Hmotnostní spektrometrie peptidů ů a proteinů Petr Halada Mikrobiologický ústav AV ČR halada@biomed.cas.cz

Proč chceme znát molekulovou hmotnost? Všechny prvky a molekuly jsou charakterizovány 2 základními veličinami Frekvence (ν) Spektroskopie (UV, IR, fluorescence, NMR, ) Rentgenová difrakce Molekulová hmotnost (m) sedimentace/centrifugace chromatografie elektroforéza hmotnostní spektrometrie

Hmotnostní spektrometrie Metoda umožňující určit molekulovou hmotnost chemických látek Prvky a molekuly jsou charakterizovány svou hmotností a tou se vzájemně odlišují Měříme pseudomolekulární ionty v plynné fázi (M +, M+H +, M+Na +, M-H -, atd.)

Hmotnostní spektrometrie Hmotnostní spektrometr generuje ze vzorku ionty v plynné fázi, rozdělí je podle poměru hmoty a náboje (m/z) a zaznamená hmotnostní spektrum = grafické znázornění četnosti iontů na hodnotě m/z Fragmentace iontů v hmotnostním spektrometru umožní získat strukturní informaci, která se využívá při: - identifikace látek - určení struktury

Hmotnostní spektrometr Normální tlak Snížený tlak Vložení vzorku Iontov tový zdroj Hmotnostní analyzátor Detektor tor Počítač m/z!

Tandemová hmotnostní spektrometrie MS/MS fragmentace iontů Izolace iontu podle m/z Separace fragmentů podle m/z Iontový zdroj Hmotnostní analyzátor 1 Hmotnostní analyzátor 2 Detektor tor Vznik iontů v plynné fázi Kolizní cela Detekce fragmentových iontů

Izotopy Chemické prvky se vyskytují v přírodě jako směs izotopů Uhlík: 98.90% 12 C 1.10% 13 C Monoizotopická hmotnost 12.000000/13.003355 Průměrná hmotnost 12.011 Br 50.69% 79 Br 49.31% 81 Br Monoizotopická hmotnost 78.918/80.916 Průměrná hmotnost 79.904

Kolik hmotností máme? Celočíselná CH 3 Br: 12 + 3 x 1 + 80 = 95 Průměrná (vážený průměr všech izotopů daného prvku podle % zastoupení) CH 3 Br = 12.01115 + 3 x 1.00797 + 79.90400 = 94.93906 Monoizotopická (součet přesných hmotností "nejlehčích" izotopů prvků) CH 3 Br = 12.000000 + 3x 1.007825 + 78.918336 = 93.941011

Kolik hmotností máme? Monoizotopická vs. Průměrná MW M mono < M avg Glukosa C6H12O6 M mono = 180.0633; M avg = 180.1576 Peptid C113H171N27O31S1 M mono = 2434.2354 ; M avg = 2435.8301

Přítomnost izotopů ( 13 C, 15 N, 18 O, ) se projeví na tvaru píku. 13 C je 1.1%, tj. na každých 100 uhlíků je jeden 13 C více uhlíků -> více 13 C, to se projeví na tvaru píku Intenzita druhého izotopu je 1.1 x počet C získáme % intenzity prvního píku.

Izotopický klastr 12 C: 98.90% 13 C: 1.10 % 10x 12 C, no 13 C 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 12 C 1 13 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 120 C 10 121 9x 12 C, 1x 13 C 122 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 1,200 1,202 C 100 1,204 1,206 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 12,000 12,010 C 1000 8x 12 C, 2x 13 C 12,020 12,030

Kouzla s izotopy 32 S a 34 S 79 Br a 81 Br

Hmotnostní spektrum Signály iontů ve spektru jsou charakterizovány: poměrem hmotnosti a náboje m/z intenzitou rozlišením 100% Základní pík Rel. intenzita m/z

Rozlišení R= m m m=fwhm Full Width at Half Maximum h m ½ h m Př. - rozlišení 50000 znamená, že odlišíme dvě látky, lišící se o 1/50000 MW 1296.6775 a 1296.7034 Jednotkové rozeznáme m/z 100 od 101 kvadrupóly a iontové pasti

