Je způsobená záměnou guaninu za cytosin v poloze 187, což vyvolá substituci aminokyseliny kyseliny asparágové za histidin v poloze 63 v HFE proteinu. Tato záměna vyvolá ztrátu schopnosti regulovat afinitu TFR2 k transferinu a tím vede k přetížení organismu železem. Mutace se častěji než v kombinaci s mutací C282Y vyskytuje sama, a to až u 40-70 % pacientů 3,9. Pokud se nachází v organismu sama tato mutace, nemá většinou skoro žádný nebo jen malý vliv na hromadění železa a jen zřídka se manifestuje klinickými příznaky 12. 5.3. Mutace S65C v HFE genu Tato populačně nejmladší mutace je lokalizovaná v blízkosti místa mutace H63D a je způsobená substitucí thyminu za adenin v poloze 193 na nukleotidu a vyvolá záměnu aminokyseliny cysteinu za serin v pozici 65 na HFE proteinu 3,9. Její přítomnost nepřináší pacientovi nijak závažná rizika vzniku přetížení železem. Pokud se však vyskytne v kombinaci s mutací C282Y, je pravděpodobnost vzniku onemocnění daleko vyšší 24. 5.4. Asociace mutací s vybranými onemocněními V dlouhodobé studii, která byla prováděna na území USA a prezentována v roce 2010 Zhang a kol., bylo zkoumáno, zda mutace H63D může mít vliv na hodnoty pulzního tlaku (PT = rozdíl systolické a diastolického tlaku). Pro testování bylo vybráno 619 zdravých mužských jedinců (bez astmatu, vyššího krevního tlaku, srdečních onemocnění, cukrovky, aj.), kteří nebyli ve svém životě vystaveni velkému množství olova (bydlení, okolní prostředí, aj.). Právě obsah olova v kostech byl využit pro srovnání PT a mutací v HFE genu. Na základě této studie bylo prokázáno, že hladina olova v kostech byla u jedinců bez přítomné mutace i u jedinců s C282Y nebo H63D mutací skoro shodná, průměrně 21,7 μg/g. Tudíž přítomnost mutace pravděpodobně nemá vliv na ukládání olova, ale pokud byly u pacienta přítomny dva faktory, a to vyšší hladina olova v kostech a mutace v HFE genu, pulzní tlak dosahoval daleko vyšších hodnot než u pacienta s vyšším množstvím olova v kostech, ale bez přítomnosti mutace 22

PT (mmhg) viz obrázek č. 5. Vyšší pulzní tlak zvyšuje u pacientů možnost vzniku aterosklerózy a onemocněním srdce 27. Obsah olova v tibii (μg/g) Obrázek č. 5 Vliv přítomnosti mutace v HFE genu a hladiny olova v kostech na PT upraveno podle 27 Møller a kol. se ve své studii, pokusili zjistit, zda mutace v HFE genu může ovlivnit vznik nebo průběh selhání srdce. Protože je obecně známo, že pacienti s HHC jsou mnohdy postiženi srdečním selháním, nejčastěji kvůli nahromaděnému železu. Do studie bylo zapojeno 667 pacientů, kteří trpěli dušností nebo silnou únavou po mírné námaze a sníženou funkcí levé komory. Pacienti s onemocněním srdce jiného charakteru než selhání byli vyloučeni, stejně tak pacienti se selháním jater a ledvin. Kvůli běžnému nálezu frekvence všech třech typů mutací se nepotvrdil ani vliv mutace na vznik selhání, ani to že by mohla mutace měnit průběh onemocnění 28. Také studie Dunn a kol. se věnovala spojitosti mezi kardiovaskulárním onemocněním a mutacemi v HFE genu, konkrétně se zaměřili na vztah ke kardiomyopatii, úmrtí na srdeční onemocnění a ischemickou chorobu srdeční (ICHS). Testování se zúčastnili pacienti se srdečním onemocněním typu infarkt myokardu, aortální stenóza, bolest na hrudi, mitrální nebo aortální návrat krve. Nebyla prokázána souvislost se vznikem ICHS, ani s úmrtím na kardiovaskulární onemocnění, jak můžeme vidět v tabulce č. 1. Ovlivnění se potvrdilo pouze u podezření na kardiomyopatii, kdy pacienti s nálezem mutace S65C měli 4,4 krát vyšší nález kardiomyopatie než testovaní bez mutace, popřípadě s nálezem jiné mutace 29. V rámci onemocnění srdce lze tedy mutace v HFE genu pravděpodobně 23

vyloučit z podílu na vzniku srdečního selhání 28, ICHS 29 i úmrtí na kardiovaskulární onemocnění 29. C282Y H63D S65C ICHS 1,43 0,66 0,42 a Úmrtí na srdeční onemocnění 1,22 1,11 1,49 a Kardiomyopatie 1,08 1,03 4,36* Tabulka č. 1 Procentuální pravděpodobnost výskytu mutací u zvolených onemocnění upravené podle 29 Poznámky: hodnoty označené a nejsou signifikantní, kvůli malému počtu vzorků. Hodnoty označené * jsou statisticky významné. 5.5. Frekvence mutací ve zdravé populaci V běžné evropské populaci se nejčastěji vyskytuje mutace H63D průměrně u 10-20 % osob, na druhém místě je výskyt mutace C282Y, který se pohybuje v rozmezí 5,1-6,6 % a u mutace S65C v bělošské populaci byla zaznamenána frekvence 0,5-3 % 3,9. Zastoupení všech mutací je znázorněno v grafu č. 1. a to podle jejich výskytu v rámci různých částí Evropy. 16 Výskyt mutací C282Y, H63D a S65C u zdravé evropské populace 14 12 10 8 6 4 C282Y H63D S65C 2 0 Severní Evropa Střední Evropa Jižní Evropa Západní Evropa Východní Evropa Graf č. 1 Procentuální zastoupení jednotlivých mutací u populace v Evropě 9,19,21,22,24,30,40,41,43 V Evropě bylo provedeno mnoho studií zaměřených na výskyt mutace C282Y, souhrnně na základě jimi získaných dat můžeme Evropu rozdělit podle výskytu mutace 24

na čtyři části: více než 11%, 5-10,1 %, 3,2-4 % a méně než 3,2 %. Mutace nejvyššího zastoupení dosahuje v Irsku a to frekvence 14 % 9. Do skupiny s průměrným výskytem mutace 5-5,2 až 10-10,1 % spadá Island (5,1 %) 30, Dánsko (5,6 %) 21, Norsko (6,8 %) 21, Švédsko (5,8 21 ;6,1 30 %), Faerské ostrovy (8,0 %) 30, Francie (6,1 %) 19, Velká Británie (8,3 %) 21, Bretaň 9. V rozmezí 3,2-4 % se vyskytuje v Maďarsku, Finsku, Německu (3,8 % 9 ), Polsku (3,1-3,5 %) 24,19, Rusku (3,5 %), Rakousku, Slovinsku (3,6 %) 24, Chorvatsku (3,4 %), Slovenské (4 %) a České republice (3,4-3,8 %) 24,19. Státy s nižším výskytem než 3,2 % jsou Španělsko (3,0 % 9 ), Portugalsko (2,8 % 9 ), Litva (2,6 %) 21, Bosna a Hercegovina (2,2-4 %) 19,24, Grónsko 2,3 % 9, Srbsko a Černá Hora (1,6 %), Itálie (1,5 % 40 ), Řecko (1,3 % 9 ), Makedonie (1 %). Mutace se téměř nevyskytuje v Rumunsku, Turecku a Bulharsku 19. Na podkladu těchto dat jsme vytvořili následující grafy č. 2 a č. 3, znázorňující výskyt této mutace v Evropě a jejich jednotlivých zemích. Obrázek č. 6 Znázornění frekvence výskytu mutace C282Y u zdravé populace v Evropě a) podle Kucinskas z roku 2011, b) podle Adlera z roku 2011 25

Rozložení výskytu mutace C282Y u zdravé evropské populace Severní Evropa Střední Evropa Jižní Evropa Východní Evropa Západní Evropa Graf č.2 Procentuální výskyt mutace C282Y u zdravé populace v jednotlivých částech Evropy 9,19,21,22,23,24 Poznámky: Do procentuálního průměru byli započítáni tito zástupci zemí Severní Evropy Dánsko, Finsko, Švédsko, Norsko, Grónsko a Litva. Zástupci zemí Střední Evropy Slovinsko, Rakousko, Maďarsko, Polsko, Česká a Slovenská republika. Zástupci zemí Jižní Evropy Itálie, Portugalsko, Řecko, Španělsko, Chorvatsko, Bosna a Hercegovina, Bulharsko, Srbsko a Černá Hora, Makedonie. Zástupci zemí Východní Evropy Litva, Rusko. Zástupci Západní Evropy Francie, Irsko, Velká Británie. Hodnoty z Litvy byly započítány dvakrát, kvůli její severovýchodní poloze. Graf je pouze orientační, protože nebyly dostupné údaje ze všech zemí v dané části Evropy. 14 12 10 8 6 4 2 0 Výskyt mutace C282Y u zdravé populace v evropských státech Graf č.3 Procentuální výskyt mutace C282Y u zdravé populace v jednotlivých zemích Evropy 9,19,21,22,24,40 26

