Mikroflóra vybraných kysaných mléčných výrobků

Transkript

1 Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav agrochemie, půdoznalství, mikrobiologie a výživy rostlin Mikroflóra vybraných kysaných mléčných výrobků Bakalářská práce Vedoucí práce: Ing. Libor Kalhotka, Ph.D. Lenka Režná Brno 2008

2 Prohlášení Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na téma,,mikroflóra vybraných kysaných mléčných výrobků vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Bakalářská práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího bakalářské práce a děkana AF MZLU v Brně. V Brně dne Lenka Režná

3 Poděkování Na tomto místě bych ráda poděkovala Ing. Liboru Kalhotkovi, Ph.D., vedoucímu mé bakalářské práce, za cenné rady a čas, který mi při zpracování práce věnoval.

4 Abstrakt Režná, L. Mikroflóra vybraných kysaných mléčných výrobků. Bakalářská práce. Brno, Bakalářská práce se zabývá mikroflórou kysaných mléčných výrobků. V teoretické části je uvedena spotřeba kysaných mléčných výrobků v České republice a Evropské unii a zájem spotřebitelské poptávky o tyto výrobky. Dále vysvětluje a popisuje mléčné kvašení, které probíhá při výrobě kysaných mléčných výrobků a zmiňuje význam kyseliny mléčné, která se tvoří při tomto procesu. Další část práce je věnována popisu a charakteristice jednotlivých rodů a druhů bakterií mléčného kvašení a jejich využití jako čistých mlékařských kultur používaných při výrobě kysaných mléčných výrobků. V teoretické části nejsou opomenuty ani patogenní mikroorganismy, které se mohou vyskytovat v mlékárenských výrobcích, včetně jejich možných negativních dopadů na konzumenta. Praktická část je věnována mikrobiologickým analýzám jogurtů značky Olma se zaměřením na stanovení významných skupin mikroorganismů. Klíčová slova: mléčné kvašení, mikroflóra, bakterie mléčného kvašení, mlékařské kultury Abstract Režná, L. Mikrobiota of chosen fermented milk products. Bachelor thesis. Brno, Bachelor thesis deals with mikrobiota of fermented milk products. In the teoretic part is mentioned consumption of fermented milk products and consumer demand for these products in Czech republic and in Europien Union. The teoretic part farther explains and describes milk fermentation which proceed within production of fermented milk products and mentions the role of lactic acid which is formed during this production. Next part is dedicated to description and characterization of each genera and specie of lactic acid bacterias and its usage as a pure dairy cultures used in fermented milk production. In the teoretic part aren t missed out pathogenic micro-organisms which can occur in dairy products and its possible negative incidence for consumer. The practic part is dedicated to microbiological analyses of yoghurts made by Olma and is aimed at assesment of important groups of micro-organisms. Key words: milk fermentation, mikrobiota, lactic acid bacteria, dairy cultures

5 OBSAH PRÁCE 1 ÚVOD CÍL PRÁCE LITERÁRNÍ PŘEHLED Spotřeba mléčných výrobků Mléčné kvašení Význam kyseliny mléčné Bakterie mléčného kvašení Rod Streptococcus Rod Lactococcus Rod Lactobacillus Rod Leuconostoc Rod Pediococcus Rod Bifidobacterium Čisté mlékařské kultury používané při výrobě fermentovaných ml. výrobků Čistá kultura smetanová Čistá kultura jogurtová Čistá kultura acidofilní Čistá kultura kefírová Patogenní mikroorganismy v mlékárenských výrobcích Salmonella sp Campylobacter spp Escherichia coli Staphylococcus aureus Clostridium botulinum Bacillus cereus Vady kysaných mléčných výrobků MATERIÁL A METODIKA Odběr a příprava vzorku Očkování vzorků Živná média MRS Agar (Biokar Diagnostic, France) PCA se sušeným odtučněným mlékem 6

6 Plate Count Agar with skimmed milk (Biokar Diagnostic, France) VRBL (BIO - RAD) Agar s kvasničným extraktem, glukózou a chloramfenikolem Chloramphenicol Yeast Glucose Agar (Hi Media, India) Kultivace Bakterie mléčného kvašení Celkový počet mikroorganismů Koliformní mikroorganismy Plísně a kvasinky Vyjádření výsledků VÝSLEDKY ZÁVĚR SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY

