Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav Technologie potravin Vliv konzumace fermentovaných mléčných výrobků na modulaci střevní mikroflóry Diplomová práce Vedoucí práce: Ing. Doubravka Rožnovská, Ph.D. Vypracovala: Bc. Miroslava Daňková Brno 2012
PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma Vliv konzumace fermentovaných mléčných výrobků na modulaci střevní mikroflóry vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně. dne. podpis diplomanta.
PODĚKOVÁNÍ Děkuji Ing. Doubravce Rožnovské, Ph.D. za odborné a vlídné vedení, rady a čas, který mi při zpracování diplomové práce věnovala. Děkuji Ing. Pavle Sládkové, Ph.D. a Ing. Miroslavě Kolářové za odborné rady a vedení praktické části diplomové práce. Zvláště pak děkuji Ing. Kolářové za poskytnutí dílčích výsledků její disertační práce. Děkuji za finanční podporu IGA MENDELU IP 19/2011. Děkuji i společnosti Hollandia Karlovy Vary a.s za poskytnutí vzorků a všem dobrovolníkům, kteří se zúčastnili pokusu. Současně děkuji své rodině a příteli za podporu a trpělivost během studia.
ABSTRAKT Vliv konzumace fermentovaných mléčných výrobků na modulaci střevní mikroflóry Diplomová práce se zabývá problematikou složení lidské střevní mikroflóry a jejím ovlivněním za pomocí kysaných mléčných výrobků. Bližší pozornost je v praktické části věnována počtu bakterií rodu Enterococcus, Bifidobacterium a Lactobacillus acidophilus ve střevech, který je ovlivněn konzumací probiotických a synbiotických jogurtů. Pro experiment byly vytvořeny tři skupiny dobrovolníků. V každé skupině bylo zapojeno 22 studentů. Experiment trval 38 dní. Byl rozčleněn do tří fází: adaptační, konzumace, doznívání. Skupina kontrolní po dobu pokusu nekonzumovala žádné kysané mléčné výrobky, skupina probiotická konzumovala jogurt s probiotickou kulturou a skupina synbiotická konzumovala jogurt s probiotickou kulturou a s přídavkem inulinu. V průběhu pokusu byly odebírány vzorky stolice, které byly podrobeny mikrobiologickému vyšetření na selektivních živných půdách. Po zahájení konzumace jogurtů se zvýšil počet bakterií ve vzorcích stolice u všech tří bakteriálních rodů. Mezi 14. a 21. dnem konzumace se počet bifidobakterií i laktobacilů postupně snižoval, pokles pokračoval i v době doznívání. U enterokoků se počet začal snižovat až v době doznívání (po 21. dnu). U synbiotické skupiny se počet bifidobakterií začal snižovat také až ve fázi doznívání, což naznačuje pozitivní vliv inulinu v jogurtu. Klíčová slova: střevní mikroflóra, kysané mléčné výrobky, probiotika, prebiotika, synbiotika
ABSTRACT The effect of consumption of fermented dairy products according to the modulation of intestinal microflora This thesis deals with the composition of human intestinal microflora and how it is affected by fermented dairy products. The practical part is dedicated to variaty of bacteria of the genus Enterococcus, Bifidobacterium and Lactobacillus acidophilus in the bowel which is affected by consumption of probiotic and symbiotic yoghurt. There were created three groups of volunteers for the experiment. In each group were involved 22 students. The experiment lasted 38 days. It was divided into three phases: adaptation, consumption and subside. Control group did not consume fermented dairy products during the experiment, the second group consumed probiotic yoghurt with probiotic cultures and synbiotic group consumed yoghurt with probiotic cultures and appended inulin. During the experiment stool samples were colected. Those were used to microbiological testing on the selective nutrient soils. After the initiation phase of the consumption of yoghurt has increased the number of bacteria in fecal samples from all three bacterial genera. Between the 14th and the 21st day of consumption the number of bifidobacteria and lactobacillus gradually decreased, the decrease continued even during the subside phase. As for enterococcus, the number began to decrease in the subside phase (after 21. days). In synbiotic group, the number of bifidobacteria also decreased in the subsidie phase, and that indicates a positive effect of inulin. Key words: intestinal microflora, fermented dairy products, probiotics, prebiotics, synbiotics
OBSAH 1 ÚVOD... 10 2 CÍL PRÁCE... 11 3 LITERÁRNÍ PŘEHLED... 12 3.1 Fermentované (kysané) mléčné výrobky... 12 3.1.1 Biologická hodnota a dietetický význam... 12 3.1.2 Dělení kysaných mléčných výrobků... 13 3.1.3 Dělení podle použitých mikroorganismů... 13 3.1.4 Základní tržní skupiny... 14 3.1.5 Hlavní stupně výroby fermentovaných mléčných výrobků... 16 3.2 Bakterie mléčného kysání... 19 3.2.1 Vlastnosti a využití bakterií mléčného kysání... 20 3.2.2 Dělení bakterií mléčného kysání... 20 3.2.3 Vybrané rody bakterií mléčného kysání... 21 3.3 Čisté mlékárenské kultury... 24 3.3.1 Jogurtová kultura... 24 3.4 Trávení... 25 3.5 Střevní mikroflóra člověka... 26 3.5.1 Osídlení střevního traktu... 28 3.6 Probiotika, prebiotika, synbiotika... 30 3.6.1 Probiotika... 31 3.6.2 Prebiotika... 40 3.6.3 Synbiotika... 44 4 MATERIÁL A METODIKA... 45 4.1 Materiál... 45 4.1.1 Jogurty Hollandia... 45 4.1.2 Kultivační média... 45
4.1.3 Roztoky... 45 4.1.4 Přístroje a pomůcky... 46 4.1.5 Vzorek... 46 4.2 Metodika... 47 4.2.1 Příprava experimentu... 47 4.2.2 Průběh experimentu... 47 4.2.3 Harmonogram experimentu... 48 4.2.4 Odběr vzorků... 49 4.2.5 Mikrobiologická analýza vzorků stolice a měření ph jogurtů... 49 4.2.6 Stanovení rodu Bifidobacterium... 49 4.2.7 Stanovení bakterií rodu Enterococcus... 50 4.2.8 Stanovení bakterií rodu Lactobacillus acidophilus... 51 4.2.9 Vyhodnocení... 53 4.2.10 Rodová a druhová identifikace... 53 4.3 Statické vyhodnocení... 56 5 VÝSLEDKY... 56 5.1 Stanovení mikroorganismů ve vzorcích stolice... 56 5.2 Stanovení ph jogurtů... 60 6 DISKUZE... 61 6.1 Vliv konzumace jogurtů na celkový počet bakterií Enterococcus... 63 6.1.1 Výsledky našeho experimentu... 63 6.1.2 Výsledky jiných studií v porovnání s naším pokusem... 63 6.2 Vliv konzumace jogurtů na celkový počet bakterií Bifidobacterium a Lactobacillus acidophilus... 64 6.2.1 Výsledky našeho experimentu u bakterií Bifidobacterium... 64 6.2.2 Výsledky našeho experimentu u bakterií Lactobacillus acidophilus... 64 6.2.3 Výsledky jiných studií v porovnání s naším pokusem... 64
7 ZÁVĚR... 66 8 POUŽITÁ LITERATURA... 67 9 SEZNAM TABULEK A OBRÁZKŮ... 73