V severoamerické studii bylo u zdravé populace odhaleno 11,4 % osob s mutací C282Y, z toho bylo 0,8 % v homozygotní a 10,8 % v heterozygotní formě 27. Průměrně se ale výskyt pohybuje okolo 5,4 % v populaci 29. Jihoamerická studie z Brazílie uvádí výskyt 2,1 % 36. Výskyt mutace v Brazílii je tedy nižší oproti zdravé evropské i americké populaci tento fakt bývá přisuzován odlišnému etniku a velké různorodosti žijících obyvatel. Jedna z nejnižších prevalencí mutace C282Y je hlášena z Tichomoří a to 0,012 %, ještě nižší byla ale zaznamenána v Asii 0,000039 % 22. Asie je v rámci mnoha studií udávána jako oblast téměř bez zatížení touto mutací. Několik výzkumů toto tvrzení potvrzuje, kdy například výskyt na Thaiwanu je 0,33 % 32, v čínské provincii Zhejiang je 0 % 31, v Korei 0 % 33, Severní a Jižní Číně také 0 % 34. V žádné z těchto studii se nejednalo o malý počet testovaných osob, vždy to bylo v řádech stovek. Mutace H63D se, jako nejčastější mutace u zdravé populace, vyskytuje průměrně stejně často jak v Evropě tak v Severní i Jižní Americe. Evropské státy můžeme rozdělit podle výskytu mutace H63D na dvě části: u horní hranice tj. nad 15 % a spodní hranice tj. pod 15 %. Do kategorie nad 15 % se řadí Španělsko (20 % 9 ), Irsko (17,9 % 9 ), Faerské ostrovy (17,5 %), Portugalsko (16,9 % 21 ), Polsko (16,2 % 21 ), Litva (15,9 %), Srbsko a Černá hora (15,7 % 24 ), Rusko (15,2 % 21 ) a Velká Británie (15,2 % 9 ). Hranice 15 % dosahuje Česká republika 21. Tuto hodnotu potvrzuje i studie Čimburkové a kol. Mutace byla zaznamenána u 1,7 % případů v homozygotní formě a u 26,6 % ve formě heterozygotní 9. Pod hranicí 15 % se nalézají státy Chorvatsko (14,5 % 24 ), Itálie (14 % 40 ), Francie (14 % 41 ), Estonsko (13,6 % 21 ), Řecko (13,5 % 9 ), Dánsko (12,8 % 21 ), Slovinsko (12,8 % 24 ), Slovenská republika (12,7 % 39 ), Švédsko (12,4 % 30 ), Bosna a Hercegovina (11,3 % 24 ), Norsko (11,2 % 30 ), Rakousko (11,1 % 21 ), Island (10,9 % 30 ), Německo (10,8 % 21 ) a nejníže je hladina ve Finsku (10,6 % 21 ). Zastoupení mutace v jednotlivých evropských státech můžeme vidět na obrázku č. 7. Ze všech dat uvedených v odstavcích o výskytu mutace H63D jsme vytvořili grafy č. 4 a 5. 27

Obrázek č. 7 Znázornění frekvence výskytu mutace H63D u zdravé populace v Evropě podle Kucinskas z roku 2011 Rozložení výskytu mutace H63D u zdravé evropské populace Severní Evropa Střední Evropa Západní Evropa Jižní Evropa Graf č. 4 Procentuální výskyt mutace H63D u zdravé populace v jednotlivých částech Evropy 9,21,22,23,24,30,40,41 Poznámky: Do procentuálního průměru byli započítáni tito zástupci zemí Severní Evropy Norsko, Dánsko, Finsko, Litva, Estonsko. Zástupci zemí Střední Evropy Slovinsko, Rakousko, Německo, Polsko, Česká a Slovenská republika. Zástupci zemí Jižní Evropy Itálie, Řecko, Španělsko, Portugalsko, Chorvatsko, Bosna a Hercegovina, Srbsko a Černá Hora. Zástupci zemí Západní Evropy Francie, Irsko, Velká Británie. Zástupci zemí Východní Evropy Estonsko, Litva, Rusko. Hodnoty z Litvy byly započítány dvakrát, kvůli její severovýchodní poloze. Graf je pouze orientační, protože nebyly dostupné údaje ze všech zemí v dané části Evropy. 28

22 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 Výskyt mutace C282Y u zdravé populace v evropských státech Graf č. 5 Procentuální výskyt mutace H63D u zdravé populace v jednotlivých zemích Evropy 9,21,22,23,24,30,39,40 V Severní Americe, konkrétně v USA, byl zaznamenán výskyt mutace H63D u 15 % populace a o trochu nižší je hlášen z Jižní Ameriky, konkrétně z Brazílie, a to 13,6 % 36. S65C je mutace s nejnižším výskytem v Evropě i na ostatních kontinentech. Evropu můžeme rozdělit na tři části s výskytem nad 2 %, pod 2 % a okolo 1 %. Nad 2 %, tedy nejvyšší záchyt, je na území Severní Skandinávie. Podle Čimburkové a kol. může v severní části skandinávském poloostrova být výskyt až 3 % 9, např. ve Finsku 2,3 % 21. U méně než 2 % populace se nachází mutace v Litvě (1,9 %), Chorvatsku, Slovenské republice a Slovinsku (1,8 %), Bretani (1,95 % 21 ), Rusku (1,7 % 43 ), Švédsku (1,6 % 30 ), Dánsku (1,5 % 30 ), Norsku (1,5 % 30 ) a České republice (1,25-1,5 % 3,9 ). V rámci studie probíhající na území České republiky v roce 2005 (celkem 481 osob) nebyl detekován žádný homozygot pro S65C mutaci, ale 12 heterozygotů 9. Nízký záchyt okolo 1 % je hlášen ze Španělska 9, Faerských ostrovů 30 a severní Itálie (0,7 % 24 ). Ze všech uvedených dat jsme pro mutaci S65C vytvořili graf č. 6 a 7. 29

Rozložení výskytu mutace S65C u zdravé evropské populace Severní Evropa Střední Evropa Jižní Evropa Východní Evropa Západní Evropa Graf č. 6. Procentuální výskyt mutace S65C u zdravé populace v jednotlivých částech Evropy 3,9,21,24 Poznámky: Do procentuálního průměru byli započítáni tito zástupci zemí Severní Evropy Dánsko, Finsko, Švédsko, Litva, Norsko. Zástupci zemí Střední Evropy Slovinsko, Česká a Slovenská republika. Zástupci zemí Jižní Evropy Chorvatsko, Itálie, Španělsko. Zástupci zemí Východní Evropy Litva, Rusko. Zástupci zemí Západní Evropy Francie. Hodnoty z Litvy byly započítány dvakrát, kvůli její severovýchodní poloze. Graf je pouze orientační, protože nebyly dostupné údaje ze všech zemí v dané části Evropy. 3 Výskyt mutace S65C u zdravé populace v evropských státech 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Graf č. 7 Procentuální výskyt mutace S65C u zdravé populace v jednotlivých zemích Evropy 3,9,21,24,30,43 30

Velmi nízká incidence mutace S65C byla zaznamenána v Brazílii (0,6 % 36 ) a ještě nižší u hispánské, asijské (konkrétně čínská provincie Zhejiang 0 % 31 ) a africké populace a to v rozmezí 0-0,07 %. 5.6. Frekvence mutací u postižených hemochromatózou Většina pacientů postižených hemochromatózou v Evropě má v HFE genu mutaci C282Y, v severoevropských zemích se její zastoupení odhaduje až na 85-100 %, následuje H63D a poté S65C (8 % v celé Evropě) 9. Znatelně vyšší výskyt C282Y mutace v severských zemích, oproti ostatním mutacím, je patrně dán jejím původem. Předpokládá se, že na počátku se objevila u Vikingů či Keltů. V důsledku migrace obyvatelstva se poté rozšířila po celém světě 9. Výskyt mutace u pacientů s HHC klesá směrem od severozápadu Evropy k jihovýchodu 19. Ve Skandinávii postihuje až 100 % pacientů, konkrétně ve Švédsku 93 % 38 dále v Irsku 93 % 42, ve Velké Británii 91 % 38, ve Francii 91 % 38, v Itálii 60 % 38 (Severní Itálie 69 % 3, Jižní Italie jen 33 % 3 ), ve Slovinsku 48 % 24. Tyto hodnoty jsme vynesli do grafu č. 8 a porovnali je s hodnotami u zdravé populace. Z výsledku je zřejmé, že mutace se daleko častěji objevuje u postižených pacientů HHC než při screeningu obyvatelstva. Porovnání výskytu mutace C282Y u zdravé a postižené populace v evropských zemích Pacienti s HHC Populace 93,0% 91,0% 91,0% 70,0% 48,0% 5,3% 8,3% 6,1% 3,6% 3,6% Švédsko Velká Británie Francie Česká republika Slovinsko Graf č. 8 Porovnání procentuálního výskytu mutace C282Y v jednotlivých zemích Evropy u zdravé populace a u populace postižené HHC 3,9,21,24,38 31