Rozlišení R = 1000 (blue), 3000 (red), 10,000 (green) and 30,000 (black) IT vs. ToF vs. FT-ICR analyzátor

Absolutní Přesnost Da Dalton - 0.1 0.0001 Relativní (mění se podle m/z) % ppm parts per million: 100 0.1 ppm (Mteor - Mexp)/Mteor x 10 6 1 0 0 0. 0 0 0 0 Iontová past 100-1000 ppm TOF 10-100 ppm FT-ICR 0.1 1 ppm

Unikátní vlastnosti hmotnostní spektrometrie Specifita Rychlost Citlivost Jednoduchá interpretace dat

Čísla k zapamatování (1 mol ~ 6.023 x 10 23 molekul) molů 10-9 1 zrnko soli ~ 1 ug ~ 20 nmol molekul 10 15 10-12 10-15 1-10 pmol pro CBB 1 pmol pro Edmanovo odb. 100 fmol pro stříbrem - barvené gely 2 fmol: jedna kopie v 10 9 buněk 10 12 10 9 10-17 10 amol: ICR FTMS 10 6 10-21 10 zmol: Iontová past (300-1000 iontů) 10 3

Ionizační metody EI Electron Impact CI Chemical Ionization APCI / APPI Atmospheric Pressure Chemical Ionization / Photo Ionization FD Field Desorption PD Plasma Desorption FAB Fast Atom Bombardment ESI / nanoesi ElectroSpray Ionization MALDI Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization

1988 Elektrosprej J.B. Fenn Fenn JB; Mann M; Meng CK; Wong SF; Whitehouse CM: Science 1989, 246, 64. 1994 nanoelektrosprej M. Mann a M. Wilm

Ionizace elee lektrosprejemrejem Rozpouštědlo/Pufr + + + + + + + + + ESI jehla (2-55 kv) Vstupní otvor (0-50 V) Vyhřívaná kapilára Iontový svazek

Ionizace elee lektrosprejemrejem Velmi měkká ionizace Malá nebo téměř žádná fragmentace Mnohonásobně nabité ionty 1, 2, 3, 60x Proteiny, peptidy, oligosacharidy, nukleotidy, syntetické polymery... Nekovalentní komplexy (proteinové komplexy, komplexy protein-ligand, atd.) Vhodná pro kvantifikaci Vysoká náročnost na čistotu Napojitelné na LC Spojení s jakýmkoliv analyzátorem

1987 Desorpce laserem za přítomnosti matrice K. Tanaka / M. Karas, F. Hillenkamp Karas M; Bachmann D; Bahr U; Hillenkamp F: Int. J. Mass Spectrom. Ion Proc. 1987, 78, 53. Tanaka K; Waki H; Ido Y; Akita S; Yoshida Y; Yoshida T: Rapid Commun. Mass Spectrom. 1988, 2, 151.

MALDI ionizační proces

MALDI ionizační proces 1 mm MALDI destička krystaly matrice a vzorku

MALDI ionizační proces MALDI matrice silná absorpce vlnové délky laseru ε (matrice) >> ε (analytu) stabilita ve vakuu, netěkavá přenos protonu (na analyt / z analytu) ionizace mísitelná se vzorkem v tuhé fázi vzorek : matrice = 1 : 10 4-10 5 solventy : MeOH, EtOH, MeCN, H 2 O, THF, aceton... UV-MALDI 337 nm dusíkový laser 355 nm Nd:YAG 266 nm Nd:YAG solid state 1-200 Hz IR-MALDI 2.94 mm Er:YAG laser 10.6 mm CO 2 laser

MALDI matrice kys. 2,5-dihydroxybenzoová (DHB) kys. α-kyano-4-hydroxyskořicová (CCA) kys. sinapová (SA) (kys. 3,5-dimethoxy-4-hydroxyskořicová) kys. ferulová (FA) (kys. 4-hydroxy-3-methoxyskořicová)

Nanesení vzorku na MALDI destičku analyt (10-5 -10-6 M) "Dried droplet" matrice (5-50 g/l) MS