1 ÚVOD Dnešní uspěchaný životní styl spolu s dalšími faktory, jako je charakter stravy, užívání léků může mít negativní vliv na složení a správnou funkci střevní mikroflóry. Některé potraviny neplní jen funkci dodavatele základních živin, ale mají i pozitivní účinky na zdraví. Takovým potravinám se říká funkční. Patří mezi ně zakysané mléčné výrobky s přídavkem živých bakterií mléčného kvašení. Jedná se především o bakterie z rodů Lactobacillus, Bifidobacterium a Streptococcus. Kysané mléčné výrobky mají velmi dlouhou výrobní tradici. Jedná se o různé jogurty, acidofilní, kefírová nebo jogurtová mléka, kysanou smetanu, podmáslí, mléčný zákys apod. Kysané mléčné výrobky mají relativně nízkou energetickou hodnotu, jsou bohatým zdrojem plnohodnotných bílkovin, vápníku, fosforu a různých vitaminů. Velmi významné jsou především kysané mléčné výrobky s přídavkem probiotických bakterií (zástupci z rodu Lactobacillus a Bifidobacterium). Probiotické bakterie působí blahodárně na zdraví tím, že zlepšují mikrobiální rovnováhu v zažívacím traktu. Kultury bakterií musí být schopné přežít průchod trávicím traktem a dále musí být schopné se ve střevě množit. Je prokázané, že zmírňují obtíže způsobené změnou složení střevní mikroflóry např. při léčbě antibiotiky, infekcích trávicího traktu, při stresu a stárnutí. Výsledkem pravidelné konzumace kysaných mléčných výrobků pak bývá náprava symptomů, jako je průjem a zácpa. Za tzv. terapeutické minimum je spotřebitelům doporučována denní konzumace alespoň 100 g mléčného výrobku s minimálním obsahem 10 6 probiotických bakterií v 1 g nebo 1 ml potraviny. Pro jednotlivé skupiny kysaných mléčných výrobků je množství bakterií použité mikrobiální kultury stanoveno vyhláškou ministerstva zemědělství č. 77/2003 Sb. V průběhu užívání probiotik formou kysaných mléčných výrobků nebo prostřednictvím farmaceutických preparátů jsou tyto kmeny prokazovány ve stolici, ale již několik dní po přerušení jejich přísunu zmizí. V současné době se hledají cesty, jak udržet příznivě působící bakterie v trávicím traktu s trvalejším efektem. 10
2 CÍL PRÁCE Cílem teoretické části bylo prostudovat dostupnou literaturu o fermentovaných mléčných výrobcích s použitím jogurtové kultury, o ovlivňování střevní mikroflóry, o problematice probiotik a prebiotik a možnostech obohacování potravin těmito prospěšnými bakteriemi. Také prostudovat metodiku stanovení bakterií rodu Lactobacillus, Bifidobacterium a Enterococcus ve vzorku stolice. Cílem experimentální části bylo sestavit pokusnou skupinu osob pro ověření vlivu konzumace fermentovaných mléčných výrobků na modulaci střevní mikroflóry. Součástí bylo zabezpečení odběru vzorků a předání do mikrobiologické laboratoře, kde probíhaly mikrobiologické analýzy vzorků stolice dle zvolené metodiky. Získané výsledky poté statisticky zpracovat a uspořádat do přehledných tabulek a grafů. 11
3 LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Fermentované (kysané) mléčné výrobky Fermentované mléčné výrobky mají svůj původ v mnohých lidových mléčných nápojích, rozšířených po celém světě (GAJDŮŠEK, 2000). Současný způsob výroby je odvozen od historických druhů kysaných mléčných výrobků. K výrobě se používá zákysů z izolovaných čistých mlékařských kultur. Základní kultury bakterií obsahují buďto mezofilní nebo termofilní bakterie mléčného kysání (homofermentativní nebo heterofermentativní), nebo kvasinky. Díky kvasinkám probíhá kromě mléčného kysání i alkoholové kvašení (SIMEONOVOVÁ, 2003). Podle vyhlášky se kysaným mléčným výrobkem rozumí mléčný výrobek získaný kysáním mléka, smetany, podmáslí nebo jejich směsi za použití mikroorganismů, tepelně neošetřený po kysacím procesu. Jogurtem se rozumí kysaný mléčný výrobek získaný kysáním mléka, smetany, podmáslí nebo jejich směsi pomocí mikroorganismů. Druhy mikroorganismů jsou uvedeny v příloze č. 2, tabulce 4 dané vyhlášky (VYHLÁŠKA 77/2003). Tržní sortiment je velmi pestrý a neustále se rozšiřuje. Pro rozmanitost složení se mnoho mléčných výrobků uplatňuje v dietách a při léčebné výživě. Příznivé chuťové vlastnosti a vhodná konzistence umožňují nejrůznější kombinace kysaných mlék s řadou zchutňujících, želírovacích, ovocných, minerálních, vitaminových, vlákninových a jiných doplňků. Různé kombinace jsou základem sortimentní pestrosti (LUKÁŠOVÁ, 2001). 3.1.1 Biologická hodnota a dietetický význam Fermentované mléčné výrobky jsou prakticky vhodné pro všechny populační skupiny. Jsou organolepticky vyhovující a relativně snadno stravitelné (LUKÁŠOVÁ, 2001). Nedílnou součástí mléčných výrobků jsou bakterie mléčného kvašení, které prokysávají mléko. V procesu kysání dochází k přeměně laktózy převážně na kyselinu mléčnou. Zakysané mléčné výrobky jsou přirozeně biologicky konzervovanými výrobky, vlivem nízkého ph vytvářeného mléčnými mikroorganismy. Tyto organismy také zvyšují stravitelnost mléka. Kysané mléčné výrobky jsou často tolerované osobami trpícími intolerancí laktózy (BABIČKA, 2009). 12
Díky nízkému ph ve střevě dochází ke zvýšenému zadržování vápníku, fosforu a železa. Bakterie mléčného kysání jsou schopné produkovat vitamin B 12, B 1, B 2, B 6, kyselinu listovou a pantotenovou, niacin a další (GAJDŮŠEK, 2000). V posledních desetiletích se dostává do popředí výroba probiotických kysaných mléčných výrobků obsahujících kromě běžných mléčných kultur i kultury s dietetickoléčebnými účinky. Jejich pravidelná konzumace působí pozitivně na trávicí pochody i na celkový zdravotní stav konzumenta. Probiotické účinky byly prokázány zejména u mikroorganismů: Bifidobacterium bifidum, Lactobacillus acidophilus a Streptococcus thermophilus. Tyto bakterie bývají obvykle používány v kombinaci s běžnými jogurtovými kulturami (SIMEONOVOVÁ, 2003). 3.1.2 Dělení kysaných mléčných výrobků Kysané mléčné výrobky se dělí na druhy, skupiny a podskupiny (LUKÁŠOVÁ, 2001). Tab. 1 - Dělení kysaných mléčných výrobků (LUKÁŠOVÁ, 2001) Druh Skupina Podskupina Fermentovaný mléčný výrobek Jogurt Jogurtové mléko Acidofilní mléko Kefír Kefírové mléko Kysané mléko nebo smetanový zákys Kysaná nebo zakysaná smetana Kysané podmáslí Kysaný mléčný výrobek s bifidokulturou Nízkotučný nebo odtučněný, se sníženým obsahem tuku, smetanový 3.1.3 Dělení podle použitých mikroorganismů Podle typu použitých bakterií mléčného kysání lze výrobky rozdělit do základních skupin: jogurtové výrobky, acidofilní výrobky, bifidogenní výrobky, smetanové výrobky a kefírové výrobky (BABIČKA, 2009). 13