7 1 ÚVOD Již v dávných dobách objevil člověk v kysaném mléce poměrně trvanlivý i stravitelný pokrm, začal jej tedy doma vyrábět. Proto už po celá tisíciletí tvoří tento pokrm základní součást lidské výživy. Nynější kysané mléčné výrobky mají svůj původ v lidových mléčných nápojích. Tyto nápoje vznikaly kvašením mléka přirozenou cestou, zejména působením bakterií mléčného kvašení a kvasinek, které byly v syrovém mléce buď obsaženy, nebo se do něho dostaly sekundární kontaminací. Příprava těchto nápojů se časem v některých krajích ustálila a byla ovlivněna především podnebím a výskytem vhodné mikroflóry. Tato mikroflóra je pro různé oblasti typická a dodává v různých podmínkách při tradičním postupu přípravy lidovým mléčným nápojům charakteristický ráz. (Hylmar, 1986) První, kdo identifikoval dvě probiotické bakterie obsažené v kysaném mléce a zároveň jim přisoudil pozitivní vliv na dlouhověkost Turků, Bulharů a Arménců, byl ruský badatel prof. Ilja Iljič Mečnikov, držitel Nobelovy ceny z roku 1908 za výzkum imunity. Jsou to bakterie: Streptococcus thermophilus a Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus. ( Podle odhadů existuje ve světě několik set druhů kysaných mlék. Nejznámější a nejvýznamnější je jogurt, kefír, acidofilní a jiná kysaná mléka. Tyto výrobky se dnes už vyrábějí průmyslově. V 19. století mikrobiologové určili mikrobiální původce kysání a kvašení. Začaly se využívat stroje a mléko pro výrobu těchto výrobků bylo pasterováno a očkováno čistými mlékařskými kulturami. V širším pojetí se zvláště v zahraničí zahrnují pod název fermentované mléčné výrobky všechny mlékárenské výrobky, při jejichž výrobě byly ke koagulaci použity čisté mlékařské kultury bez ohledu na to, zda samotné nebo v kombinaci s přídavkem sýřivých enzymů v podobě syřidlových preparátů. Potom je do této skupiny zahrnována i výroba tvarohů a sýrů. V užším pojetí jsou do kysaných mléčných výrobků zahrnovány jen ty mlékařské výrobky, které vznikají kysáním mléčné a smetanové směsi pomocí specifických mikroorganismů. (Hylmar, 1986) 8

8 2 CÍL PRÁCE Cílem této bakalářské práce je shrnout poznatky o mikroflóře kysaných mléčných výrobků, charakterizovat rody a druhy mikroorganismů uplatňujících se při výrobě kysaných mléčných výrobků, a také mikroorganismů nežádoucích a kontaminujících mlékárenské výrobky. Cílem praktické části je stanovit významné skupiny mikroorganismů ve vybraných kysaných mléčných výrobcích. 9

9 3 LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Spotřeba mléčných výrobků Spotřeba mléčných výrobků v ČR v roce 1989 byla 260 kg na osobu. Kvůli zvýšení cen mléčných výrobků pak došlo v této spotřebě k výraznému poklesu. Například v roce 1995 činila spotřeba mléčných výrobků 188 kg na osobu. ( Od této doby se kvůli zdražování mléčných výrobků začala jejich spotřeba snižovat, stejně jako začalo ubývat mlékárenských závodů, kterých v ČR v současné době zůstala funkčních asi polovina tedy 63 závodů. Nejmenší spotřeba mléčných výrobků byla zaznamenána v polovině 90. let, přičemž od této doby spotřeba neustále roste a mlékaři předpokládají, že do roku 2014 vzroste spotřeba mléčných výrobků o dalších cca 27 kg/os. V minulém roce stoupla roční spotřeba mléka a mléčných výrobků na 239 kg na osobu, což např. oproti roku 1995 znamená nárůst o 51 kg na osobu. Na růstu se podílí především sortiment sýrů (13,5 kg/os./rok), jogurtů a zakysaných mléčných výrobků (31,6 kg/os./rok). Naopak klesá spotřeba mléka, loni to bylo 53 kg/os./rok. ( V současné době patří skupina mléko a mléčné výrobky mezi produkty charakterizované růstem spotřeby při zřejmé diferenciaci spotřeby uvnitř této skupiny. Došlo k obnovení zájmu spotřebitelské poptávky o mléko a mléčné výrobky, zejména o skupinu výrobků s vysokou užitnou hodnotou. Tento závěr dokumentuje vývoj spotřeby jednotlivých druhů mléčných výrobků. Snížila se např. spotřeba mléčných konzerv (o 62,1 %), konzumního mléka (přibližně o 19,3 %) ale zvýšila se spotřeba sýrů (o 55,9 %), tvarohu (o 38,5 %) a ostatních mléčných výrobků (o 8,3 %). ( V porovnání se zahraniční spotřebou např. jogurtů je ČR v současnosti na 60 % spotřeby Francie, kde se doporučují 3 mléčné výrobky jako denní dávka pro zdravou vyváženou stravu. Spotřeba jogurtů v České republice např. v roce 1994 činila 5 kg na osobu. V tomto roce také proběhla komunikační kampaň, která si kladla za cíl vysvětlit, proč by lidé měli jíst zejména jogurty. Od roku 1996 pak docházelo ke zvyšování jejich spotřeby. V roce 2000 to bylo 12 kg jogurtů/os./rok a v roce 2006 to bylo 13,4 kg 10