Nanesení vzorku na MALDI destičku "Thin-layer" matrice (CCA, sinapová kys.) v acetonu, 1% voda analyt (10-5 -10-6 M) tenká homogenní vrstva krystalů promytí MS

MALDI matrice 1 mm 1 mm CCA - dried droplet DHB - dried droplet CCA - thin layer DHB - dried droplet špatná příprava

MALDI ionizační proces Měkká ionizace Malá nebo žádná fragmentace, jednoduchá interpretace Jednonásobně nabité ionty [M+H] + ; [M-H] - Analýza komplexních směsí Rychlá a jednoduchá příprava a analýza Proteiny, peptidy, oligosacharidy, nukleotidy syntetické polymery... Tolerantní k detergentům, solím Krátké laserové pulsy; t ~ ns Spojeno s TOF analyzátorem ALE...

Analyzátory q, MSQ quadrupole (Mono Stage Quadrupole) TSQ Triple Stage Quadrupole (QqQ) qit quadrupole Ion Trap LT Linear Ion Trap Sector B/E geometry TOF Time Of Flight FT-ICR Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Hybridní (q-tof, TOF-TOF, q-ft-icr, LT-FT-ICR)

Linearní Time Of Flight (TOF) analyzátor E kin = ½ mv 2

Time Of Flight (TOF) Analyzátor s reflektronem

Post-Source ource Decay (PSD) získání PSD spektra - postupné snižování U reflektronu záznam segmentů velmi pracné a zdlouhavé

TOF/TOF - LIFT metoda

Kvadrupólový analyzátor a iontová past stejný princip - ovlivňování pohybu iontů oscilujícím elektrickým polem velmi rozšířené relativně jednoduchá obsluha a udržba vhodné pro rutinní spojení se separačními metodami

Kvadrupólový analyzátor všechny ionty nerezonující iont + iont v rezonanci - - z iontového zdroje + do detektoru - + + + + nerezonující iont iont v rezonanci - Rf

Trojnásobný kvadrupól N 2 RF Fokusace iontů Q1 Q2 Kolizní cela Q3 Detektor Prekursorové ionty Fragmentace (CAD) Produktové ionty

Sférická iontová past 3D z iontového zdroje do detektoru vstupní koncová elektroda středová prstencová elektroda výstupní koncová elektroda

Proč je v pasti helium? snížení kinetické energie iontů zvýšení citlivosti pomáhá udržet ionty ve středu iontové pasti zvýšení rozlišení a citlivosti slouží jako kolizní plyn, vyvolává fragmentaci

Q-TOF

FT-ICR Iontově cyklotronová rezonance s Fourierovou transformací Pohyb iontů v magnetickém poli - iont s hmotností m a nábojem q, pohybující se s rychlostí v v homogenním magnetickém poli se silou B: F = mv 2 /r F = qv x B

FT-ICR Iontově cyklotronová rezonance s Fourierovou transformací A B + + Iont pohybující se po cyklotronové orbitě s frekvencí danou vztahem: 2πf = qb m Poloměr běžné cely: 1-3 cm Počáteční poloměr pohybu iontu: 0.01-0.1 mm Běžná síla magnetického pole: 1-12 Tesla např. 7T magnet, m/z 100, 1 sec 1000 000 cyklů (30 km)

FT-ICR Iontově cyklotronová rezonance s Fourierovou transformací Koherentní cyklotronový pohyb indukuje proudový obraz, který je amplifikován a detekován. Přítomnost iontů s různými m/z se projeví jako superpozice sinusoidalních signálů na detektoru. excelentní rozlišení (~ 10 6 ) a přesnost 1-0.1 ppm

FT-ICR Rozlišení

Hmotnostní spes pektrometrie v analýze biomolekul Kontrola kvality/čistoty Určení MW Identifikace Sekvenování Charakterizace modifikací Studium nekovalentních komplexů Analýza směsí Relativní/absolutní kvantifikace Studium 3D struktury s nízkým rozlišením

Určení MW MALDI

100 Určení MW ESI 6+ R ~ 31.000 5+ 100 1147.556 1147.766 1147.347 1147.968 % 1147.137 1148.177 1148.386 % 1146.928 1148.588 1148.805 1149.007 0 1147 1148 1149 m/z 7+ 4+ 0 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 m/z