Tab. 2 - Druhy mikroorganismů v kysaných mléčných výrobcích (Vyhláška 77/2003) Druh výrobku Použité mikroorganismy Mléčná mikroflóra výrobku v 1g Acidofilní mléko Lactobacillus acidophilus a další mezofilní, příp. 10 6 Lactobacillus termofilní kultury BMK acidophilus Jogurty Protosymbiotická směs Streptococcus salivarius ssp. thermophilus a Lactobacillus delbrueckii ssp. 10 7 bulgaricus Kysané mléko vč. smetanového Monokultury nebo směsné kultury bakterií zákysu, podmáslí mléčného kysání 10 6 a kysané smetany Zákys připravený z kefírových zrn, jehož Kefír mikroflóra se skládá z kvasinek zkvašujících Bakterie mléčného laktózu Sacharomyces unisporus, Sacharomyces kysání 10 6 a cerevisiae, Sacharomyces exignus a dále kvasinky 10 4 Leuconostoc, Lactococcus a Aerobacter, rostoucí ve vzájemném společenství Kefírové mléko Zákys skládající se z kvasinkových kultur rodu Bakterie mléčného Kluyveromyces, Torulopsis nebo Candida valida a kysání 10 6 a mezofilních a termofilních kultur bakterií mléčného kvasinky 10 2 kysání v symbióze Kysaný mléčný Bifidobacterium ssp. v kombinaci s mezofilními a výrobek s termofilními bakteriemi mléčného kysání bifidokulturou Bifidobakterie 10 6 3.1.4 Základní tržní skupiny Podle tržní skupiny dělíme kysané mléčné výrobky na jogurty a kysaná mléka. Mezi jogurty patří jogurty pevné, z tradiční výroby, se zráním ve spotřebitelském obalu a jogurty šlehané z kontinuální výroby se zráním v tancích. Do skupiny kysaných mlék patří kysané mléko, kysaná smetana, kysané podmáslí, smetanový zákys, acidofilní mléko, kefír a kumys (LUKÁŠOVÁ, 2001). 14
3.1.4.1 Jogurty Jogurty patří k nejrozšířenějším mléčným výrobkům v produkci kysaných mléčných produktů. Tato skupina je charakterizována obsahem termofilních bakterií mléčného kysání a bakterií aromatizujících. Pro rozšíření sortimentu se používá přídavek dalších mikrobiálních kultur a dochází tak k ovlivnění senzorických vlastností (LUKÁŠOVÁ, 2001). Jogurty u nás jsou vyráběny převážně pomocí základní jogurtové kultury (Streptococcus thermophilus, Lactobacillus bulgaricus). Liší se od sebe zpravidla tučností, délkou zrání a ochucením (BABIČKA, 2009). Z původních klasických jogurtů se vyvinula široká paleta výrobků o různé konzistenci tekuté ve formě nápojů, krémovité nebo s pevným koagulátem. Rozlišují se bílé a ochucené jogurty. Jogurty s příchutí mohou obsahovat různé nemléčné složky jako ochucující složky, barviva a stabilizátory. Vyrábějí se i jogurty fortifikované různými vitaminy, minerálními látkami, aminokyselinami apod. (SIMEONOVOVÁ, 2003). Zvláštní skupinou jogurtů jsou výrobky obohacené probiotickou kulturou. Nejčastěji se jedná o bakterie rodu Bifidobacterium a Lactobacillus acidophilus. Mezi další používané bakterie patří druh Streptococcus thermophilus, Lactobacillus casei a jeho další druhy pokud vykazují probiotické účinky (ŠUSTOVÁ, 2008). Přiměřený počet probiotik tzv. terapeutické minimum, musí být konzumováno pravidelně, aby se mohl projevit efekt změny mikroflóry na zdravotní stav konzumenta. Spotřeba by měla být více než 100 g výrobku za den, obsahující min. 10 6 životaschopných jedinců v 1 gramu potraviny. Přežití těchto bakterií až do konce doby použitelnosti je důležitý faktor (LOURENS-HATTINGH a VILJOEN, 2001). Jogurt patří mezi nejrozšířenější funkční potraviny na světě. Funkční potraviny jsou takové potraviny, které mají kromě výživové hodnoty příznivý účinek na zdraví konzumenta. Obsahují složky, které mají v lidském organismu specifickou fyziologickou a pro zdraví prospěšnou funkci. Nejsou zaměřeny na léčbu konkrétní nemoci, ale působí na organismus preventivně, proto vytvářejí předpoklady pro fyzickou i duševní pohodu a udržení zdraví. Podle výživových doporučení by se jogurty měly konzumovat jako součást denní stravy. Obecně lze říci, že jogurt působí blahodárně na střevní mikroflóru člověka a je spolu s acidofilním mlékem nejvýznamnější probiotickou potravinou (ŠUSTOVÁ, 2008). 15
3.1.4.2 Další kysané mléčné výrobky Acidofilní mléko Pro výrobu acidofilního mléka se používá acidofilní kultura Lactobacillus acidophilus. U nás se při výrobě používá kombinace acidofilní kultury se smetanovou kulturou, aby konečný produkt nebyl příliš kyselý (ŠUSTOVÁ, 2008). Kefírové mléko, Kefír Kefír se vyrábí působením kefírové kultury. Zákys je připravený z kefírových zrn, jehož mikroflóra se skládá z kvasinek a kultur bakterií mléčného kvašení (BABIČKA, 2009). Ve výrobcích se smíšenou kulturou mléčných bakterií a kvasinek dochází k rozkladu laktózy mléčným kvašením, za vzniku kyseliny mléčné a současně i alkoholovým kvašením, kdy vzniká ethanol a oxid uhličitý, který dodává těmto výrobkům specifickou štiplavou chuť (SIMEONOVOVÁ, 2003). Kysané mléko, Smetanový zákys, Kysané podmáslí Základem pro výrobu je smetanová kultura. (BABIČKA, 2009). Tato kultura zahrnuje bakterie rodu Lactococcus a Leuconostoc, které se podle požadovaného typu fermentace používají v různých kombinacích (SIMEONOVOVÁ, 2003). 3.1.5 Hlavní stupně výroby fermentovaných mléčných výrobků Podstatou výroby kysaných mléčných výrobků je činnost mikroorganismů, tzv. čistých mlékařských kultur. Díky přítomnosti mikroorganismů dochází k rozkladu laktózy, mléčné bílkoviny, výjimečně i tuku. Vznikají nové látky charakteristické pro daný výrobek (ŠUSTOVÁ, 2008). Zásadně mají kysané mléčné výrobky obsahovat pouze mléčné bakterie řádově v koncentracích 10 6 až 10 8 v 1 ml. Pro splnění tohoto požadavku je třeba dbát vysokých nároků na suroviny, pasteraci mléka, sanitaci výrobního zařízení, použití aktivních kysacích kultur a dodržení výrobních postupů za vysokých hygienických podmínek (LUKÁŠOVÁ, 2001). 16