10 jogurtů/os./rok v ČR. To je přesto o 40 % méně než v Německu a např. Holanďané mají spotřebu 40 kg jogurtů/os./rok a Francouzi 27 kg jogurtů/os./rok. ( U hodnocení úrovně spotřeby mléka a mléčných výrobků je problémem odlišná metodika sledování spotřeby v ČR a v EU. Státy EU vykazují tzv. čerstvé mléčné výrobky, v ČR je vykazována celková spotřeba mléka a mléčných výrobků v hodnotě mléka bez másla. Při přepočtu na spotřebu obdobných výrobků v ČR je zřejmé, že naše spotřeba značně zaostává za průměrnou úrovní spotřeby v EU. Za průměr EU je poslední údaj k dispozici za rok 1997 a činí 104,6 kg, v ČR je spotřeba pouze 72,4 kg. Velmi vysokou spotřebu v roce 2000 vykazuje Finsko, Irsko a Švédsko, naopak relativně nízká je spotřeba v Belgii a SRN. ( 3.2 Mléčné kvašení Při výrobě mléčných fermentovaných výrobků se využívá některých vlastností mikroorganismů. Při použití čistých mlékařských kultur musí být vytvořeny takové podmínky, aby se čistá kultura mohla plně rozvíjet a zabezpečit organoleptické, fyzikálně chemické změny, typické pro požadovaný druh výrobku. Do skupiny kysaných mléčných výrobků zařazujeme výrobky, u kterých vzniká kyselina mléčná enzymatickým anaerobním procesem přeměny laktózy vlivem bakterií mléčného kvašení. (Cempírková, et. al, 1997) Za pravé bakterie mléčného kvašení se považuje velká přirozená skupina nepohyblivých, nesporulujících grampozitivních koků a tyčinek, které fermentují sacharidy za fakultativně anaerobních podmínek a tvoří jako hlavní produkt kyselinu mléčnou. (Görner, Valík, 2004) Typické bakterie mléčného kysání se řadí do rodů Streptococcus, Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc a Pediococcus. K bakteriím mléčného kvašení se přiřazuje i rod Bifidobacterium. (Grieger, et. al, 1990) Mléčné kvašení je pochod, při němž zmíněné bakterie vyrábějí z jednoduchých sacharidů (hlavně monosacharidů a disacharidů) kyselinu mléčnou. Tato fermentace je náročná na podmínky prostředí. Mikroorganismy často vyžadují vitamíny a dusíkaté organické látky. Jedná se o anaerobní proces. ( 11

11 Kyselina mléčná je dvojího druhu. První je alfa oxypropionová - ethylidenomléčná, která má asymetrický uhlík. Tudíž může být pravotočivá i levotočivá. Směs obou je opticky inaktivní pokud jsou oba isomery přítomny ve stejném množství. Druhá kyselina je beta oxypropionová - ethylenomléčná, která má symetrický uhlík. Zda se tvoří při kysání mléčná kyselina pravotočivá nebo levotočivá závisí na druhu bakterií a také na výchozím materiálu. (Olšanský, 1958) enz. laktáza Lactobacteriaceae: C12 H 22O11 + H 2O enz. laktacidáza 2C6H12O6 4C3H 6O3 (Olšanský, 1958) Při mléčném kysání vznikají kromě hlavních produktů i produkty vedlejší, podle kterých lze mikroorganismy třídit. Skupina homofermentativních mikroorganismů přeměňuje sacharid téměř výlučně na kyselinu mléčnou a heterofermentativní mikroorganismy přeměňují sacharid na kyselinu mléčnou (>50%), kyselinu octovou, oxid uhličitý a za určitých okolností i ethanol. U některých rodů bakterií mléčného kvašení je možné jako identifikační znak použít i konfiguraci a optickou otáčivost kysáním vzniklé kyseliny mléčné. (Görner, Valík, 2004) 3.3 Význam kyseliny mléčné Čerstvé sladké mléko obsahuje zanedbatelné množství mléčné kyseliny. Vyprodukovaná mléčná kyselina v kysaných mléčných výrobcích jim dodává jemně kyselou osvěžující chuť, chrání je a zvyšuje jejich trvanlivost. Sráží mléčné bílkoviny do jemných vloček, zlepšuje využití vápníku, fosforu a železa. Vyvolává sekreci žaludečních šťáv a působí příznivě na aktivitu pepsinu. (Hylmar, 1986) Kyselina mléčná odštěpuje vápník vázaný na kasein a vytváří se volný kasein a mléčnan vápenatý. Kasein z mléka lze vysrážet též použitím jiných organických a anorganických kyselin. V druhé fázi tohoto procesu se kasein převádí do isoelektrického stavu (ph 4,7), v němž má nejnižší rozpustnost a vylučuje se. (Kněz, et. al, 1960) Hlavní význam laktózy z hlediska fyziologie výživy je v tom, že kyselina mléčná, která vzniká v intestinálním ústrojí mikrobiální činností, zvyšuje resorpci vápníku. Ještě lepší využití vápníku nastává při konzumaci kysaných mléčných 12