Relativní intensita NH 3 + A R NH 3 + G S S R A A R NH 3 + NH 3 + R S T R R NH 3 + NH 3 + V NH 3 + 4+ 5+ 6+ 7+ 3+ NH 3 + R A A R A R G S S NH 3 + 2+ 1+ NH 3 + R A A R A R R S T R R NH 3 + V G S S NH 3 + R S T R R V m/z

Určení MW ESI Dekonvoluce

Identifikace proteinů = otisk prstu člověka "fingerprint" = fingerprint proteinu/ů

Identifikace proteinp roteinu - princip

Štěpení proteinů Trypsin K/R- \-P Chymotrypsin Y/W/K/F- \-P AspN -D GluC E-, E/D- \-P ArgC R- \-P LysC K- \-P CNBr M-

Důležitá je přesnost Čím vyšší přesnost měření, tím méně peptidů potřebujeme pro bezchybnou identifikaci 1 0 0 0. 0 0 0 0 Iontová past 100-1000 ppm TOF 10-100 ppm FT-ICR 0.1 1 ppm

groel protein * ATP synthase

Parametry ovlivňující ID proteinu Databáze NCBInr Swissprot vlastní Taxonomie Fyzikálně-chemické Přesnost měření MW a pi (- odhad z 2D gelu), použitá proteáza závisí na spektrometru a kalibraci spektra Biochemické Neúplné štěpení Modifikace Např. trypsin : AFHYTDKILGCVR úplná alkylace cysteinu částečná oxidace methioninu

Identifikace proteinu Protein na gelu nebo v roztoku Štěpení proteinu Peptidové mapování/ Peptidový fingerprinting Bez výsledku Peptidové mikrosekvenování (PSD, MS/MS)

Peptidové sekvenování

Full MS Mass range(350 (350-1800) Scan 1479 Full MS/MS (CID) Scan 1480 Precursor 667.7

Data-Dependent Dependent MS & Dynamic Exclusion 100 90 1 735.7 Relative Abundance 80 70 60 50 40 30 490.9 20 3 4 5 971.4 1469.9 903.0 10 588.5 1070.7 1213.7 1353.8 1500.6 1666.7 1786.0 0 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 m/z 2

Fragmentace peptidu b 1 b 2 b 3 R 1 R 2 R 3 R 4 NH 2 -CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO 2 H N-konec C-konec y 3 y 2 y 1

Fragmentace ace peptidu S-P-A-F-D-S-I-M-A-E-T-L-K MH + = 1410.6 b-ions + y-ions + 88.1 S PAFDSIMAETLK 1323.6 185.2 SP AFDSIMAETLK 1226.4 256.3 SPA FDSIMAETLK 1155.4 403.5 SPAF DSIMAETLK 1008.2 518.5 SPAFD SIMAETLK 893.1 605.6 SPAFDS IMAETLK 806.0 718.8 SPAFDSI MAETLK 692.3 850.0 SPAFDSIM AETLK 561.7 921.1 SPAFDSIMA ETLK 490.6 1050.2 SPAFDSIMAE TLK 361.5 1151.3 SPAFDSIMAET LK 260.4 1264.4 SPAFDSIMAETL K 147.2

Přehled aminokyselin v číslech AK Hmotnost Boční řetězec Immoniové ionty G Gly 57.02 1 30 A Ala 71.08 15 44 S Ser 87.03 31 60 P Pro 97.05 41 70 V Val 99.07 43 72 T Thr 101.05 45 74 C Cys 103.01 47 76 L Leu 113.08 57 86(72) I Ile 113.08 57 86(72) N Asn 114.04 58 87(70) D Asp 115.03 59 88 Q Gln 128.06 72 101(84, 129) K Lys 128.09 72 101(129, 112, 84, 70) E Glu 129.04 73 102 M Met 131.04 75 104(61) H His 137.06 81 110(166, 138, 123, 121, 82) F Phe 147.07 91 120(91) R Arg 156.10 100 129(112, 100, 87, 73, 70, 59) Y Tyr 163.06 107 136 W Trp 186.08 130 159

m/z 699.62 tryptic digest (-K/-R) [M+H] + = 1398.24 ends with -K AAAAAAAAAAAAAAGAAGK KG A A 6A G A A A A A A A A A A A A A A A A G A A A A 2A G K 2A