3.1.5.1 Požadavky na mléko Na jakost mléka pro výrobu kysaných mléčných výrobků jsou kladeny vysoké nároky. Mléko musí svými vlastnostmi a složením vytvářet vhodné podmínky pro rozvoj a aktivitu přidaných čistých mlékařských kultur. Mléko proto nesmí obsahovat žádné inhibiční látky, musí být hygienicky získáno od zdravých a dobře krmených dojnic a musí mít normální složení a vlastnosti. Mléko by mělo obsahovat co nejnižší počty mikroorganismů, jelikož působením kontaminující mikroflóry jsou rozkládány některé složky potřebné pro čisté mlékařské kultury. Kromě toho vzniklé produkty metabolismu kontaminujících bakterií mohou ovlivňovat růst a aktivitu přidaných mlékařských kultur (SIMEONOVOVÁ, 2003). 3.1.5.2 Výroba Při vlastní výrobě se u mléka upraví tučnost podle toho, jaký má být výsledný produkt (ŠUSTOVÁ, 2008). Mléko se po úpravě tučnosti homogenizuje, aby se rovnoměrně rozptýlily částice tuku. Dále se tato surovina pasteruje. Cílem tepelného ošetření je zničit nežádoucí mikroflóru a upravit mléko tak, aby byly vytvořeny vhodné podmínky pro růst přidaných čistých kultur a výsledný výrobek měl odpovídající vlastnosti. Zahřívá se na 85 C až 95 C po dobu 5 minut. Po pasteraci se provádí rychlé ochlazení na teplotu fermentace (SIMEONOVOVÁ, 2003). Je možné použít UHT záhřev, kdy je konzistence jogurtů pevnější a nedochází k uvolňování syrovátky po fermentaci (ŠUSTOVÁ, 2008). 3.1.5.3 Fermentace a plnění Po pasteraci a ochlazení na fermentační teplotu se mléko zaočkuje mlékárenskými kulturami (ŠUSTOVÁ, 2008). Proces zrání se na výrobcích projevuje změnami chuti, vůně, vzhledu i konzistence. V závislosti na vyráběném druhu výrobku jsou kladeny odlišné nároky na rychlost a stupeň degradace základních substrátů (GAJDŮŠEK, 2000). Zaočkované mléko je buďto plněno přímo do spotřebitelských obalů, kde probíhá fermentace nebo se mléko napustí do tzv. fermentačních tanků, kde se upraví teploty na předepsané hodnoty. Po prokysání a případném promíchání s přidávanými komponenty je výrobek chlazen a plněn do spotřebitelského balení (SIMEONOVOVÁ, 2003). 17
3.1.5.4 Ochucování jogurtů Ochucující složky se přidávají do mléka nebo až do prokysaného produktu. Mezi tyto látky patří např. sacharóza, dextróza, laktóza, aromatické látky a barviva, ovocné přísady, ovocné dřeně, zelenina, džemy, sirupy, ovesné vločky, rozinky, datle, čokoláda apod. Pro zlepšení konzistence se někdy přidávají látky vážící vodu nebo vytvářející síťovitou strukturu, např. škroby, želatina a další (SIMEONOVOVÁ, 2003). 3.1.5.1 Přidávání probiotických MO Probiotické bakterie se v mléku rozmnožují velmi pomalu. V konečném produktu se na konci doby skladování mají vyskytovat v koncentraci vyšší než 10 6 KTJ/ml výrobku. Většinou se do výrobku, který byl okyselený pravými bakteriemi mléčného kvašení, přidávají před jeho zráním nebo během něj, v takovém množství, aby i bez pomnožení byla na konci skladování požadovaná koncentrace (GÖRNER a VALÍK, 2004). Obr. 1 - Technologické zpracování mléka na kysané mléčné výrobky (LUKÁŠOVÁ, 2001) 18
3.1.5.2 Změny složek mléka při fermentaci výrobků Laktóza podléhá během fermentace výrobku enzymové hydrolýze. Mění se na glukózu a galaktózu. Tyto monosacharidy jsou dále fermentovány na optické isomery kyseliny mléčné. Kromě tohoto homofermentativního procesu může probíhat heterofermentativní proces, kdy vznikají těkavé mastné kyseliny, např. mravenčí, octová, propionová, dále vznikají karbonylové sloučeniny (acetaldehyd a diacetyl) a v neposlední řadě vzniká ethanol a oxid uhličitý (LUKÁŠOVÁ, 2001). Bílkoviny ve fermentovaných mléčných výrobcích podléhají proteolýze, díky proteolytickým enzymům bakterií mléčného kysání. Koagulované a proteolyzované mléčné bílkoviny jsou lépe stravitelné. Tyto enzymy v průběhu fermentace mléka štěpí pouze kolem 2 % kaseinu (GAJDŮŠEK, 2000). Z kaseinu během fermentace proteolyticky aktivní laktobacily uvolňují peptidy a aminokyseliny, které jsou využívány jako zdroj dusíku. Kvalita procesu je závislá na druhu kultur, podmínkách vedení fermentací, na době působení teplot a dosažených hodnotách ph (LUKÁŠOVÁ, 2001). Mléčný tuk ve formě mastných kyselin se při porovnání čerstvého mléka a kysaných produktů výrazně neliší (LUKÁŠOVÁ, 2001). Lipolýzou uvolněné mastné kyseliny příznivě ovlivňují stravitelnost tuků (GAJDŮŠEK, 2000). Vitaminy: Bakterie mléčného kvašení často vyžadují pro svůj růst a pro produkci dalších vitaminů některé vitaminy skupiny B. Vlastnosti použitých kultur určují, do jaké míry se bude lišit koncentrace v kysaném výrobku od koncentrace v mléku. Obsah v kysaném výrobku je také určen skladovacími podmínkami a úpravou mléka před fermentací. Tepelné ošetřené mléka snižuje obsah vitaminů B 1, B 2, C a kyseliny listové (WALSTRA, 1999). Obsah minerálních látek se během fermentace nemění (LUKÁŠOVÁ, 2001). 3.2 Bakterie mléčného kysání Bakterie mléčného kysání jsou velmi heterogenní skupinou mikroorganismů, přesto jsou klasifikovány společně podle tvorby stejného produktu metabolismu kyseliny mléčné (GAJDŮŠEK, 2000). Mezi bakterie mléčného kysání patří skupina kokovitých i tyčinkovitých bakterií, které zahrnují některé druhy rodů: Lactococcus, Streptococcus, Enterococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus a Bifidobacterium. S výjimkou bakterií rodu 19
Bifidobacterium jsou všechny rody fylogeneticky příbuzné. Význam bifidobakterií v potravinářství spočívá v tom, že se sekundárně přidávají do speciálních fermentovaných výrobků určených pro preventivní léčebná opatření (GÖRNER a VALÍK, 2004). 3.2.1 Vlastnosti a využití bakterií mléčného kysání Bakterie mléčného kysání jsou grampozitivní, anaerobní, mikroaerofilní až fakultativně anaerobní. Morfologicky jsou to koky, ovoidy nebo tyčinky. Výjimkou jsou bifidobakterie, které mají tvar písmene Y. K dalším vlastnostem patří tolerance ke kyselosti mléka kolem ph 4 po několik týdnů (GAJDŮŠEK, 2000). Technologicky a senzoricky významné funkce jsou především v produkci kyseliny mléčné, vzniku senzoricky významných složek (diacetyl, acetaldehyd, volné těkavé mastné kyseliny apod.), rozkladu bílkovin, popř. tuků a potlačování patogenních a technologicky nežádaných mikroorganismů (GAJDŮŠEK, 2000). Protože kyselina mléčná potlačuje rozmnožování hnilobných bakterií, je tato skupina bakterií často využívána pro výrobu potravin a krmiv. Samovolné mléčné kvašení se uplatňuje v mlékárenství při výrobě kysaných mléčných výrobků (ŠILHÁNKOVÁ, 2008). Tyto bakterie se vyskytují nejen v mléku a mléčných výrobcích. Nachází se i ve střevech lidí a zvířat a na jejich sliznicích, na rostlinách a v půdě (GÖRNER a VALÍK, 2004). 3.2.2 Dělení bakterií mléčného kysání Rozdělení je možné do dvou všeobecných kategorií a to podle metabolismu a podle optimální teploty růstu (GAJDŮŠEK, 2000). Podle produktů katabolického metabolismu rozdělujeme bakterie mléčného kysání do dvou skupin. První jsou homofermentativní mléčné bakterie, které při kysání sacharidů produkují téměř jen kyselinu mléčnou (např. Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus plantarum, rod Streptococcus, Enterococcus, Pediococcus a Lactococcus). Druhou skupinou jsou bakterie heterofermentativní, které produkují kromě kyseliny mléčné také značné množství ethanolu a oxidu uhličitého (např. Lactobacillus fermentum, rod Leuconostoc) (ŠILHÁNKOVÁ, 2008). Podle optimální teploty růstu dělíme bakterie na mezofilní a termofilní (GAJDŮŠEK, 2000). Mezofilní mikroorganismy mají minimální teplotu vyšší než 5 C a optimální teplotu nižší než 45 C, nejčastěji je to okolo 37 C. Tato skupina 20