12 výrobků. Kyselina mléčná tvoří s vápníkem rozpustný resorbovatelný komplex láktátu vápníku a rozpouští určité látky, které by blokovaly transport vápníku v mukóze. Kyselina mléčná kromě toho podporuje resorpci vitamínů přijímaných potravinami a resorpci aminokyselin uvolněných při fermentativním odbourávání bílkovin. (Grieger, et. al, 1990) Kyselina mléčná zabraňuje rozmnožování mikroorganismů rozkládajících mléčné bílkoviny za vzniku látek pro lidské zdraví škodlivých a chuťově nepříjemných. Průkopníkem názoru o příznivých účincích kysaných mlék, zejména jogurtu, byl známý ruský badatel Mečnikov. V pravidelném požívání zakysaných mlék viděl způsob, jak zabránit rozvoji hnilobné mikroflóry v lidském střevním traktu, a tím tvorbě toxinů rozkladem bílkovin za vzniku indolu, skatolu a krezolu. V těchto produktech totiž hledal Mečnikov příčinu rychlého stárnutí lidského organismu. I když jen některé z jeho názorů byly pozdějšími výzkumy potvrzeny, patří mu nesporně zásluha, že upoutal pozornost vědců a lékařů na příznivé, výživné a dietetické účinky fermentovaných mléčných výrobků. (Teplý, et. al, 1968) Mléčná kyselina se vyskytuje v kysaných mléčných výrobcích ve dvou optických izomerech: jako pravotočivá L (+) mléčná kyselina a jako levotočivá D (-) mléčná kyselina. Oba izomery jsou absorbovány v trávicím traktu, ale jejich přeměna je rozdílná. Pravotočivá mléčná kyselina se kompletně přeměňuje v respiračním procesu nebo je syntetizována na glukózu nebo glykogen. Levotočivá mléčná kyselina se transformuje jen omezeně a pozvolna. Tím, že ji organismus jen slabě asimiluje, přechází v určitém množství až do tlustého střeva, kde okyseluje prostředí a brzdí tak rozvoj především hnilobné mikroflóry. (Hylmar, 1986) U kojenců však může levotočivá mléčná kyselina vyvolat acidózu. Doporučuje se proto, aby kysané mléčné výrobky pro kojence obsahovaly převážně pravotočivou mléčnou kyselinu. Dospělí sice snášejí levotočivou mléčnou kyselinu dobře, ale přesto však světová zdravotnická organizace (WHO) doporučuje, aby se nepřekročilo množství 100 mg levotočivé mléčné kyseliny na 1 kg tělesné hmotnosti a den. (Hylmar, 1986) Poměr mezi izomerickými formami mléčné kyseliny je v kysaných mléčných výrobcích dán použitými čistými kulturami, způsobem kultivace, skladováním, případně ochucováním. Mezofilní laktokoky mléčného kvašení, stejně jako leukonostoky a Streptococcus thermophilus produkují pravotočivou mléčnou kyselinu. Jejich produkce levotočivého izomeru je nevýznamná. Podobně je tomu i u kmenů Bifidobacterium 13

13 bifidum. Lactobacillus acidophilus produkuje z celkového množství mléčné kyseliny asi 10 % levotočivého izomeru, zatímco jogurtová kultura 30 až 50 %. (Hylmar, 1986) 3.4 Bakterie mléčného kvašení Jsou to bakterie, které z laktózy tvoří kyselinu mléčnou. Morfologicky jsou to koky nebo tyčinky, vesměs grampozitivní. Systematicky se dělí na homofermentativní mléčné bakterie, které zkvašují cukry na pravotočivou kyselinu mléčnou, přičemž tvoří jen malé množství těkavých produktů, a na heterofermentativní mléčné bakterie, které produkují levotočivou kyselinu mléčnou a vedle toho značné množství jiných kyselin a látek (kyselina octová, oxid uhličitý, ethanol). (Grieger, et. al, 1990) Skupina bakterií mléčného kvašení se dnes skládá z 13 rodů grampozitivních bakterií: Carnobacterium, Enterococcus, Lactococcus, Lactobacillus, Lactosphaera, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Paralactobacillus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus a Weissella. Příbuzné rody s bakteriemi mléčného kvašení jsou rody Aerococcus, Microbacterium a Propionibacterium, které ale nejsou považovány za bakterie mléčného kvašení. (Jay, et. al, 2005) Rod Streptococcus V taxonomii streptokoků se často užívají dva klasifikační systémy vedle sebe. V starším pojetí se klasifikace rodu Streptococcus dělí na šest skupin: pyogenní streptokoky, orální streptokoky, jiné streptokoky, anaerobní streptokoky, enterokoky a mléčné streptokoky. V novém, částečně odlišném klasifikačním systému rodu Streptococcus, jak ho navrhli Schilfer a Kilper-Bälz (1984, 1985, a 1987), je rozdělení do výše uvedených skupin streptokoků ponechané s výjimkou vynechání anaerobních streptokoků. Pro potravinářské mikrobiology je ale z taxonomického hlediska ještě důležitější, že uvedení autoři navrhli skupinu enterokoků a skupinu mléčných streptokoků povýšit na samostatné rody: Enterococcus a Lactococcus. Uvnitř klasických skupin streptokoků a nově navrhnutých rodů odůvodnili a navrhli i nové taxony a některé přesunuli mezi skupinami a rody. (Görner, Valík, 2004) 14