Směrem na východ od Evropy výskyt mutace C282Y u pacientů s HHC prudce klesá, v Asii a na Středním východě lze tento stav nazývat relativně vzácným 3,9. Americké studie uvádějí výskyt mutace C282Y 60-82,3 % u pacientů v USA 19,23,38 a 37,5 35-52 26 % u pacientů v Brazílii. V Austrálii je u 100 % nemocných HHC 35, 38. Frekvence mutace H63D klesá u pacientů v Evropě podobně jako u zdravé populace směrem od západu na východ. Nejvyšší zastoupení má u pacientů ze Španělska 30,4 % 3,9 (konkrétně u populace Basků a Katalánců) a více než 20 % 3,9 je hlášeno u postižených z Bulharska. V České republice dosahuje mutace přibližně 20 % 3. Postižení pacientů v ostatních zemích severní a jižní Evropy je pak daleko nižší, například ve Švédsku se mutace vyskytuje u 1 % 38 pacientů, taktéž v Itálii u 1 % 38, ve Velké Británii u 1 % 38-3,4 % 23, ve Francii u 1,5 2 % 38. I směrem na východ od Evropy nacházíme velice malé zastoupení mutace H63D u postižené populace a to u 8,5 % 23 osob v Saudské Arábii, u 5 % 22 v Asii a na Blízkém Východě. Mnohé studie však hlásí spíše opravdu nízké hladiny výskytu v asijských zemích například v čínské provincii Zhejiang 2,3 % 31 a na Thaiwanu se údajně nevyskytuje vůbec 23. Americké studie uvádí, že v USA se nález mutace H63D u pacientů s diagnostikovanou hemochromatózou pohybuje mezi 1,5 až 6 % 38, do tohoto rozpětí spadá i výsledek studie Zhang a kol. 2,6 % 27. Avšak v rámci studie Dunn a kol. byla na území USA zaznamenána mutace u 13,5 % 29 nemocných osob, příčinou vyššího nálezu pravděpodobně bude, že studie byla zaměřená pouze na muže. Na jižní straně Ameriky je výskyt lehce vyšší a to konkrétně v Mexiku 6,5 % 23. Všechny výše uvedené hodnoty z Evropy a Ameriky jsme vynesli do grafu č. 9 a porovnali s hodnotami z populačních screeningů. Rozdíl ve výskytu není tak markantní, jako u mutace C282Y. 32

Porovnání výskytu mutace H63D u zdravé a postižené populace v Evropě a Americe Pacienti s HHC Populace 20,0% 13,1% 13,1% 17,4% 15,0% 15,0% 13,6% 1,0% 3,8% 6,5% Severní Evropa Střední Evropa Jižní Evropa Severní Amerika Jižní Amerika Graf č. 9 Porovnání procentuálního výskytu mutace H63D v jednotlivých částech Evropy a v Americe u zdravé populace a u populace postižené HHC 3,9,21,22,23,24,27,30,36,38,40 Poznámky: Procentuálně byly započítány ze severní Evropy tyto země - Švédsko (postižená populace), Dánsko, Finsko, Švédsko, Norsko, Island, Litva, Faerské ostrovy Estonsko (zdravá populace). Ze zemí střední Evropy Česká republika (postižená populace), Slovinsko, Rakousko, Německo, Polsko, Česká republika, Slovenská republika (zdravá populace). Ze zemí jižní Evropy Španělsko, Bulharsko, Itálie (postižená populace), Portugalsko, Chorvatsko, Bosna a Hercegovina, Srbsko a Černá hora, Makedonie (postižená populace). Ze Severní Ameriky tyto země - USA (zdravá a nemocná populace). Z Jižní Ameriky Mexiko (nemocná populace), Brazílie (zdravá populace). Graf je pouze orientační, protože nebyly dostupné údaje ze všech zemí v dané části Evropy. Mutace S65C byla prokázána u Brazilské populace pouze v heterozygotní formě 1,6 % 37. Důvodem velmi malého množství dostupných dat je, že se mutace nevyšetřuje stejně často jako ostatní. 33

6. Diagnostika hereditární hemochromatózy Diagnostika hemochromatózy je založená na historických poznatcích, fenotypových znacích, ale také na laboratorních testech, fyzikálních vyšetřeních a rodinné anamnéze. Na začátku dlouhé cesty k potvrzení diagnózy hereditární hemochromatóza stojí poměrně jednoduchá otázka, která se však často stává tzv. kamenem úrazu a to: Koho testovat? Prvním problémem je, že příznaků, které mohou nasvědčovat pro toto onemocnění je mnoho, ale často jsou velmi nespecifické bolesti, únava, záněty kloubů, diabetes. Dalším úskalím, na které lékař naráží je finanční dostupnost testů, platí čím specifičtější vyšetření tím dražší (alespoň ve většině zemí). V této práci se pokusíme nastínit celý proces od prvního kontaktu pacienta s lékařem až po stanovení diagnózy. V závěru kapitoly je ve schématu č. 1 znázorněn vyšetřovací algoritmus pro stanovení diagnózy. 6.1. Kandidát pro vyšetření Pokud si položíme otázku Koho testovat? odpověď bude logicky - pacienty s příznaky vyvolanými zvýšeným množstvím železa. Tito pacienti mohou trpět artropatií, osteoartritidou, kardiomyopatii, srdečním selháním, diabetem započatým v dospělosti, perzistujícím zvýšením jaterních enzymů, jaterní cirhózou, sekundárním hypogonadismem, vyšší pigmentací kůže a bolestmi nejasné etiologie 7,10. Dále je nutné zahrnout pacienty s trvale zvýšenou hladinou feritinu nejasného původu (může být ale také u zánětů, infekcí, rakoviny) pokud se v jejich nejbližší rodině vyskytuje HHC. Je vhodné myslet i na pacienty, kteří dlouhodobě užívají transfuze erytrocytů 10. 6.2. Biochemické laboratorní testy Na základní biochemické vyšetření se odebírá vzorek žilní krve nalačno. Prvním krokem v testování a zároveň základním rozřazovacím testem je saturace transferinu železem (FTS). Není vhodné měřit hladinu feritinu, neboť citlivost i přesnost testu je oproti FTS nižší. Naproti tomu rovnocenná metoda k FTS je test na celkovou vazebnou kapacitu železa. Oba testy mají obdobnou citlivost 78-90 % a specifitu 90-97 %, ale také stejná negativa 10,22. Díky populační variabilitě může na základě těchto testů dojít k falešné pozitivitě zachycení zdravé osoby popřípadě jinak postiženého pacienta nebo naopak může být vynechán některý z pozitivních pacientů (protože není u všech 34

HHC pacientů zvýšená saturace) 7. Podle studie Siah a kol. je pravděpodobnost 1:700, že bude u testovaného nalezena trvale zvýšená hladina FTS, bude vykazovat příznaky přetížení železem, ale nebude se jednat o pacienta s mutací v HFE genu 22. Hodnocení výsledků testů: pokud je FTS pod 0,45 není nutné další testování. Pokud je zjištěna hodnota v rozmezí 0,45 0,6 je nutné test za měsíc zopakovat. Pokud je hodnota při opakovaném testu pod 0,45 není nutné další testování, pokud je hodnota vyšší než 0,45 je vhodné zvážit (s ohledem na anamnézu pacienta) zda vyšetřit DNA na mutace v HFE genu. Pokud je při prvním testování detekována hladina FTS vyšší než 0,60 je indikováno vyšetření DNA na přítomnost mutací v HFE genu 10. Typy vyšetření Fyziologický nález Nález při HHC Saturace transferinu železem 19-49 % Muži > 60 % Ženy > 50 % Plazmatické železo 6-29 μmol/l > 30 μmol/l Feritin v séru 30-400 μg/l > 1000 μg/l Železo v jaterní sušině 0-2000 μg/g sušiny > 2000 μg/g sušiny Tabulka č. 2 Laboratorní vyšetření při podezření na HHC 18 6.3. Molekulárně-biologické laboratorní testy Dalším krokem v testování pacientů, kteří prošli prvotním sítem, jsou DNA testy. Ty by měly být nabídnuty všem občanům evropského původu - splňujícím přímo kritéria (viz testy FTS) nebo pokud to navrhne lékař, dále pacientům s diagnostikovanou HCC v období, kdy nebylo možné DNA testování a osobám, které mají v nejbližším příbuzenstvu nemocného s diagnózou dědičné HHC. Podle výsledku DNA vyšetření se odvíjí další kroky. Pokud při testování není zjištěna žádná mutace v HFE genu, ale pacient trpí příznaky přetížení železem, je vhodná následná konzultace s oborníkem. Pokud ale testy potvrdily přítomnost jedné nebo více mutací C282Y v HFE genu, mělo by být započato s terapií a dále by mělo být doporučeno otestování DNA všech příbuzných prvního řádu 10. Je vhodné otestovat i manžela/manželku či partnera/partnerku, aby bylo jasné, na kolik procent budou mutací zatíženi jejich potomci a jestli je vůbec nutné je testovat 18. Pokud se při testování DNA zjistila přítomnost dvou mutací v HFE genu a alespoň jedna je C282Y provede se doplňkový 35

test pro zjištění hladiny sérového feritinu. A podle výsledku se stanoví, zda se jedná o C282Y/C282Y homozygoty, C282Y/H63D složené heterozygoty nebo C282Y/Zdravá alela jednoduché heterozygoty. U posledního typu a dále při zjištění varianty mutace H63D/H63D nebo H63D/Zdravá alela se neprovádí žádné další testy, protože je pouze velmi nízké riziko vzniku přetížení organismu železem 10. Pro lékaře je velmi důležité, po zachycení DNA mutace, zařadit pacienta do jedné ze tří kategorií/fází onemocnění, které definovala European Association for the Study of Liver Diseases na své konferenci v roce 2000 (viz. tabulka č. 3) 20. 1. fáze Genetická predispozice bez nálezu zvýšeného železa 2. fáze Genetická predispozice s fenotypovými příznaky zvýšeného železa 3. fáze Genetická predispozice s nálezem poškození organismu železem Tabulka č. 3 Fáze HHC podle 20 6.4. Metody molekulární biologie Pro účely testování DNA na přítomnost mutací v HFE genu bývají nejčastěji použity tyto metody PCR-RFLP, real-time PCR a sekvenování. Mezi další metody vhodné pro použití patří alelově specifická PCR, denaturační HPLC či SSCP (konformační polymorfismus jednovláknové DNA, single-strand conformation polymorphism). Základem je vždy zmnožení požadovaného úseku DNA pomocí metody PCR (polymerázové řetězové reakce). 6.4.1. PCR Tato technika, je běžně využívána v oblasti molekulární biologie pro zmnožení požadovaných úseků DNA. Základním principem metody je opakování tří po sobě následujících kroků denaturace, annealing a extenze. Počet jednotlivých opakování je většinou 30-40x, přičemž množství úseků DNA stoupá exponenciální řadou. Před započetím celé reakce proběhne výchozí denaturace (cca 2-5 min) a po ukončení závěrečná extenze. Po skončení celé reakce dochází ke zchlazení reakční směsi na 4 C, čímž se zabrání produkci nespecifických fragmentů a také se umožní krátké skladování DNA 45,48. 36