představuje většinu všech mikroorganismů. Termofilní mikroorganismy mají optimální teplotu růstu kolem 45 C nebo vyšší. Většinou je optimum růstu mezi 50 C a 60 C. Některé organismy mohou růst výjimečně i při 80 C a některé extrémní termofily až při teplotách nad 100 C. Mezi zástupce této skupiny patří bakterie rodu Lactobacillus (Lactobacillus delbrueckii ssp. delbrueckii, L. delbrueckii ssp. bulgaricus) (ŠILHÁNKOVÁ, 2008). 3.2.3 Vybrané rody bakterií mléčného kysání 3.2.3.1 Lactobacillus Bakterie rodu Lactobacillus jsou nesporulující, mikroaerofilní, grampozitivní tyčinky, tvořící často řetízky. Podle produktů katabolického metabolismu dělíme rod do dvou skupin a to homofermentativních (L. delbrueckii, L. acidophilus, L. plantarum) a do skupiny heterofermentativních mléčných bakterií (L. fermentum, L. brevis, L. buchneri). Optimální ph pro růst je 5,4 až 6,4. Laktobacily patří mezi bakteriemi mléčného kvašení k náročným na potřebu vitaminů pro svůj růst. Některé potřebují až 6 různých vitaminů (ŠILHÁNKOVÁ, 2008). V přírodě je tento rod velmi rozšířen. Některé druhy se vyskytují v mléce, kde vyvolávají mléčné kysání, dále se vyskytuje v ústech člověka, v gastrointestinálním traktu savců, na rostlinách a v půdě (VOTAVA et al., 2003). Díky tvorbě kyseliny mléčné, která snižuje ph a tím zastavuje množení hnilobných bakterií, jsou bakterie tohoto rodu využívány ke konzervaci potravin (zeleniny). V mlékárenství se používá např. druh L. delbrueckii ssp. bulgariccus k výrobě jogurtu nebo L. acidophilus k přípravě acidofilního mléka. V sýrařství se využívá L. casei, L. delbrueckii ssp. lactis, L. helveticus. Homofermentativní L. plantarum, který se často vyskytuje na rostlinách, bývá využíván při konzervaci zelí, okurek a pícnin. Je také součástí kefírových zrn spolu s heterofermentativními druhy L. brevis a L. fermentum se nachází v pekařském kvásku (ŠILHÁNKOVÁ, 2008). L. acidophilus se vyskytuje v trávicím traktu lidí a zvířat a příznivě ovlivňuje střevní mikroflóru. Některé kmeny se používají jako probiotika (SLÁDKOVÁ a BURDYCHOVÁ, 2007). Některé heterofermentativní laktobacily jsou nežádoucí původci kontaminací ve vinařství a pivovarství, kde způsobují chuťové vady produktů (ŠILHÁNKOVÁ, 2008). 21
3.2.3.1 Enterococcus Bakterie rodu Enterococcus jsou mikroaerofilní, grampozitivní koky tvořící řetízky. Řadí se do skupiny homofermentativních bakterií. Dříve byly vyjmuty z rodu Streptococcus (ŠILHÁNKOVÁ, 2008). Zástupci tohoto rodu se vyskytují běžně v trávicím traktu lidí a zvířat. Rozšířené jsou ve stájích a povrchových vodách. Jsou poměrně rezistentní, mohou přežít záhřev na 60 C po dobu 30 minut. Při posuzování výskytu enterokoků je nutno přihlížet na materiál, ve kterém jsou stanovovány. Výskyt enterokoků se používá jako indikátor fekálního znečištění pitné vody. Jejich přítomnost ve vodě však poukazuje na nedávné znečištění, protože ve vodě rychle umírají. Výskyt enterokoků v potravinách nelze dávat do přímě souvislosti s fekálním znečištěním, protože se nacházejí i nezávisle v životním prostředí. U některých potravin může poukazovat na nedostatečnou desinfekci pracovních ploch. Navíc některé enterokoky mají technologický význam. Enterococcus faecium je dokonce používán jako probiotikum (SLÁDKOVÁ a BURDYCHOVÁ, 2007). Z potravinářského hlediska je významná odolnost vůči zvýšeným koncentracím soli v potravinách a nízkým hodnotám aktivity vody. I když se technologicky nepoužívají, jsou stálou součástí mikroflóry sýrů, fermentovaných klobás, šunky a jiných i rostlinných potravin. E. faecium se vyskytuje v mléku a mléčných výrobcích (GÖRNER a VALÍK, 2004). 3.2.3.1 Bifidobacterium Rod Bifidobacterium zahrnuje grampozitivní, anaerobní, nesporulující tyčinky, které někdy bývají na jednom z konců rozštěpené (VOTAVA et al., 2003). Charakteristické je heterofermentativní zkvašování sacharidů, kdy je hlavním produktem fermentace kyselina mléčná a octová. Teplotní optimum se pohybuje mezi 37 C až 43 C. Optimální ph živných médií je 6,5 až 7,0. Pomalý růst se může objevit ještě při hodnotách ph 4,5 až 5,0 (MAXA a RADA, 1996). Bifidobakterie patří k běžné flóře dutiny ústní a zažívacího traktu. Jako prokazatelně patogenní pro člověka byl zatím usvědčen pouze druh Bifidobacterium dentium, který se podílí na vzniku zubního kazu (VOTAVA et al., 2003). Ve velkém množství se bifidobakterie nachází ve stolici kojenců krmených mateřským mlékem (SLÁDKOVÁ a BURDYCHOVÁ, 2007). Jejich růst podporují tzv. bifidogenní faktory: laktulóza, oligosacharidy a další (GÖRNER a VALÍK, 2004). 22
Zdraví dospělí lidé mají v zažívacím traktu asi 25 % bakterií rodu Bifidobacterium z celkového počtu bakterií. U starých lidí se tento počet snižuje na 10 % a u nemocných mohou dokonce úplně vymizet. U kojenců tvoří až 90 % celkového počtu střevních bakterií, převážně jsou to Bifidobacterium infantis, B. breve, B. longum. U dospělých lidí převládají B. adolescentis a B. longum (MAXA a RADA, 1996). 3.2.3.2 Lactococcus Jedná se o grampozitivní, mikroaerofilní až anaerobní koky, tvořící řetízky. Optimální růstová teplota je okolo 30 C. Řadí se do skupiny homofermentativních bakterií. Lactococcus thermophilus má optimální teplotu 40 až 45 C a je součástí zákysů pro výrobu jogurtů. Některé kmeny Lactococcus lactis produkují antibiotikum nisin, které inhibuje rozvoj řady grampozitivních bakterií. Toto antibiotikum se používá jako pomocná látka při konzervaci potravin (ŠILHÁNKOVÁ, 2008). Do rodu Lactococcus patří druhy: Lactococcus lactis ssp. lactis, Lactococcus lactis ssp. cremoris, Lactococcus lactis ssp. hordniae, Lactococcus raffinolactis a Lactocossus plantarum (GÖRNER a VALÍK, 2004). 3.2.3.3 Streptococcus Bakterie rodu Streptococcus jsou grampozitivní, většinou fakultativně anaerobní, nepohyblivé, nesporulující koky. Uspořádání je většinou do řetízků. Podle metabolismu je řadíme do skupiny homofermentativních. Jejich optimální teplota je okolo 37 C. Některé bakterie tohoto rodu jsou termofilní, a proto mají významné využití v potravinářském průmyslu a to např. Streptococcus salivarius ssp. thermophilus. Celá řada druhů je patogenní, způsobují hnisavá onemocnění. Z toho rodu byly vyčleněny nehemolyzující druhy a byly zařazeny do nově vytvořeného rodu Lactococcus (ŠILHÁNKOVÁ, 2008). 3.2.3.1 Pediococcus Bakterie rodu Pediococcus jsou grampozitivní, anaerobní koky. Tvoří kyselinu mléčnou jako téměř jediný produkt metabolismu sacharidů, proto jej řadíme mezi homofermentativní bakterie mléčného kvašení. Tvoří značné množství biacetylu. 23