14 Streptokoky rostou v rozmezí 25 až 45 C s optimem 37 C, nerostou při 10 C. Streptokoky jsou komenzály nebo parazity obratlovců, osidlují převážně ústní dutinu a horní část respiračního traktu. (Sedláček, 2007) Buňky jsou okrouhlé nebo vejčité s průměrem 2 µm, když rostou v tekutém médiu, jsou uspořádané v párech, krátkých nebo delších řetízcích, obyčejně nepohyblivé. Netvoří spóry. Jsou grampozitivní. Většinou fakultativně anaerobní, katalázo-negativní. Fermentují sacharid hlavně na kyselinu mléčnou, ale netvoří významné množství plynu. Některé druhy fermentují i organické kyseliny (malonová, citronová) a aminokyseliny (serin, arginin). Neredukují dusičnan na dusitan. (Görner, Valík, 2004) Rod Streptococcus obsahuje druhy parazitické, saprofytické až choroboplodné pro lidi a zvířata. Saprofytické se vyskytují v přírodě a potravinách a mají v potravinářském průmyslu významné využití. Jsou nově zahrnuty v rodech Lactococcus a Enterococcus a řadí se k nim i druh Streptococcus salivarius ssp. thermophilus. (Görner, Valík, 2004) Streptococcus salivarius ssp. thermophilus je termofilní streptokok mléčného kvašení, jehož optimální teplota je 37 až 45 C, zvlášť virulentní kmeny přežijí i čtvrthodinový záhřev na 80 C. Při optimální teplotě sráží mléko za 18 až 20 hodin. Tvoří pravotočivou kyselinu mléčnou a štěpí také kasein. (Teplý, et. al, 1968) Rod Lactococcus V mléčné skupině streptokoků, neboli v rodu Lactococcus nacházíme podle Schilfera a Kilper-Bälza druhy: Lactococcus lactis ssp. lactis, Lactococcus lactis ssp. cremoris, Lactococcus lactis ssp. hordniae, Lactococcus raffinolactis, Lactococcus garviae a Lactococcus plantarum. (Görner, Valík, 2004) Důvody zahrnutí některých druhů mléčné skupiny streptokoků (rod Lactococcus) do jednoho druhu Lactococcus lactis byli následovné: L. lactis ssp. diacetylactis (aromatický streptokok) má všechny hlavní vlastnosti totožné se species Lactococcus lactis, ale má navíc významnou vlastnost fermentovat citran na arómatvornou látku diacetyl a na oxid uhličitý. Tato vlastnost je podle novějších údajů regulována plazmidem, proto není trvalá. Oproti novější systematice se taxon Lactococcus lactis ssp. lactis biovar diacetylactis používá dále pro jeho výjimečné vlastnosti v mlékárenské mikrobiologii. (Görner, Valík, 2004) 15

15 Rod Lactococcus má sférické nebo ovoidní buňky, které se vyskytují ve dvojicích nebo v krátkých řetízcích. Jsou grampozitivní, nepohyblivé, bez pouzder a netvoří spóry. Jsou fakultativně anaerobní a chemoorganotrofní. Hlavním produktem fermentace je pravotočivá kyselina mléčná. Optimální růstová teplota je 37 C, rostou při 10 C, ale ne při 45 C. Také nerostou při 6,5 % NaCl. (Sedláček, 2007) Lactococcus lactis je obsažen v našich typech smetanové kultury a je její nejdůležitější složkou. Tvoří kulaté buňky velikosti 0,6 až 1,0 µm, řazené nejčastěji v párech, vzácněji v krátkých řetízcích, a to zejména v logaritmické fázi. Jen některé variety tohoto mikroorganismu vytvářejí i dlouhé řetízky. Je to fakultativně anaerobní mikroorganismus, grampozitivní a nehemolytický. Ze sacharidů štěpí glukózu, laktózu a maltózu, sacharózu jen v nepatrné míře. Při 20 až 30 C tvoří pravotočivou kyselinu mléčnou v množství 0,7 až 0,8 % a jen nepatrné množství vedlejších produktů. (Teplý, et. al, 1986) Lactococcus cremoris je další důležitou složkou smetanové kultury. Má formu kulatých buněk velikosti 0,6 až 1,0 µm. V optimálních kulturách tvoří čerstvá kultura dlouhé řetízky, které se však stářím rozpadávají ve dvojice. Je to fakultativně anaerobní mikrob grampozitivní. Ze sacharidů štěpí glukózu a laktózu, v menší míře může zkvašovat výjimečně i sacharózu a rafinózu. (Teplý, et. al, 1986) Lactococcus diacetylactis je v zahraniční literatuře uváděn jako složka většiny evropských typů smetanové kultury. I když tohoto mléčného streptokoka pokládají někteří autoři za jednu z variet Lactococcus cremoris, nelze zanedbat jeho význam zejména z hlediska jeho odlišné biochemické aktivity. Lactococcus diacetilactis se totiž vyznačuje současnou aktivitou kyselinotvornou a arómatvornou. Tvoří v mléce 0,8 % pravotočivé kyseliny mléčné za současného vzniku menšího množství těkavých kyselin a oxidu uhličitého, má však i schopnost vytvářet z kyseliny citrónové značné množství aromatických látek, zvláště diacetylu. Obě tyto složky tvoří v mléce i tehdy, je-li v něm pěstován sám. (Teplý, et. al, 1986) Rod Lactobacillus Rod Lactobacillus zahrnuje fakultativně anaerobní nebo mikroaerofilní nepohyblivé tyčinkovité bakterie mléčného kvašení (zpravidla rovné, občas kokobacily). Jejich hlavním metabolitem fermentace sacharidů je kyselina mléčná, ale i octová, etanol a oxid uhličitý. Nachází se ve fermentovatelných rostlinných a 16