Samotná PCR reakce probíhá v termocykléru a skládá se ze třech fází (znázorněny na obrázku č. 8): Fáze denaturace - působením vysoké teploty (95 C) dochází k porušení vodíkových můstků a tím k oddělení jednotlivých řetězců ve dvoušroubovici 44,45. Fáze Annealing (hybridizace) během 30 až 60 sek dochází k navázání 1 páru primerů na komplementární úsek DNA, každý se váže na samostatný řetězec v opačném směru. Aby navázání proběhlo úspěšně, je nutné snížit teplotu reakční směsi na 55-68 C. Primery jsou uměle nasyntetizované jedno vláknové úseky oligonukleotidů, které vymezují oblast k amplifikaci 44,45. Fáze Extenze (prodloužení) pro tento krok je nezbytná účast enzymu DNA polymerázy, který od 3 konce primerů komplementárně připojuje deoxynukleotidy (datp, dctp, dgtp, dttp). Je známo mnoho druhů DNA polymeráz, nejčastěji se však používá termostabilní Taq polymeráza, získaná z bakterie Thermus aquaticus. Syntéza nového vlákna DNA probíhá při 72 C a řetězec vzniká ve směru 5-3. Reakce probíhá až do vytvoření nové dvoušroubovice, která po následné opětovné denaturaci, bude sloužit jako templát pro další cykly 44,45. Obrázek č. 8 Průběh PCR rekce podle 45 Pro ověření správného průběhu PCR reakce se provádí gelová elektroforéza. Kdy je do gelu naneseno malé množství reakční směsi získané z PCR a molekulový 37

marker. Gel je dále obohacen o fluorescenční barvivo ethidium bromid, které interkaluje mezi páry bází v molekule DNA a tím umožňuje vizualizaci pod UV světlem. V gelu se rychleji pohybují kratší produkty a naopak delší se drží blízko startovací jamky 45. 6.4.2. Real-time PCR Kvantitativní variantou PCR metody je real-time neboli PCR v "reálném čase". Principem této metody je vizualizace vzniklé DNA po každém cyklu PCR díky použitým sondám. Tyto sondy jsou krátké oligonukleotidové sekvence, obsahující buď interkalační barviva typu SYBR Green nebo fluorescenční sondy. Momentálně mezi používanější sondy patří ty fluorescenční, které na jednom konci mají fluorescenční látku tzv. fluorofor a na druhém zhášeč fluorescence tzv. fluorochrom. Fluorescenční látka, nemůže excitovat žádné záření, pokud je poblíž fluorochromu, který toto záření absorbuje 44,46. Samotná realizace metody probíhá tak, že nejprve se naváže fluorescenční sonda ke komplementárnímu vláknu DNA, označenému primery, a jak postupně DNA polymeráza syntetizuje nový řetězec, využije své exonukleázové aktivity a sondu hydrolyzuje. Takto uvolněná sonda, pokud je ozářena, excituje fluorescenční záření. Celý proces probíhá ve speciálním cykléru, který během amplifikační fáze reakční směs ozáří a zaznamená míru vzniklé fluorescence, ta je přímo úměrná koncentraci právě vzniklých řetězců DNA 44,46. Tato modifikace metody PCR se hojně využívá v klinické praxi pro detekci jednobodových mutací či delecí. Mezi její nevýhody patří obtížnější optimalizace než u PCR, výhodou je však rychlost získaných informací, kdy není nutné použít elektroforézu 44,46. Této metody bylo použito během studie Cukjati a kol., kdy byl mapován výskyt mutací C282Y, H63D a S65C u slovinské populace. Speciálně byly použity fluorescenční Taqman sondy, které využívají MGB (minor groove binder) nefluorescenčního zhášeče pro detekci mutací 24. 6.4.3. PCR-RFLP Jednou z nejstarších metod spojených s PCR, je metoda délkových polymorfismů restrikčních fragmentů neboli RFLP. Jedná se o primární genotypovou 38

neautomatizovanou techniku, která je dnes již v rutinní praxi nahrazena metodami více sofistikovanými. Často se však používá k vědeckým záměrům a byla také využita v této práci 45. Principem metody je rozlišení polymorfních a zdravých alel, pomocí enzymů restrikčních endonukleáz působících na produkty PCR reakce. Samotné provedení zahrnuje tři kroky nejdříve pomocí metody PCR zmnožit požadovaný úsek DNA, následně zmnožené úseky nechat reagovat s restrikčními enzymy a získané produkty odlišit pomocí elektroforézy. Restrikční enzymy rozpoznávají specifická místa na řetězcích DNA tzv. palindromatické sekvence (4-6 nukleotidů) a poté ji v restrikčním místě štěpí hydrolýzou fosfodiesterových vazeb 45,48. 6.4.4. Sekvenování Jedná se o metodu, která je v dnešní době považována za zlatý standard v genotypizaci genetických onemocnění. Tato metoda má dvě provedení založené buď na principu enzymaticky modifikovaných deoxynukleotidů (Sangerova metoda) nebo na přidávání speciálních chemických látek do reakčních směsí s nukleotidy, polymerázou a templátovou DNA (Maxam-Gilbertova metoda). Dnes je v klinických laboratořích většinou využívána enzymatická metoda sekvenování, která je plně automatizována 45,48. Samotná reakce probíhá tak, že k reakční směsi templátové DNA, polymerázy a deoxynukleotidů je přidáno odpovídající množství enzymaticky modifikovaných dideoxynukleotidů. Tyto modifikované nukleotidy mají obdobnou strukturu jako ty původní ale v poloze 3 nemají navázanou hydroxy skupinu a tím znemožňují navázání následujícího nukleotidu. DNA polymeráza náhodně přiřazuje jednotlivé nukleotidy, a pokud dojde k zařazení dideoxynukleotidu, reakce je ukončena. Poté následuje denaturace, aby došlo k oddělení řetězců dvoušroubovice. Vzniklé různě dlouhé jedno řetězcové fragmenty, které mají na 5'-konci primer a na 3'-konci dideoxyribonukleotid jsou analyzovány nejčastěji pomocí automatických sekvenátorů. Sekvenátory fungují na principu gelové elektroforézy, kdy jsou jednotlivé fragmenty rozděleny podle své délky a vizualizovány buď díky fluorescenčně značeným primerům nebo dideoxynukleotidům (pro každý je samostatný fluorofor) 45. Metoda sekvenování se využívá k identifikaci změny sekvence primární struktury v požadovaném úseku DNA, a po nalezení této sekvence je často zavedena 39

levnější a jednodušší metoda pro její detekci. V klinické praxi se sekvenování využívá častěji pro potvrzení přítomnosti mutované alely. Pro stejný účel bylo této metody využito v této práci, pro potvrzení mutace ve vzorku, který byl následně používán jako pozitivní kontrola 45. 40

Podezření na HHC Vyšetření saturace transferinu Ž > 45 %; M > 50 % Ž < 45 %; M < 50 % Opakovat vyšetření transferinu + vyšetřit feritin Nejedná se o HHC Ž > 45 %; M > 50 % Ž > 45 %; M > 50 % Vyšetření DNA na přítomnost mutací C282Y, H63D, S65C v HFE Opakovat vyšetření transferinu + feritinu za 1 rok C282Y/C282Y C282Y/H63D Žádné mutace Ostatní Dg. HHC Dg. sekundární hemochromatóza Není nutné monitorování metabolismu železa, ani testování příbuzných Pravidelné sledování Otestování příbuzných Feritin Ž > 200μg/l M > 300μg/l Flebotomie až dokud nebude feritin < 50 μg/l Schéma č. 1 Schéma vyšetřovacího algoritmu při podezření na HHC upraveno podle 12 41