Vyskytují se v kysaném zelí a jiných kvasících materiálech a využívá se k výrobě masných výrobků (ŠILHÁNKOVÁ, 2008). 3.2.3.2 Leuconostoc Bakterie tohoto rodu patří do čeledi Streptococcaceae. Jsou to grampozitivní, nepohyblivé a nesporotvorné koky. Podle nároku na kyslík se řadí mezi fakultativně anaerobní (GÖRNER a VALÍK, 2004). Zkvašují sacharidy na kyselinu mléčnou, ethanol a oxid uhličitý, proto patří mezi heterofermentativní bakterie (ŠILHÁNKOVÁ, 2008). Růst je pomalý, např, Leuconostoc mesenteroides ssp. cremoris vyžaduje při teplotách 22 až 30 C až 48 hod. Důležitou vlastností Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides a ssp. dextranicum je tvorba dextranového slizu, který se produkuje ze sacharózy, čímž vzniká typická táhlovitá konzistence koagulátu (GÖRNER a VALÍK, 2004). 3.3 Čisté mlékárenské kultury V současné době se mikrobiální (mlékárenské) kultury vyrábí ve specializovaných závodech. Výroba zaručuje standardní kvalitu. Pod pojmem mikrobiální kultura se rozumí definované a rozmnožování schopné mikroorganismy. Do surovin se přidávají za účelem vyrobit určitou potravinu nebo zlepšit její senzorické vlastnosti, trvanlivost a konzumovatelnost (GÖRNER a VALÍK, 2004). V mléčném průmyslu se k výrobě používají mezofilní a termofilní kultury bakterií mléčného kysání a kvasinky. Podle obsažených mikrobiálních druhů se čisté mlékařské kultury člení na kultury bakteriální, kvasinkové, plísňové, popř. smíšené (GAJDŮŠEK, 2000). 3.3.1 Jogurtová kultura Jogurty, jogurtová mléka a od nich odvozené výrobky se připravují pomocí kmenových druhů Streptococcus salivarius ssp. thermophilus a Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus. Tyto mikroby žijí v symbióze a spolu se vyznačují rychlou tvorbou kyseliny mléčné. S. thermophilus produkuje kyselinu mravenčí a tím stimuluje růst a metabolismus laktobacilů. Naopak L. bulgaricus stimuluje růst streptokoků tím, že hydrolyzuje bílkoviny a podporuje ho uvolňováním aminokyselin. Optimální teplotou pro působení je 40 až 43 C (GÖRNER a VALÍK, 2004). 24
3.4 Trávení Organismus člověka získává potřebné základní živiny, minerální látky a vitaminy potravou. Příjem látek, jejich mechanické a chemické zpracování, vstřebávání látek a vylučování látek tělu nepotřebných zajišťuje trávicí systém. Trávicí systém tvoří několik oddílů: dutina ústní, hltan, jícen, žaludek, tenké a tlusté střevo. Na chemickém zpracování potravy se podílejí velké žlázy, jejíž vývody do trubice ústí a drobné žlázky umístěné ve sliznici trávicí trubice (ROKYTA et al., 2003). Mezi mechanické trávení zařazujeme žvýkáni, polykaní a pohyby žaludku a střev (BURDYCHOVÁ, 2009). V dutině ústní je potrava rozžvýkána a promíchána se slinami. Sousto se přes hltan a jícen dostane do žaludku. V žaludku se potrava mění na tráveninu, která je zde zadržována po dobu 2 až 6 hodin, to záleží na převažující složce potravy. Z žaludku přechází trávenina do první části tenkého střeva (KOMPRDA, 2009). Tenké střevo je nejdelší oddíl trávicí trubice. V živém těle je dlouhé 3 až 5 metrů. Dělí se na tři úseky: dvanáctník (duodenum), lačník (jejunum), kyčelník (ileum) (ROKYTA et al., 2003). Do dvanáctníku ústí vývod ze slinivky břišní a žlučovody. Pomocí enzymů slinivky břišní a enzymů střevní šťávy se zde rozkládají živiny na jednodušší složky, které se již mohou vstřebat do krevního oběhu. Tenké střevo je důležitým orgánem pro vstřebávání živin z potravy, proto je k tomu velmi dobře uzpůsobené (KOMPRDA, 2009). Sliznice vyvstává v příčné řasy a dále vybíhá v klky, tímto způsobem je několikanásobně zvětšena celková vnitřní plocha střeva (ROKYTA et al., 2003). Zhruba za 4 až 8 hodin po příjmu potravy se zbytky dostávají do tlustého střeva, odkud se zcela odstraňují až za 72 hodin (KOMPRDA, 2009). Tlusté střevo je konečný 1,5 m dlouhý úsek trávicí trubice. Rozděluje se na několik částí: slepé střevo s červovitým výběžkem, tračník (vzestupný, příčný a sestupný) a konečník. Fyziologicky přítomné jsou střevní bakterie (ROKYTA et al., 2003). Působením bakterií dochází v tlustém střevě k anaerobní fermentaci, kdy jsou polysacharidy metabolizovány na kyselinu mléčnou, alkohol, těkavé mastné kyseliny, oxid uhličitý a metan. Denně je fermentováno asi 20 g sacharidů. Zvláštní skupinou jsou bakterie hnilobné, které rozkládají aminokyseliny na amoniak, sirovodík, fenol, indol a skatol. Z hlediska zdravotního je žádoucí co možná největší potlačení hnilobných procesů osídlením střeva laktátovými bakteriemi (KOMPRDA, 2007). 25
3.5 Střevní mikroflóra člověka Dobrý zdravotní stav člověka se odráží ve zdraví jeho gastrointestinálního traktu, který je nejvýznamnějším imunitním orgánem v těle. Obsahuje tisíce druhů bakterií, z nichž zde některé žijí trvale, jiné přicházejí s potravou. Při porušení rovnováhy střevní mikroflóry se projeví zdravotní problémy (SLÁDKOVÁ a HLAVÁČOVÁ, 2011). Skutečný počet bakterií ve střevě je asi 10krát vyšší než počet všech buněk v lidském těle. Při narození je střevní trakt téměř sterilní. Po vývoji a ustálení složení mikroflóry v dospělosti, je složení mikrobiálního osídlení téměř konstantní a každý jedinec má složení tak specifické, že by se tento ukazatel mohl používat jako alternativa k otiskům prstů. Při porušení složení má mikroflóra pozoruhodnou schopnost vrátit se časem do stejného stavu jako před tím (QUIGLEY, 2010). Střevní mikroflóra plní velké množství důležitých funkcí pro svého hostitele. Střevní bakterie zvyšují energetický příjem rozkladem nestravitelných polysacharidů přijatých stravou na vstřebatelné monosacharidy. Také zkvašují složené sacharidy, kdy vznikají těkavé mastné kyseliny, které jsou následně zpracovány