16 živočišných materiálech a také v trávicím a zažívacím traktu lidí a zvířat. Jsou saprofyti, jen zřídka patogeny. Laktobacily rostou, rozmnožují se a metabolizují za anaerobních podmínek, ale i při sníženým obsahu kyslíku ve všech prostředích, které jim poskytují dostatek fermentovatelných sacharidů, štěpných produktů bílkovin, nukleových kyselin a vitamínů skupiny B. Upřednostňují mezofilní a mírně termofilní teploty. Jsou acidotolerantní až acidofilní. Při fermentaci tvorbou kyselin snižují kyselost prostředí až pod ph 4,0. Kyseliny mléčná a octová jsou v kyselém prostředí málo disociované a v tomto stavu působí spolu se sníženým ph inhibičně až mikrobicidně na ostatní mikroorganismy v prostředí, s výjimkou jiných bakterií mléčného kvašení a kvasinek. Tyto vlastnosti laktobacilů jsou užitečné a uplatňují se v potravinářské technologii a v intestinálním traktu lidí a zvířat mají také pozitivní vliv. (Görner, Valík, 2004) Na základě konečných produktů fermentace cukrů je možno dělit laktobacily do tří skupin. Obligátně homofermentativní laktobacily fermentují hexózy výhradně na kyselinu mléčnou, pentózy ani glukonát nefermentují. Do skupiny spadá L. delbrueckii, L. acidophilus a L. helveticus. Fakultativně heterofermentativní laktobacily fermentují hexózy na kyselinu mléčnou, nebo na směs kyseliny mléčné, octové, mravenčí a ethanolu. Pentózy fermentují na kyselinu mléčnou a octovou. Zástupci této skupiny jsou L. casei a L. plantarum. Obligátně heterofermentativní laktobacily fermentují hexózy na kyselinu mléčnou, octovou (ethanol) a oxid uhličitý. Pentózy fermentují na kyselinu mléčnou a octovou. Do skupiny spadá L. fermentum a L. kefir. (Sedláček, 2007) Mléko po opuštění vemene při aseptickém dojení neobsahuje laktobacily. Později může dojít ke kontaminaci z vnějšího prostředí prachem, stykem s mlékárenským nářadím a zařízením. Mléčné streptokoky (Lactococcus spp.) rostou v mléce rychleji než laktobacily. Proto v čerstvém kysaném mléku je laktobacilů v poměru k laktokokům málo. Ale když kysané mléko stojí ve vhodných teplotních podmínkách delší čas, přerůstají laktobacily, neboť jsou vůči kyselému prostředí tolerantnější než laktokoky. (Görner, Valík, 2004) Lactobacillus bulgaricus (L. delbrueckii ssp. bulgaricus) je termofilní tyčinka ze skupiny bakterií mléčného kvašení. Při teplotě kolem 40 C sráží mléko někdy již i za 2,5 až 4,5 hodiny. V tekutém prostředí tvoří tyčinky dlouhé 4 až 10 µm a široké 0,5 až 1,5 µm. Vyskytují se však i formy delší a širší. V nepříznivém prostředí má zvýšený sklon k tvorbě řetízků až dlouhých vláken tyčinek, zejména pak tvoří zprohýbané involuční tvary. Má stálý a velký sklon ke granulaci. V mléce tvoří zpravidla kyselinu mléčnou inaktivní, podle některých autorů však i levotočivou, popř. i pravotočivou. 17