7. Terapie hereditární hemochromatózy Rozlišujeme dva způsoby, jak snížit množství nahromaděného přebytečného železa v organismu a to odběry krve nebo vyvázání železa pomocí tzv. chelátorů. Volba metody a její účinky vždy záleží na individuálních faktorech nemocného, stupni přetížení organismu železem a dostupnosti železitých zásob 14. Základním typem léčby u pacientů s HFE i non-hfe hemochromatózou je flebotomie (venepunkce neboli pouštění žilou). Samotný zákrok, jak již název napovídá, je odběr krve běžně využívaný pro laboratorní vyšetření nebo při dárcovství krve. Stejně jako u dárců krve, je pacientovi odebráno 500 ml plné krve jednou týdně. S tímto odběrem se tělo zbaví cca 250 mg železa 18. Frekvence odběrů je velmi individuální v této práci uvádíme pouze standardní opatření. Obecně tedy platí, že se pokračuje v odběrech, až do okamžiku kdy pacientovi klesne hodnota sérového feritinu pod 20-50 mg/l. V některých studiích se dokonce doporučuje, aby hodnota klesla ještě níže to proto, aby došlo k odstranění většiny potenciálně škodlivých depozit železa v organismu 7,10. Během léčby může dojít k rozvoji anemie (chudokrevnosti). V takovém případě je nutné snížit frekvenci odběrů 10. Některé studie uvádějí, že po dosažení požadovaných hladin se doporučuje testování opět za půl roku a za rok, aby se rozhodlo o následné terapii a zároveň bylo onemocnění monitorováno 7. Jiné doporučení uvádějí, že jakmile je u pacientů vyčerpáno nadbytečné železo, je nastavena tzv. udržovací terapie. Tou obvykle bývá flebotomie 500 ml každé 2-3 měsíce 10. Pokud u některých pacientů není možné provádět flebotomii, její alternativou je tzv. chelatační terapie. Jedná se o léčbu, kdy je železo pomocí chelátorů v určitém poměru vyvazováno a následně jsou společně ve formě komplexu fyziologicky vyloučeny z organismu, buď močí, nebo stolicí. Podle poměru vazby rozlišujeme dvou-, troj- a šestimocné chelátory, jejichž základní princip chelatace je znázorněn na obrázku č. 9. Mechanismus vyvazování kovů byl původně využíván například v analytické chemii k regulaci znečištění od kovů nebo k čištění odpadních vod od nich. Struktury dnes používaných chelatačních látek mají převážně malou molekulu. Ve fázi výzkumu jsou již ale struktury polymerové, které jeví řadu výhod, mezi hlavní patří velmi nízká absorpce v zažívacím systému, čímž by se mohly odstranit zažívací obtíže spojené s užíváním většiny perorálních látek. Velký potenciál těchto látek není důležitý jen pro 42

terapii hemochromatózy, ale využije se také v terapii HIV, malárií, nádorů či neurodegenerativních onemocněních 13. Obrázek č. 9 Schématické znázornění komplexů chelátů s železem 13 Chelatační terapie by se měla zvolit v případech, kdy má pacient špatný žilní přístup, zánět žil, vasovagální příznaky, trpí anemií nereagující na erytropoetin, odběru krve mu brání náboženská víra, trpí úzkostí 7,11. Tato terapie může být prováděna injekčně nebo perorálně. Na trhu jsou tedy přípravky pro injekční podání s účinnou látkou deferoxamin (DFO) a pro perorální podání s účinnou látkou deferipron či deferasirox. Souhrnné informace o těchto látkách jsou uvedeny v tabulce č. 4. Látka deferoxamin obsažená jako šestimocný (hexadentate) chelát v přípravku Desferal (prášek pro přípravu injekčního roztoku) je určená pro parenterální, intramuskulární a subkutánní podání. Jedná se o bezpečný a účinný standardně užívaný chelátor registrovaný již od roku 1970. Mezi jeho vlastnosti patří tvorba komplexů s trojmocným železem popřípadě s trojmocným hliníkem v poměru 1:1 a rychlý poločas rozpadu, kvůli kterému špatně proniká skrz membrány buněk. Po vyvázání železa jsou společně vyloučeny močí (plazmatické železo) a stolicí (intrahepatální železo). Jeho standartní aplikace (nejúčinnější) je ve formě noční subkutánní infuze 5-7x za týden. Pokud se přípravek podává ve formě i.v. infuze je nutné ho aplikovat pomalu, jinak by mohlo dojít k oběhovému selhání. Dávkování bývá často nastaveno podle hladiny feritinu v séru: feritin < 2000 ng/ml = 25 mg/kg/den, feritin mezi 2000 až 3000 ng/ml = 35 mg/kg/den, feritin > 3000 ng/ml = až 55 mg/kg/den. Při dávkování je nutné brát zřetel na to, že při příliš vysokých dávkách může docházek k poškození zraku či sluchu. Konkrétní dávkování i způsob podání je velice individuální. Během léčby dochází, pravděpodobně z důvodu oxidace vitamínu C železem, k jeho nedostatku. Proto se doporučuje podávání vitamínu C v několika denních dávkách, čítajících 43

dohromady až 200 mg/den. Pakliže dávka překročí 500 mg/den je ohrožen kardiovaskulární systém. Pro kontrolu chelatační terapie je důležité po nasazení léčby každý den měřit přítomnost železa v moči, později postačí kontrola několikrát měsíčně. Mezi negativa této látky patří její velmi malý účinek u pacientů s non-hfe hemochromatózou 14,15. Deferipron se jako účinná látka používá od roku 1987 a je obsažen v přípravku Ferriprox. Jeho výhodou je, že po vazbě na trojmocné železo v poměru 3:1 (bidentate ligand), nemá tento komplex žádný náboj, a proto lehce prochází skrz membrány. Tato vlastnost určuje, že deferipron vyvazuje daleko více železa ze tkání na rozdíl od DFO. Během prvních let jeho užívání (v 90-tých letech) se objevilo podezření na spojitost s vyšším výskytem jaterní fibrózy. Několika studiemi byly tyto pochyby vyvráceny a určeny jako málo signifikantní, protože na rozvoji fibrózy se podílely i jiné faktory typu hepatitid. Přípravek může tedy být bezpečně používán. U tohoto typu chelátoru byly zaznamenány idiosinkratické nežádoucí účinky a to artritida v jižní Asii. Dále se vyskytuje neutropenie (u 5 %) a agranulocytóza (u 0,5-1,1 %), jako nežádoucí účinky na neznámém podkladu. Pacientovi je proto doporučeno okamžitě hlásit výskyt chřipkových příznaků svému lékaři, neužívat jiné přípravky, které prokazatelně snižují množství neutrofilů a dále docházet na odběry krve pro zjištění hladiny neutrofilů v KO každý týden. To proto, aby byl patologický stav zachycen co nejdříve. Nejčastější dávkování je třikrát denně v jednotlivém množství 25 mg/kg, celkem tedy 75 mg/kg/den. Není doporučené užívat dávky vyšší než 100 mg/kg/den, zvláště u dětí, kde by se mohly v důsledku toho vyskytnout neurologické poruchy. Každé dva až tři měsíce je doporučené odebírat krev pro určení hladiny feritinu, výsledky zpětně hodnotí efekt léčby 14,16. Deferasirox, tento relativně nový trojmocný (tridentate) chelát je obsažen v přípravku Exjade, který je určen pro přípravu perorální suspenze. Díky svému dlouhému poločasu rozpadu (8-16 hodin) má tento chelát, na rozdíl od obou výše zmiňovaných, velký přístup k intracelulárnímu železu. V několika studiích bylo prokázáno, že intracelulární železo se obecně během léčby daleko rychleji uvolňuje z jater než ze srdce, tudíž se v srdci často hromadí i pokud je pacient dobře léčen. Dlouhý poločas rozpadu je tedy velká výhoda, protože znamená delší působení účinné látky a tím vyvazování železa i z hůře dostupných tkání typu myokardu. Tento 44

přípravek se užívá vždy ráno asi 30 minut před prvním jídlem. Dávkování je ovlivněno celkovým příjmem erytrocytární masy za měsíc (> 14 ml/kg/měsíc = 30 mg/kg deferasirox, < 7 ml/kg/měsíc = 10 mg/kg deferosirox) popřípadě při přechodu z DFO je koncentrace poloviční než bývala u DFO. Při poruchách ledvin není vhodné užívat tento lék při clearance kreatininu < 60 ml/min a protože nebyl ještě testován u pacientů s poruchami jater, je nutné ho používat velmi opatrně. Protože bylo zaznamenáno, že přípravek může ovlivnit hladiny jaterních enzymů je vhodné je změřit ještě před započetím léčby, dále pak během prvního měsíce jednou za 14 dní a posléze postačí jen jednou měsíčně 14,17. Chelátory Deferoxamin Deferipron Deferasirox Užití Chronické přetížení železem a hliníkem, otravy železem Přetížení železem Přetížení železem Podání i.v., i.m., s.c. p.o. p.o. Standardní dávkování 20 a 60 mg/kg/den 75 mg/kg/den 20 mg/kg/den NÚ a komplikace Myalgie, atralgie, komplikace v místě vpichu, bolesti hlavy, nauzea, vyrážka, retardace růstu Agranulocytóza, neutropenie (5%), poruchy GIT, artritida Tabulka č. 4 Souhrnné informace o užívaných chelátorech 14,15,16,17 Poruchy GIT, kreatinemie, vyrážka, proteinurie Již před započetím léčby je vhodné u pacienta provézt testy pro zjištění poškození orgánů dosavadním ukládáním železa např. artritida, jaterní dysfunkce, onemocnění srdce, diabetes aj. aby během udržovací terapie bylo možné monitorovat zlepšení/zhoršení těchto přidružených onemocnění. Lékaři často popisují zlepšení při diabetu (nižší závislost na inzulinu), srdečních dysfunkcích (pokud byly způsobené nahromaděným železem) a snížení hladin jaterních enzymů. Kde naopak nedochází k ovlivnění stavu je artróza, jaterní cirhóza a atrofie testes 10. Dále kromě léčivé terapie je nutné průběžně sledovat, zda nedochází k rozvoji již několikrát zmiňovaných orgánových komplikací. Jako nejdůležitější se jeví monitorovat stav jater, kde může dojít k rozvoji fibrózy nebo popřípadě i vzniku karcinomu. Hepatocelulární karcinom je častou komplikací v posledním stadiu onemocnění, uvádí se, že riziko jeho vzniku je až 200x vyšší oproti zdravé populaci. 45