hostitelem. Tyto mastné kyseliny (acetát, butyrát, propionát) podněcují růst a vyzrávání střevních buněk a přes jejich protizánětlivé vlastnosti modulují imunitní odpověď. Kolonizace komenzálními bakteriemi brání invazi patogenů, tím že s nimi soutěží o stejné živiny. Také zabírají výklenky ve střevní sliznici. Mikrobiální osídlení střevního traktu má rovněž vliv na vývoj a morfologii střeva, přispívá k vývoji cév a k opevnění epiteliální bariéry střev. Střevní mikroflóra hraje klíčovou roli při formování lokální a systémové modulace imunitního systému hostitele (RAUCH a LYNCH, 2011). Obecně lze střevní bakterie rozdělit na druhy, které jsou potenciálně škodlivé, patogenní nebo užitečné pro svého hostitele. U zdravých jedinců se mezi těmito druhy bakterií nachází přírodní rovnováha. Prospěšné bakterie, mezi které patří vybrané druhy rodů Lactobacillus, Bifidobacterium, Streptococcus a některé druhy rodu Enterococcus a Bacteroides, hrají důležitou roli v otázkách výživy a prevenci chorob. Jejich pozitivní účinky plynou z výroby základních živin, jako jsou vitaminy a organické kyseliny. Působí jako prevence infekcí žaludku a stimulují imunitní reakce. Kromě ochranné funkce je významné detoxikační působení a vázání karcinogenů. Mezi nežádoucí nebo potenciálně patogenní střevní bakterie řadíme druhy rodů Clostridium, Staphylococcus, Proteus, někdy Enterococcus, Escherichia a Bacteroides. 26
Produkují látky, které mohou být potenciálně patogenní pro člověka (GOPAL et al., 2003). Bakterie rodu Bifidobacterium a Lactobacillus jsou členy běžné střevní mikroflóry člověka. Jsou považovány za prospěšné pro hostitele tím, že inhibují růst a adhezi patogenních druhů bakterií na povrch střevních buněk v gastrointestinálním traktu a zvyšují imunitu hostitele. Proto je mnohdy snaha o zvýšení počtu bifidobakterií a laktobacilů podáním některých jejich kmenů nebo oligosacharidů a polysacharidů, které stimulují jejich růst (SATOKARI et al. 2003). Další prospěšnou funkcí je metabolická aktivita, jejímž příkladem je výroba mastných kyselin a vitaminů, které podporují lepší trávení a vstřebávání živin a odstranění toxických a nežádoucích metabolitů (GOPAL et al., 2003). V tlustém střevě se běžná mikroflóra podílí na zachování hlavních metabolických a protiinfekčních mechanismů střevního traktu. Normální stav střevní mikroflóry člověka se nazývá normobióza (DORÉ a COTHIER, 2010). Porušení rovnováhy mikroorganizmů v trávicím traktu v důsledku selhání kontrolních mechanizmů je nazývána dysmikrobie. Při ní je zachována kvalitativní struktura, ale kvantitativně se vzájemný poměr mikroorganizmů změní. Tím dochází ke zvýšení počtu mikroorganizmů, které jsou v trávicím traktu běžně v menšině. Tyto mikroorganizmy vyvolávají superinfekci, na kterou může nasednout další infekční agens, jako jsou např. bakterie, viry a plísně (VOTAVA et al., 2003). V tlustém střevě je důležitý symbiotický vztah mezi střevní mikroflórou a hostitelem, který je vzájemně výhodný pro obě strany. Střevní mikroorganismy přispívají prevencí kolonizace patogeny, pomáhají trávit zbytky potravy, produkují živiny a rozvíjejí a udržují slizniční imunitu (OJETTI et al., 2009). Na druhou stranu, u některých druhů bakterií v tlustém střevě (např. Bacteroides) bylo prokázáno, že produkují metabolity, které jsou karcinogenní a mohou tak zvyšovat riziko výskytu rakoviny tlustého střeva. Změny v kolonizaci střevní mikroflóry zažívacího traktu, způsobené špatnou výživou nebo užíváním antibiotik, mohou vést k onemocnění gastrointestinálního traktu. (TODAR, 2009). 27
Obr. 2 - Schematické znázornění dospělé střevní mikroflóry (ROBERFROID, 2010) Popis obrázku: Bakterie jsou seřazeny podle četnosti osídlení lidského gastrointestinálního traktu. Nejpočetnější skupiny jsou umístěny dole, méně početné nahoře. Rody umístěné v tabulce na levé straně jsou potenciálně škodlivé, rody na pravé straně potenciálně prospěšné pro zdraví hostitele. Ty rody, které se nachází ve středu tabulky, jsou buďto potenciálně škodlivé nebo potenciálně prospěšné, ale obsahují i některé rody, které ještě nebyly klasifikovány nebo byly nedávno identifikovány a jejich prospěšnost nebyla ještě vědecky prověřena. 3.5.1 Osídlení střevního traktu Lidský trávicí trakt obsahuje 1,5 kg živých bakterií v rámci více než 500 identifikovaných druhů. Bakteriální biomasa tvoří přes 60 % hmoty stolice (KOMPRDA, 2010). Složení běžné mikroflóry mohou ovlivňovat různé faktory jako je genetika, pohlaví, stres, výživa a dietní zvyklosti jednotlivce (TODAR, 2009). Mezi další faktory ovlivňující počty a rozmanitost bakterií vyskytujících se v různých oblastech gastrointestinálního traktu patří ph střevního prostředí, peristaltika střev, dostupnost 28
živin, oxidačně-redukční potenciál ve tkáni, věk hostitele, hostitelovo zdraví, bakteriální adheze (přilnavost ke střevní stěně), bakteriální spolupráce, sekret mucinu obsahující imunoglobuliny, bakteriální antagonisté a čas průchodu tráveniny (ROBERFROID et al., 2010). Od kyčelníku tenkého střeva po tlusté střevo se bakteriální koncentrace postupně zvyšuje až na 10 12 KTJ/g obsahu. Mezi nejvýznamnější patří rody: Bacteroides, Eubacterium, Bifidobacterium, Peptostreptococcus, Fusobacterium, Ruminococcus, Clostridium, Streptococcus, Lactobacillus a Escherichia. (SAUNIER a DORÉ, 2002). Člověk je poprvé kolonizován bakteriální mikroflórou v okamžiku narození při průchodu porodními cestami. Plod je v děloze sterilní. Manipulace a krmení dítěte po porodu, vede k vytvoření stabilní flóry na kůži, v ústní dutině a střevním traktu do cca 48 hodin (TODAR, 2009). Bakteriální složení dětského zažívacího traktu závisí na režimu kojení. U kojených dětí obvykle dominují rody Bifidobacterium, které tvoří až 90 % celkového počtu střevních bakterií (SAUNIER a DORÉ, 2002). Rody Enterobacteriaceae a Enterococcus jsou většinou přítomny v malé míře a rody Bacteroides, Staphylococcus, Lactobacillus a Clostridium zde prakticky chybí (TODAR, 2009). Po dosažení 2 roku věku se složení mikroflóry stabilizuje a zůstává tak až do dosažení 16 let. Při dospívání se vyčerpávají živiny ve střevních výklencích a rozvíjí se tak více specifické druhy. Po dosažení dospělosti zůstává složení mikroflóry víceméně konstantní (SAUNIER a DORÉ, 2002). V horní části zažívacího traktu dospělého člověka, jícnu jsou obsaženy pouze bakterie polykané se slinami