17 Dále tvoří i nepatrné množství kyseliny octové, mravenčí a jantarové. Ze sacharidů fermentuje laktózu, glukózu a galaktózu. (Teplý, et. al, 1968) Lactobacillus acidophilus, základní kultura čisté acidofilní kultury, je fakultativně anaerobní mikroorganismus, jehož optimální kultivační teplota je 37 C. Špatně roste již při teplotách nižších než 20 C a vyšších než 48 C. Teplotu 63 C běžné kmeny tohoto mikroorganismu vůbec nesnášejí. V mladé kultuře je grampozitivní a značně odolný vůči fenolu. Pro zdravotnické účely se pěstují speciální kmeny Lactobacillus acidophilus, odolné vůči hlavním druhům antibiotik používaných ve zdravotnictvích. Mléko sráží při ph 5,8, optimální reakci vykazuje při ph 6,5. V čerstvé kultuře se vyskytuje nejčastěji jako tyčinka dlouhá 2 až 10 µm a široká 0,5 až 1,0 µm, méně často v párech, shlucích nebo kratších řetízcích. Ve staré kultuře nebo v nepříznivém životním prostředí vytváří involuční tvary, a to buď protáhlé, nebo silně zprohýbané tyčinky, které se mohou barvit podle Gramma i negativně. (Teplý, et. al, 1968) Lactobacillus caucasicus (L. delbrueckii) je tenká grampozitivní tyčinka nepohyblivá a nesporulující. Tepelné optimum bývá 40 až 44 C, některé kmeny mají však tepelné optimum kolem 30 C. Tepelné minimum této tyčinky je 18 až 25 C a tepelné maximum 50 C. Vytváří až 1,5 % kyseliny mléčné, mléko rychle sráží, kasein však nerozkládá. Žije v symbióze s kefírovými kvasinkami. (Teplý, et. al, 1968) Lactobacillus brevis se uvádí jako další složka kefírové kultury, resp. kefírových zrn. Je to středně dlouhá tyčinka s tepelným optimem nižším než 30 C, roste dokonce ještě při 10 C. Je to mikrob heterofermentativní a ve společenství s kefírovou mikroflórou tvoří až 1,5 % inaktivní kyseliny mléčné, menší množství pravotočivé kyseliny mléčné i jiné látky, jako ethanol, kyselinu octovou a oxid uhličitý. (Teplý, et. al, 1968) Rod Leuconostoc Bakterie z rodu Leuconostoc patří do čeledi Streptococcaceae a mají stejně jako mléčná skupina streptokoků (Lactococcus spp.) sérologickou skupinu N. Buňky jsou okrouhlé, když rostou na agaru, bývají čočkovité, jsou uspořádané v párech a v řetízkách. Jsou grampozitivní, nepohyblivé, netvoří spóry. Jsou fakultativně anaerobní, katalázo-negativní. Nejsou proteolytické, nehemolyzují, neredukují dusičnan na dusitan. (Görner, Valík, 2004) 18

18 Na vhodných polotuhých živných půdách tvoří zpravidla dlouhé okrouhlé hladké bílé kolonie. V bujónové kultuře způsobují pravidelný zákal, ale kmeny tvořící dlouhé řetízky se usazují na dně zkumavky. Jejich optimální teploty jsou v širokém rozmezí 20 až 30 C, některé rostou až po 5 C. V živných půdách vyžadují přítomnost růstových faktorů, aminokyseliny a vitamíny skupiny B. Růst je podmíněný přítomností fermentovatelného sacharidu. Glukózu fermentují všechny druhy pomocí kombinace hexózomonofosfátových a fosfoketolázových metabolických drah. Tvoří kyselinu mléčkou, oxid uhličitý a etanol. Některé kmeny mají i oxidativní mechanizmus a produkují místo ethanolu kyselinu octovou. (Görner, Valík, 2004) Mikroorganismy rodu Leuconostoc jsou široce rozšířeni na rostlinách a v mléčných produktech, běžně jsou přítomni i v jiných potravinách. Obecně jsou považováni za nepatogenní pro rostliny či živočichy, ale například druhy L. citreum, L. lactis nebo L. pseudomesenteroides byly izolovány z humánních zdrojů. Někdy jsou souhrnně označovány jako,,mléčné koky. (Sedláček, 2007) Samotné mléko je pro růst leukonostoků nevhodným médiem. Mnohé kmeny v něm však rostou dobře, když se obohatí kvasničným autolyzátem a glukózou. L. mesenteroides ssp. mesenteroides takto obohacené mléko obyčejně okyseluje a sráží za tvorby oxidu uhličitého. Jiné druhy a kmeny, které mají vysoké nároky na obsah aminokyselin, mléko zpravidla nesrážejí. (Görner, Valík, 2004) Většina leukonostoků disimiluje za přítomnosti fermentovatelného sacharidu citran za tvorby diacetylu ( CH 3 CO CO CH 3 ), acetoinu ( CH 3 CHOH CO CH 3 ) a 2,3-butylenglykolu. Diacetyl je v mlékařství významnou aromatickou látkou. Naproti tomu v pivě a ve víně je nežádoucí. Vlastnost produkovat diacetyl ztrácejí některé kmeny, když jsou pasážované v laboratorních podmínkách. (Görner, Valík, 2004) Leuconostoc citrovorum je důležitý mikroorganismus, který za přítomnosti kyseliny citrónové a laktózy tvoří ve smetanové kultuře acetoin a dále diacetyl. Tvoří kulaté, často protáhlé buňky velikosti 0,6 až 1,0 µm, které se vyskytují ve dvojicích i v řetízcích. Je to fakultativně anaerobní grampozitivní mikroorganismus. Ze sacharidů štěpí glukózu, fruktózu, galaktózu a jen zcela výjimečně štěpí sacharózu. Na rozdíl od Streptococcus lactis tvoří jen menší množství levotočivé nebo inaktivní kyseliny 19