(our) MASCOT MS/MS

Bottom up vs. Top down identifikace proteinů Štěpení proteinu/směsi MS, MS/MS (na úrovni peptidů) LC-MS(/MS) DTB prohledávání na bázi PMF, MS/MS Pre-frakcionace Purifikace v plynné fázi Určení přesné MW MS/MS proteinu DTB prohledávání pomocí MW proteinu a sekvenčního tagu Zachována informace o PTM Vyžaduje FT-ICR MS

TopDown http://kelleher.scs.uiuc.edu/

Čichám Čichám PTMs PostTranslační Modifikace změna MW Disulfidické můstky (Cys-Cys) Glykosylace Fosforylace Acylace Oxidace Acetylace Zkrácení proteinu Ztráta N-konc.Met Glu -> pyro-glu

Disulfidické můstky A - určení zda jsou nebo nejsou přítomné diferenční alkylace B určení kolik Cys je volných a kolik vázaných 1. denaturace, alkylace činidlem I (u menších proteinů lze rovnou měřit MS) 2. redukce a alkylace činidlem II 3. štěpení a MS, LC-MS/MS určení C přímá identifikace disulfidů - štěpení + LC-MS (FT- ICR) hledání disulfidicky spojených peptidů podle přesné hmotnosti bez redukce/alkylace

Diferenční alkylace celý protein

Glykosylace N- a O-glykosylace 1. Charakterizace sacharidových struktur+určení heterogenity 2. Nalezení míst glykosylace 3. Přiřazení struktur na jednotlivá glykosylační místa

N-glykosylace 1. Charakterizace sacharidových struktur+určení heterogenity 2. Nalezení míst glykosylace 3. Přiřazení struktur na jednotlivá glykosylační místa 1. a) uvolnění glykanu(-ů) enzymaticky PNGasa F, Endo H, Endo F1-3, postupné odštěpování pomocí exoglykosidas, Pronasa chemicky hydrazinolýza, alkalické štěpení, TMSF (pouze deglykosyluje ničí sacharid) b) charakterizace glykanů NMR, MS, MS/MS, permethylace+ms/ms, exoglykosidasy+ms 2. a) Edmanovo odbourávání nejlépe glykopeptidy peptidy po EndoH b) deglykosylace PNGasouF v H 2 16 O a H 2 18 O (+ štěpení AspN) PNGasa F mění Asn na Asp (vzniká zásahové místo pro AspN) 3. Štěpení proteinu izolace glykopeptidů a opakovaní postupu na jednotlivých glykopeptidech

Fosforylace Signalizace, aktivace, S, T, Y, H Ztráta (P) skupiny: -98, -80 - Směrovaná MS analýza (neutrální ztráta, precursor ion scanning, negativní mód) Nabohacení protilátky, IMAC, TiO 2 Působení fosfatázy + diferenční mapování

Fosforyla orylace A 100 90 80 32.82 43.30 B Relative Abundance Relative Abundance 70 60 50 40 30 20 10 0 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 37.35 26.65 28.01 30.03 35.93 39.31 42.42 28.98 34.11 41.13 44.33 29.96 26.12 35.91 49 Da neutrální ztráta Možné fosfopeptidy 27.71 42.45 24.90 28.86 31.01 32.90 34.27 37.38 39.09 40.33 41.26 43.87 44.94 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 Tim e (m in)

IMAC Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography IDA (iminodiacetic acid) NTA (nitrilo-triacetic acid) Iont kovu Ga 3+, Fe 3+ Nespecifická vazba esterifikace

IMAC Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography P P Protein digestion P P P P Protein digestion P P Fe(3 + ) IMAC enrichment

Obohacení fosfopeptidů pomocí TiO 2

Obohacení fosfopeptidů pomocí TiO 2