a potravinami (TODAR, 2009). V žaludku je kultivovaných velmi málo bakterií, díky vysoké kyselosti žaludeční šťávy. Nicméně, se zde může vyskytovat patogenní bakterie Helicobacter pylori, která bývá příčinou žaludečních vředů (TODAR, 2009). Přestože je u zdravých dospělých osob množství bakterií v žaludku nízké (přibližně 10 2 KTJ/ml obsahu), jsou stěny žaludku osídleny i jinými bakteriemi. U zdravého dospělého žaludku se mezi izolovanými organismy mohou vyskytovat bakterie rodu Lactobacillus, Enterococcus a Bacillus (ROBERFROID et al., 2010). V tenkém střevě převládají rody Lactobacillus, Escherichia, Streptococcus, Bifidobacterium, Fusobacterium (ŠVESTKA, 2008). V první části tenkého střeva je poměrně řídké osídlení grampozitivními bakteriemi, skládající se hlavně z rodů Lactobacillus a Enterococcus faecalis. Tato oblast obsahuje zhruba 10 5-10 7 KTJ/g. Od první části tenkého střeva ke konečné, se mikroflóra výrazně mění, obsah bakterií se 29
zvyšuje až na 10 8 KTJ/g (TODAR, 2009). Průchod potravy tenkým střevem je poměrně rychlý (2 až 4 hod). Celkový podíl na fermentaci je zde nízký, ve srovnání s tlustým střevem. Tenké střevo je také prostředí pro vznik mnoha bakteriálních infekcí. Mezi ně patří například infekce bakteriemi rodu Salmonella a některými bakteriemi Escherichia coli. Z tohoto důvodu je tenké střevo také cílem pro probiotika, kde soutěží o vazebná místa s patogeny (ROBERFROID et al., 2010). Mikrobiální osídlení tlustého střeva je kvalitativně podobné mikroflóře nalezené ve výkalech. Populace bakterií v tlustém střevě dosahuje hodnot 10 12 KTJ/g obsahu (TODAR, 2009). Kombinace prodloužení průchodu potravy tlustým střevem, neutrálnějšího ph a zvýšené dostupnosti živin (tj. nestrávených zbytků z potravy, které přichází z horní části GIT, odumřelých bakteriálních buněk, mikrobiálních buněčných úlomků a vedlejších produktů mikrobiálního metabolismu) zaručuje, že je tlusté střevo velmi příznivým prostředím k mikrobiální kolonizaci. Prostředí je anaerobní, proto zde převládají zejména anaerobní mikroorganismy (ROBERFROID et al., 2010). Koliformní bakterie se dostávají do popředí s bakteriemi rodu Enterococcus, Lactobacillus a Clostridium. Převažující druhy jsou anaerobní Bacteroides a anaerobních bakterie mléčného kvašení rodu Bifidobacterium (Bifidobacterium bifidum) (TODAR, 2009). 3.6 Probiotika, prebiotika, synbiotika Vzájemné působení mezi střevní mikroflórou a lidským tělem, má hluboký dopad na fyziologické funkce člověka. V neposlední řadě ovlivňuje funkci imunitního systému (RAUCH a LYNCH, 2011). Pro zlepšení lidského zdraví mohou být použity probiotické bakterie. Pokud jsou tyto bakterie obsaženy v potravinách, mohou poskytovat zvláštní zdravotní výhody pro jejich konzumenta (GUARNER a MALAGELADA, 2003). Prebiotika jsou nestravitelné části přijímané potravy, které slouží jako vhodný substrát pro růst nebo eventuálně pro metabolickou aktivitu pozitivně působících bakterií zažívacího traktu. Jejich příznivý vliv na zdraví hostitele je již několik let uznáván (NAGY et al., 2011). Označením synbiotika se rozumí výrobek s přídavkem probiotika a současně i prebiotika. Základní myšlenkou takto vyrobeného produktu je ta, že bakterie prospěšná lidskému zdraví má k dispozici vhodný substrát, který může v tlustém střevu 30
fermentovat, a tím se zvyšuje šance na prosazení v konkurenci s přirozenou mikroflórou (KALAČ, 2003). Probiotika, prebiotika a synbiotika zaměřené na zlepšení střevní mikroflóry mají velmi vysoké uplatnění v segmentu funkčních potravin na trhu (SAARELA et al., 2002). 3.6.1 Probiotika Probiotika jsou definována jako živé mikroorganismy, aplikovány v přiměřeném množství, které příznivě ovlivňují zdravotní stav hostitele tím, že upravují složení jeho střevní mikroflóry (NAGY et al., 2011). V tlustém střevě se zpomaluje průchod tráveniny a přítomné bakterie tak mají možnost štěpit složky potravy, které beze změny prošly předchozími oddíly trávicího traktu. Tyto složky slouží jako substrát a tedy i jako zdroj energie a živin pro přítomné bakterie. Mikroorganismy v tlustém střevě o tento substrát soutěží. Cílem přidaného probiotika je zvýšení množství a tím i konkurenceschopnosti zdraví prospěšných bakterií (KALAČ, 2003). Nejběžněji používané probiotické bakterie jsou z rodů Lactobacillus, Bifidobacterium, Streptococcus, Enterococcus a nepatogenní kvasinky Saccharomyces boulardii (NEVORAL, 2005). Většina druhů probiotických bakterií se přirozeně vyskytuje v zažívacím traktu člověka, jako součást běžné mikroflóry. Výhodnou vlastností některých kmenů je schopnost fermentace oligosacharidů, které nejsou stravitelné lidmi (O FLAHERTY a KLAENHAMMER, 2010). Probiotické mikroorganizmy nachází uplatnění ve výživě lidí i zvířat. Tyto kultury se běžně používají při výrobě kysaných mléčných výrobků (hlavně rody Bifidobacterium, Lactobacillus), sýrů (Bifidobacterium, Lactobacillus, propionové bakterie), fermentovaných masných výrobků (různé bakterie mléčného kysání), ale i do náplní sušenek a oplatků (Enterococcus faecium). Další možností je podávání probiotik lidem ve formě kapslí, lyofilizovaných nebo sušených prášků (RADA, 2010). 31
3.6.1.1 Kriteria pro zařazení mezi probiotické mikroorganismy Při výběru vhodných probiotických bakterií pro výrobu potravin, se musí přihlížet ke stanoveným kritériím. Jednotlivé bakteriální kmeny mohou být zařazeny mezi probiotika, pokud se prokáže, že mají prokazatelně pozitivní vliv na zdraví hostitele a nejsou toxické ani patogenní (NAGY et al., 2011). Kritéria pro výběr probiotických bakterií (NEVORAL, 2005), (KALAČ, 2003): Bezpečnostní hlediska: 1. Přesné taxonomické zařazení 2. Humánní původ mikroorganismů 3. Rezistence vůči žaludeční kyselině a žlučovým kyselinám 4. Schopnost přežívat, růst a zůstat metabolicky aktivní v trávicím ústrojí 5. Nesmí být toxické a patogenní 6. Genetická stabilita 7. Potenciální rezistence vůči antimikrobiálním látkám původní mikroflóry Technologické vlastnosti: 1. Růstová schopnost během kultivace, životaschopnost při aplikaci do potravin, transportu a skladování 2. Dobré organoleptické vlastnosti Funkční vlastnosti: 1. Adheze ke střevnímu epitelu a schopnost kolonizace střeva 2. Schopnost imunomodulace 3. Antagonistické působení na patogenní bakterie 4. Tvorba antimikrobiálních látek 5. Klinicky dokumentovatelná a měřitelná užitečnost pro zdraví hostitele 32