Prognóza pacientů s touto chorobou je velice nepříznivá, většina jich zemře do jednoho roku od stanovení diagnózy 34. Tato situace se většinou řeší transplantací jater, ale u postižených HHC nebývá prováděna často, kvůli následným komplikacím a špatné prognóze. Ke sledování nebo pro potvrzení zhoršení stavu jater není možné využívat základní ultrazvuk, ale například měření α fetoproteinu, jaterní biopsie, magnetické resonance (MRI) a elastografie. Protože α-fetoprotein může být zvýšen u několika onemocnění a ne všechny souvisí s jaterními funkcemi, není pro monitorování jejich stavu dosti specifický 7. Biopsie je tzv. zlatý standard používaný pro přesnou diagnostiku mnoha onemocnění jater - steatózy, hepatitidy, alkoholových onemocnění a také karcinomu. Není ji však možné provést v případě, že pacient trpí hemokoagulačními problémy, jaterním abscesem, silnou obezitou, cholangitidou či anomáliemi žlučníku. Pokud se v histologickém preparátu zhotoveném z jaterní biopsie objeví železo, jedná se vždy o patologický stav, za fyziologických podmínek není totiž možné nalézt žádné 18. Výsledný histologický preparát po biopsii přetížených jater železem, ale bez přítomnosti fibrózy můžeme vidět na obrázku č. 10. Přestože se jedná o metodu velmi specifickou, mezi její velké nevýhody patří, že s provedením je spojeno mnoho až život ohrožujících komplikací 7. Dále je možné užití skenování jater pomocí MRI, kdy nacházíme při přetížení jater železem difúzní pokles signálu v jejich T 2 vážených obrazech. Tato metoda se stejně jako dual CT může využít pro kvantifikaci množství železa 18. Nevýhodou je, že se jedná se o velmi nákladnou metodu, která vyžaduje specializační radiologický tým a drahé vybavení 11. Proto se jako nejlepší jeví možnost ultrazvukové techniky tzv. elastografie, což je novější metoda která slouží pro posouzení stavu jaterní fibrózy 7. Obrázek č. 10 Preparát z biopsie jater u homozygotní formy C282Y mutace 11 46

Fakt, že již bylo detekováno přes třicet mutací v HFE genu a popsány tři poměrně často spojené se vznik HHC, by mohlo vést k běžnému zavedení genetických testů sloužících pro včasnou detekci onemocnění. Včasné odhalení onemocnění a odpovídající terapie mnohdy odvrátí velmi závažné následky hemochromatóz například hepatocelulární karcinom. Bylo prokázáno, že pokud se s terapií začne ještě před propuknutím cirhózy jater, dožijí se i takto postižení jedinci normální délky života 23. Bohužel tato metoda není vhodná pro screening a to z mnoha důvodů. Zaprvé, není známá přesná míra rizika vzniku onemocnění u jednotlivých genotypů kvůli neúplné penetraci HFE mutací. Postižení s homozygotní formou mutace C282Y dosahují pouze v 70 % fenotypových projevů a dokonce jen u maximálně 10 % nemocných dojde k rozvoji závažných důsledků HHC 20. Dále je však nutné myslet i na sociální postižení samotného pacienta, mohlo by docházet k problémům s jeho zaměstnáním nebo při pojištění. Tato situace by musela být právně ošetřena, tak jako je to v jiných zemích. Obecně je vhodné k této problematice přistupovat racionálně a zavézt různé přístupy k diagnostice HHC například v závislosti na jejím geografickém výskytu 7,9. 47

Praktická část 8. Použité materiály a přístroje 8.1. Chemikálie Pro tuto práci byly použity následující chemikálie vypsané v tabulce č. 5. Účel použití Použité chemikálie Výrobce Země původu Izolace DNA QIAamp DNA Blood Mini Kit QIAGEN Hilden, SRN PCR Aqua pro injectione B. Braun Melsungen AG Melsungen, SRN 10 Taq Buffer, dntp Mixture, 5 U.µl -1 Taq HS DNA polymeráza 10 pmol.µl -1 roztoky primerů TaKaRa SHUZO CO. Ltd. GENERI BIOTECH Otsu, Shiga, Japonsko Hradec Králové, ČR 25 mmol.l -1 MgCl 2 Roche Diagnostics Mannheim, SRN RFLP NEBuffer 4, NEBuffer 3, RE Hinf I, Bcl I, Rsa I New England Biolabs Ipswich, MA, USA Elektroforéza Agaróza for DNA electrophoresis SERVA Electrophoresis Heidelberg, SRN TBE Buffer, sacharóza, 10 mg.ml -1 etidiumbromid Sigma Aldrich Corporation St. Louis, MO, USA bromfenolová modř AMRESCO Inc. Solon, OH, USA DNA Molecular Weight Marker XIII Roche Diagnostics Tabulka č. 5 Použité chemikálie v této práci Mannheim, SRN Složení chemikálií použitých při izolaci DNA: PBS pufr byl připraven rozpuštěním 80 g NaCl, 14,4 g Na 2 HPO 4, 2,7 g KH 2 PO 4, 2,0 KCl v 800 ml H 2 O s přídavkem DEPC a poté doplněn do konečného objemu 1000 ml. Před použitím byl autoklávován. 48

QIAamp DNA Blood Mini Kit obsahoval proteázu Q, AL lyzační pufr, AX1 pufr, AW2 pufr, AE pufr. Složení chemikálií použitých pro PCR reakci: 10 TaKaRa Taq Buffer 500 mmol.l -1 KCl, 15 mmol.l -1 MgCl 2, 100 mmol.l -1 TRIS Pufr HCl, ph = 8,3. Zásobní roztoky primerů (100 pmol.µl -1 ) - pro mutaci C282Y obsahoval roztok sekvenci primerů 5 CAG ATC CTC ATC TCA CTG 3 a 5 CTG GAT AAC CTT GGC TGT ACC CCC 3, pro mutace H63D a S65C byl použit stejný pár primerů a to 5 GCC ACA TCT GGC TTG AAA TT 3 a 5 ACA TGG TTA AGG CCT GTT GC GCC ACA 3. Ze zásobního roztoku byl vytvořen roztok pracovní a to zředěním na koncentraci 10 pmol.µl -1. Složení chemikálií použitých pro RFLP: Hinf I a Bcl I enzymy (10 000 U.ml -1 ) byly dodávány v roztocích se stejným složením a to 50 mmol.l -1 KCl, 10 mmol.l -1 TRIS HCl, 0,1 mmol.l -1 EDTA, 1 mmol.l -1 Dithiothreitol, 200 µg.ml -1 BSA, 50 % glycerolu (ph 7,4). Rozpoznávací sekvence pro Hinf I je 5 G/ANTC 3 a pro Bcl I je 5 T/GAT CA- 3. Rsa I (10 000 U.ml -1 ) je dodáván v roztoku, skládajícím se ze 100 mmol.l -1 NaCl, 10 mmol.l -1 TRIS HCl, 0,1 mmol.l -1 EDTA, 1 mmol.l -1 Dithiothreitol, 200 µg.ml -1 BSA, 50 % glycerolu, jehož ph=7,4. Rozpoznávací sekvence je 5 GT/AC 3. 1 NEBuffer 3 obsahoval 50 mmol.l -1 TRIS-HCl, 200 mmol.l -1 NaCl, 10 mmol.l - 1 MgCl 2, 1 mmol.l -1 Dithiothreitol (ph 7,9). 1 NEBuffer 4 obsahoval 50 mmol.l -1 acetát draselný, 20 mmol.l -1 TRIS acetát, 10 mmol.l -1 acetát horečnatý, 1 mmol.l -1 Dithiothreitol (ph 7,9). Složení chemikálií použitých pro elektroforézu: 1 l TBE Buffer (tlumivý pufr) byl připraven rozpuštěním 53,90 g TRIS base a 27,65 g kyseliny borité a 3,72 g EDTA v 1 l demineralizované vody. ph roztoku bylo upraveno přidáním 10 mol/l HCl na 8. 49

8.2. Přístroje Při izolaci DNA byla využívána centrifuga Microfuge 18 Centrifuge od firmy Beckman Coulter Inc. z Brea v CA, USA. Následně pro ověření množství DNA a čistoty vzorku byl použit přístroj NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer (sér.č. 1483) Thermo Fisher Scientific, Inc. z Wilmington v DE, USA. PCR reakce probíhala v termocykléru Veriti 96-Well Thermal Cycler (sér.č. 299024236) od firmy Applied Biosystems 9600 z Foster City v CA, USA. Restrikční analýza probíhala v termocykléru GeneAmp PCR 2400 od firmy PerkinElmer z Waltham v MA, USA. Elektroforéza pro detekci mutací byla provedena v modelu B2 elektroforetické vany od firmy OWL Separation Systems Inc. z Portsmouth v NH, USA. Vana byla připojena na zdroj napětí Power Pac 300 od firmy Bio-Rad Laboratories Headquarters z Hercules v CA, USA. Detekce PCR produktů a následné pořízení fotografií gelů bylo provedeno pod UV transluminátorem TVC312 A/F (sér.č. 547074) od firmy Spectronics Corporation z Westbury v NY, USA. Pro konečnou úpravu a popis gelů byl na připojeném počítači použit software: BioCapt Version 11.03 od firmy Vilber Lourmat z Torcy ve Francii. 8.3. Vzorky DNA Biologický materiál byl získán od 167 dárců, z toho bylo 65 vzorků od mužů a 102 od žen. Celkové věkové rozpětí bylo od 18 do 63 let a věkový průměr činil 29 let, u mužů 32 a u žen 28. Materiál v rámci této studie byl získán od náhodně vybraných dárců obou pohlaví. Vzorky byly odebrány po podepsání písemného informovaného souhlasu a nebyly použity pro žádné jiné testování, manipulováno s nimi bylo výhradně anonymně. 8.4. Odběrový materiál Při sběru vzorků pro tuto studii bylo před odběrem požadováno, aby dárce nejméně 1 hodinu nejedl, nepil (zvláště alkohol a horký čaj), nekouřil. Samotný stěr se pak provedl otáčením lehce přitlačeného odběrového tampónu na obou tvářích, kdy jsme se snažili zamezit kontaktu s jakoukoliv jinou tkání než 50

s bukální sliznicí. K odběru vzorku byly použity odběrové tampónky FLOQSwabs od firmy COPAN ITALIA S.P.A. z Brescia v Itálii. Odběr trval cca 3 min. Po odběru byl tampón vložen zpět do odběrové nádobky a uchováván v chladu. Nejpozději do dvou dnů (48 hodin) bylo nutné ho dopravit do laboratoře, kde byl až do zpravování uskladněn v PBS pufru. 51

9. Metodiky 9.1. Izolace DNA K izolaci DNA byl použit vzorek bukálního stěru z dutiny ústní na tampónku. Tento tampónek byl oddělen od odběrové nádobky, vložen do eppendorf zkumavky se 400 µl PBS pufru a uskladněn v chladicím boxu. Pro zpracování byl vzorek vyndán a při pokojové teplotě během 60 min několikrát zvortexován. Obsah tampónku byl opatrně mírným stlačením o stěnu eppendorf zkumavky vymačkán a samotný tampónek pak vyhozen. Do eppendorf zkumavky bylo přidáno 20 µl proteázy Q a 400 µl AL lyzačního pufru. Tato směs se zvortexovala a nechala se při 56 C inkubovat po dobu 10 min. Poté se lehce ztočila v centrifuze a bylo k ní připipetováno 400 µl 96 % ethanolu. Vzniklý roztok se zvortexoval a byl přenesen pipetou na kolonku, která byla následně při 8000 otáčkách po dobu 1 min centrifugována. Kolonka byla přenesena nad čistou tubu a po připipetování 500 µl AW1 pufru byla opět stočena v centrifuze při 8000 otáčkách po dobu 1 min. Kolonka byla přenesen nad čistou sběrnou tubu a bylo k ní připipetováno 500 µl AW2 pufru, znovu se opakovala centrifugace při 13 000 otáčkách po dobu 3 min. Dále byla kolonka přenesena nad 1,5 ml ependorff zkumavku a DNA z kolonky byla eluována 30 µl AE pufru zahřátého na 70 C. Tento děj probíhal 1 min při pokojové teplotě, poté se konala centrifugace 1 min při 8 000 otáčkách a celý krok eluce se opakoval ještě jednou. Obsah DNA ve vzorku a jeho čistota byly hodnoceny spektrofotometricky ve 2 µl vzorku v UV oblasti pomocí přístroje Nanodrop ND-1000. Měření probíhalo při vlnových délkách 260 a 280 nm, protože absorpční maximum nukleových kyselin je 260 nm a možných kontaminantů např. proteinů je 280 nm. Aby mohla být DNA použita pro PCR, bylo nutné získat poměr absorbancí A 260 /A 280 přibližně 1,8. 9.2. Polymerázová řetězová reakce Z vyextrahované DNA, výše zmíněnou metodou, byly požadované úseky zmnoženy pomocí polymerázové řetězové reakce. Do předem označených eppendorf zkumavek byl nejprve napipetován master mix (složení a jednotlivé objemy viz tabulka č. 6), a poté byla přidána templátová DNA. Vzorek byl několikrát pomalým pipetováním promíchán. Množství DNA pro mutaci 52

C282Y bylo 2 µl a pro mutace H63D a S65C dohromady 4 µl, to proto, že tyto mutace byly později stanovovány z jednoho PCR produktu. Takto připravené vzorky byly vloženy do ABI 2720 termocykléru, kde byl zvolen hfe program, jehož nastavení je uvedeno v tabulce č. 7. Složky Master mixu Použitý objem (µl) Mutace C282Y Mutace H63D a S65C Primer 1 1,0 2,0 Primer 2 1,0 2,0 2,5 mm Směs dntps 2,0 4,0 5 U/µl Takara HS Taq polymeráza 0,3 0,6 Voda 16,2 32,4 10x Takara Pufr 2,5 5,0 Celkový objem 23,0 46,0 Tabulka č. 6 Složení Master Mixu pro PCR Probíhající děj Teplota ( C) Čas Počáteční denaturace 94 5 min 30x Elongace 94 30 sek Denaturace 57 40 sek Annealing 72 35 sek Konečná elongace 72 5 min Tabulka č. 7 Průběh PCR reakce Produkt získaný z PCR byl zkontrolován pomocí gelové elektroforézy (popis metody viz elektroforéza). Elektroforéza probíhala na 2 % agarózovém gelu (2,0 g agarózy + 100 ml TBE pufru + 5 µl ethidium bromid) při napětí 100 V po dobu 1,5 hod. 9.3. Restrikční polymorfismus délkových fragmentů Amplifikované produkty z PCR byly v místech potencionálních mutací štěpeny specifickými restrikčními enzymy. 53

Nejprve bylo nutné produkt PCR pro H63D a S65C mutace z jedné mikrozkumavky rozpipetovat po 15 µl do dvou mikrozkumavek, aby byl objem shodný jako u vzorku pro mutaci C282Y. Do každé mikrozkumavky byl následně přidán NEB pufr a specifický restrikční enzym, konkrétní objemy jsou vypsány v tabulce č. 8. Mikrozkumavky s touto směsí byly vloženy do termocykléru s nastaveným programem HFE. Restrikční reakce probíhala shodně u všech mutací 16 hodin, odlišné byly teploty, kdy pro mutace C282Y a S65C to bylo 37 C a pro mutaci H63D 50 C. Složky restrikční směsi Mutace C282Y Mutace H63D Mutace S65C Pufr Neb 4 Neb 3 Neb 4 Objem pufru (µl) 1,6 1,6 1,6 Restrikční enzym Rsa I Bcl I Hinf I Objem restrikčního enzymu (µl) Objem PCR amplikonu (µl) 1 1 1 15 15 15 Tabulka č. 8 Složení restrikční směsi 9.4. Gelová elektroforéza Fragmenty získané restrikční analýzou byly detekovány pomocí gelové elektroforézy provedené na agarózovém gelu. Nejprve byl připraven agarózový gel a to rozpuštěním 3 g agarózy ve 100 ml TBE pufru, k této směsi bylo za horka přidáno 5 µl ethidiumbromidu a vše bylo důkladně promícháno. Získaná směs byla nalita na elektroforetickou vanu a do ní byl ještě vložen hřebínek pro vytvoření jamek. Po zchladnutí a ztuhnutí gelu byl zalit TBE pufrem. Do takto připraveného gelu byla nanesena směs nanášecího pufru a vzorku, která byla předem připravena pro každý vzorek v mikrotitrační destičce, smísením 15 µl vzorku a 3 µl nanášecího pufru. Nanášecí pufr byl složen ze sacharózy, destilované vody a bromfenolové modři. Funkcí sacharózy bylo, aby nanášený vzorek DNA lépe klesl na dno jamek v gelu a bromfenolová modř sloužila pro vizuální detekci průběhu reakce jinak bezbarvých vzorků. Na gel byly dále kvůli detekci mutací naneseny tyto 54

látky 3 µl Molekular Weight Markeru XIII, 3 µl pozitivní kontroly a 3 µl negativní kontroly (voda). Celkem elektroforéza probíhala 1,5 hod při napětí 100 V. Po ukončení reakce byl gel pro detekci potencionálních mutací vyjmut z vany a přenesen pod UV transluminátor, kde byly pořízeny následující obrázky č. 11, 12, 13. Pokud byla ve vzorku přítomna mutace C282Y v homozygotní formě bylo možné na gelu vidět tři fragmenty o délkách 133, 38 a 18 bp. Pokud byla mutace ve formě heterozygotní, byly fragmenty také tři s délkami 171, 133, 18 bp. Pokud vzorek neobsahoval žádnou mutaci, tj. restrikční místo zůstalo nezměněno, tak byla DNA polymerázou ho rozštěpena na dva řetězce, v gelu patrné jako fragmenty o délkách 171 a 18 bp. Na následujícím obrázku č. 11 je zobrazen gel s nálezem dvou heterozygotních forem mutace C282Y. 2642 bp 750 bp 500 bp 250 bp 200 bp 100 bp 50 bp 171 bp 133 bp 18 bp M + 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 18 bp Obrázek č. 11 Gelová elektroforéza C282Y mutace Poznámky k obrázku č. 11: Fragmenty získané z RFLP reakce byly separovány na 2 % agarózovém gelu. Do pozice M byl nanesen Molecular Weight Marker XIII od firmy Roche Diagnostics a pozice + obsahovala pozitivní kontrolu. V následujících pozicích 1-13 byly naneseny dárcovské vzorky pozitivní náleze heterozygotní formy mutace byl zaznamenán v pozicích 1 a 7, všechny ostatní vzorky byly bez zátěže mutace. Při nálezu mutace H63D ve vzorku se v gelu nachází jeden fragment s délkou 208 bp. Pokud byla mutace přítomna ve formě heterozygotní, na gelu se vyskytovaly tři fragmenty o délkách 208, 140, 68 bp. Při nepřítomnosti mutace, se na gelu nacházely dva fragmenty s délkami 140 a 68 bp. Na následujícím obrázku č. 12 je zobrazen gel s výskytem třech heterozygotních vzorků. 55

2642 bp 750 bp 500 bp 250 bp 200 bp 100 bp 50 bp 208 bp 140 bp 68 bp M + 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Obrázek č. 12 Gelová elektroforéza H63D mutace Poznámky k obrázku č. 12: Fragmenty z RFLP reakce byly separovány na 2 % agarózovém gelu. Do pozice M byl nanesen Molecular Weight Marker XIII od firmy Roche Diagnostics a pozice + obsahovala pozitivní kontrolu. V následujících pozicích 1-13 byly naneseny dárcovské vzorky pozitivní náleze heterozygotní formy mutace byl zaznamenán v pozicích 7, 11 a 12, všechny ostatní vzorky byly bez zátěže mutace. Mutaci S65C v homozygotní formě bylo možné na gelu rozpoznat podle přítomnosti jednoho fragmentu o délce 208 bp. Jestliže byla mutace přítomna ve formě heterozygotní, byly fragmenty tři o délkách 208, 147, 61 bp. Pokud nebyla přítomna mutace, pak bylo možné na gelu vidět dva fragmenty s délkami 147 a 61 bp. Na následujícím obrázku č. 13 je zobrazen gel s nálezem heterozygotní formy této mutace. 2642 bp 750 bp 500 bp 250 bp 200 bp 100 bp 50 bp 208 bp 147 bp 61 bp M + 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Obrázek č. 13 Gelová elektroforéza S65C mutace Poznámky k obrázku č. 13: Fragmenty byly separovány na 2 % agarózovém gelu. Do pozice M byl nanesen Molecular Weight Marker XIII od firmy Roche Diagnostics a pozice + obsahovala pozitivní kontrolu. V následujících pozicích 1-13 byly naneseny dárcovské vzorky pozitivní náleze heterozygotní formy mutace byl pouze v pozici 3, všechny ostatní byly bez zátěže mutace. 56

9.5. Statistické metody Při statistickém výpočtu dat tj. průměrných hodnot, celkových počtů aj. byl v této práci využíván program Microsoft Office Excel verze 2011. 57

10. Výsledky Výše zmíněnými metodami jsme u daného vzorku české populace získali následující data. Z celkového počtu 167 vzorků jich bylo 19 (11,38 %) zatíženo mutací C282Y, 38 (22,75 %) mutací H63D a 2 (1,20 %) mutací S65C. Konkrétně se jednalo o nález 3 (1,80 %) složených heterozygotů C282Y/H63D, 16 (9,58 %) heterozygotů C282Y/Zdravá alela, 3 (1,80 %) homozygotů H63D/H63D, 32 (19,16 %) heterozygotů H63D/zdravá alela, 2 (1,20 %) heterozygotů S65C/zdravá alela. U žádného vzorku nebyla prokázána homozygotní forma C282Y ani S65C mutace, dále nebyl nalezen žádný výskyt složených heterozygotů C282Y/S65C ani H63D/S65C. Tyto informace přehledně ukazuje tabulka č. 9 a graf č. 10. Výskyt mutací v HFE genu C282Y H63D S65C Testované osoby wt/wt M/wt M/M wt/wt M/wt M/M wt/wt M/wt M/M Muži 57 8 0 53 10 2 64 1 0 Ženy 91 11 0 76 25 1 101 1 0 Celkem 148 19 0 129 35 3 165 2 0 Tabulka č. 9 Populační výskyt mutací v HFE genu v ČR získaný z naší studie Poznámky: wt = wild type, M = mutant type, wt/wt = zdravé obě alely, M/wt heterozygotní forma mutace, M/M = homozygotní forma mutace Typ mutace Počet hodnocených alel Alelová frekvence (%) wt M wt M C282Y 315 19 94,31 5,69 H63D 293 41 87,72 12,28 S65C 332 2 99,40 0,6 Tabulka č. 10 Získaná alelová frekvence mutací v HFE genu 58

Genotypová frekvence (%) Typ mutace wt/wt wt/m M/M C282Y 88,62 11,38 0 H63D 77,25 20,96 1,80 S65C 98,80 1,20 0 Tabulka č. 11 Získaná genotypová frekvence mutací v HFE genu Nález mutací ve zdravé české populaci C282Y/H63D (n=3) C282Y/Zdravá alela (n=16) H63D/H63D (n=3) H63D/Zdravá alela (n=32) S65C/Zdravá alela (n=2) Graf č. 10 Znázornění zastoupení mutací v HFE genu v populaci ČR získané z naší studie 59

11. Diskuse V rámci námi předkládané studie bylo celkem vyšetřeno 167 anonymních dárců ze zdravé populace na přítomnost mutací C282Y, H63D, S65C v HFE genu. Přestože je v běžné praxi nejčastěji používaný biologický materiál pro získání jaderné DNA žilní krev, v této studii byl použit nejvhodnější alternativní zdroj, a to stěr z bukální sliznice. Díky jeho výhodám nám bylo umožněno otestování relativně velkého množství zdravé populace. Mezi jeho největší přednosti patří, že se jedná o snadno proveditelný neinvazivní zákrok, pro který není limitující věk ani zdravotní stav. Na rozdíl od odběru krve, který musí být proveden ve zdravotnickém zařízení odborným personálem a bývá ovlivněn věkem (novorozenci, geronti) či zdravotním stavem (i.v. užívání drog, stav po transplantaci KD, onemocnění krve, špatný žilní přístup aj.) testovaného. Naopak mezi nevýhody bukálního stěru patří poměrně lehká kontaminace vzorku během odběru mikroorganismy, obsaženými v mikroflóře dutiny ústní. Tyto mikroorganismy obsahují ve svých buněčných stěnách polysacharidy, o kterých je známo, že fungují jako inhibitory PCR. Dále je určité riziko vzniku kontaminace vzorku při jeho skladování, kdy v uzavřené, neprodyšné odběrové nádobce mají mikroorganismy, zvláště kvasinky, ideální podmínky pro svůj růst. Ke vzniku komplikací tohoto typu při správném odběru krve nedochází 47,48. U námi náhodně vybraného vzorku zdravé populace v České republice byly pomocí kombinací molekulárně biologických metod PCR a RFLP a detekcí metodou gelové elektroforézy stanoveny mutace v HFE genu. Nejčastěji se vyskytující genotyp byl u mutace H63D a to v heterozygotní formě až u 20,96 % osob, následovala heterozygotní forma mutace C282Y u 11,38 % osob a nejnižší výskyt byl zaznamenán u heterozygotní formy mutace S65C 1,20 %. Alelová frekvence mutace H63D je tedy 12,28 %, mutace C282Y 5,69 % a mutace S65C 0,6 %. První populační screening na území České republiky, provedla skupina Čimburkové a kol. Tento projekt probíhal v roce 2005 a jako zdroj DNA pro jejich studii byly použity vzorky krve od novorozenců ve formě Gutriho karet. Během této studie byla zjištěna alelová frekvence 3,6 % pro mutaci C282Y, 15 % pro mutaci H63D a 1,4 % pro mutaci S65C u zdravých osob. 60

Pokud porovnáme výsledky studie Čimburkové a kol. s našimi výsledky, zjistíme, že se přibližně shodují, což můžeme vidět v následujícím grafu č. 11. Jejich hodnoty byly lehce vyšší pro mutace H63D a S65C, naše byly naopak vyšší u mutace C282Y. Alelová frekvence mutací v HFE genu u zdravé populace v ČR dle studie Čimburkové a kol. Alelová frekvence mutací v HFE genu u zdravé populace v ČR dle naší studie 3,60% 15,00% 5,69% 12,28% 1,40% 0,60% 80,00% 81,43% C282Y H63D S65C Zdravá populace C282Y H63D S65C Zdravá populace Graf č. 11 Alelová frekvence mutací C282Y, H63D, S65C V rámci světových studií byl populačních screening proveden skoro u všech zemí Evropy a v této práci jsou citovány i výsledky asijských a amerických zemí. V Evropě bylo provedeno mnoho studií zaměřených na výskyt mutace C282Y, souhrnně na základě jimi získaných dat můžeme Evropu rozdělit podle výskytu mutace na čtyři části: více než 11 %, 5-5,2 až 10,1 %, 3,2-4 % a méně než 3,2 %. Do skupiny s průměrným výskytem mutace 5-5,2 až 10-10,1 % spadá Norsko (6,8 %) 21, Faerské ostrovy (8,0 %) 30, Francie (6,1 %) 19, Dánsko (5,6 %) 21. V rozmezí 3,2-4 % se mutace vyskytuje v Maďarsku, Finsku, Německu (3,8 % 9 ), Rusku (3,5 %), Chorvatsku (3,4 %), Slovenské republice (4 %). Státy s nižším výskytem než 3,2 % jsou převážně jižanské, což svědčí o poklesu mutace směrem k jihu Evropy. Pokud bychom měli zařadit námi získaná data o výskytu mutace C282Y podle výše zmiňovaných kritérií, Česká republika by se nacházela při nižší hranici průměrného výskytu, podobně například jako Dánsko. Tento fakt je možné zjistit i z grafu č. 12., kde jsou graficky znázorněny rozdíly ve vybraných zemích Evropy. 61