19 mléčné, ale značné množství vedlejších produktů. Z fermentované laktózy tvoří 25 až 50 % těkavých kyselin a 10 až 15 % etanolu. (Teplý, et. al, 1968) Leuconostoc dextranicum je další arómatvorná složka smetanové kultury, jsou to kulaté buňky velikosti 0,6 až 1,0 µm, které vytvářejí dvojice i kratší řetízky. Je to grampozitivní fakultativně anaerobní mikroorganismus. Kromě menšího množství levotočivé nebo inaktivní kyseliny mléčné vytváří značné množství těkavých látek, podobně jako Leuconostoc citrovorum. Ze sacharidů štěpí glukózu, sacharózu, galaktózu, fruktózu a z pravidla i laktózu a manózu. (Teplý, et. al, 1968) Rod Pediococcus Bakterie z rodu Pediococcus patří mezi homofermentativní bakterie mléčného kvašení. Jejich hlavním produktem při fermentaci sacharidů je racemická a pravotočivá kyselina mléčná. Jejich původním stanovištěm jsou rostliny a z nich se dostávají do příslušných potravin. V některých jsou škůdci a v jiných jsou součástí fermentační mikroflóry. Zpravidla se vyskytují ve společenství se streptokoky mléčné skupiny, s leukonostoky a s laktobacily. Z fyziologického hlediska jsou víc podobné laktobacilům než streptokokům. (Görner, Valík, 2004) Pediokoky mají kokovité buňky, jejich dělení se uskutečňuje i ve dvou na sebe kolmých rovinách, což morfologicky připomíná sarciny. Často jsou uspořádané v párech. Jsou grampozitivní, nepohyblivé, netvoří spóry, neredukují dusičnan na dusitan, jsou fakultativně anaerobní, katalázo-negativní. Jejich tolerance vůči kyslíku je variabilní. (Görner, Valík, 2004) Na vhodných polotuhých mediích tvoří drobné hladké okrouhlé šedé kolonie s průměrem 1 až 2,5 mm. V bujónu rostou v celém objemu a tvoří rovnoměrný zákal. Všechny druhy rostou při 30 C. Jako všechny bakterie mléčného kvašení jsou náročné na růstové faktory, aminokyseliny a vitamíny skutiny B. Růst je podmíněný přítomností fermentovatelného sacharidu, všechny fermentují glukózu. Nejsou proteolytické. Jako typičtí saprofyti nejsou patogenní pro lidi a zvířata. (Görner, Valík, 2004) Vyskytují se hojně na rostlinném materiálu, v potravinách i nápojích. Obecně jsou chápány jako nepatogenní pro rostliny nebo živočichy, i když jsou ojediněle izolovány z klinického materiálu. Někdy jsou souhrnně označovány jako,, mléčné koky. (Sedláček, 2007) 20

20 Za optimálních podmínek fermentují využitelné sacharidy na kyselinu mléčnou. Za jiných podmínek se přechodný fermentační produkt kyselina pyrohroznová (pyruvát) mění na jiné konečné produkty. (Görner, Valík, 2004) Rod Bifidobacterium Bifidobakterie mají významnou úlohu v intestinálním traktu kojenců. Z fermentovatelných sacharidů produkují kyselinu octovou a kyselinu mléčnou, které inhibují nežádoucí bakterie a stimulují intestinální peristaltiku. Kyselina octová, kterou bifidobakterie produkují ve větším množství než kyselinu mléčnou (v poměru 3:2), má silnější antagonistický účinek na nevítané gramnegativní bakterie než kyselina mléčná. (Görner, Valík, 2004) Bifidobakterie jsou tyčinky, které mají velmi rozmanitý tvar. Jsou obvykle zakřivené a kyjovité, často s náznaky větvení. Uspořádané jsou jednotlivě, nebo ve dvou ve,, V seskupení, občas v řetízcích, palisádách nebo růžicích. Příležitostně vykazují kokovité tvary. Jsou grampozitivní, nepohyblivé, nesporulující a aerobní. Optimální růstová teplota je v rozmezí 37 až 41 C. Charakteristickým klíčovým enzymem rodu je fruktózo-6-fosfát-fosfoketoláza. (Sedláček, 2007) V současnosti se v mlékařském průmyslu vyrábí řada tzv. probiotických kysaných mlék jogurtového typu s uvedenými účinky na složení střevní mikroflóry. K tomuto účelu se používá bakterií mléčného kvašení původem z lidského střeva, např. Bifidobacterium longum BB536, vedle vlastních jogurtových bakterií v kysaném mléčném přípravku jogurtového typu. Tzv. probiotické bakterie musí mít proto schopnost překonat v žaludku pro ně nepříznivé prostředí (žaludeční šťávy), musí snášet žlučové kyseliny a nízké povrchové napětí a musí odolávat pohyblivosti střev (peristaltika). (Görner, Valík, 2004) 3.5 Čisté mlékařské kultury používané při výrobě fermentovaných mléčných výrobků V současné době bývají čisté mlékařské kultury nejčastěji definovány jako vybrané a vyšlechtěné mikroorganismy, záměrně přidávané do mléka nebo smetany s cílem vyvolat určité specifické změny ve vzhledu, konzistenci, obsahu, chuti i dalších 21

21 vlastnostech daného mléčného výrobku. U nás se definují čisté mlékařské kultury jako klíčové výrobní prostředky, kterými se do suroviny (mléko, smetana, syrovátka) zbavené všech patogenních i pokud možno nežádoucích a technologicky škodlivých mikroorganismů zavádějí vybrané účelově zaměřené druhy specifických mikroorganismů, aby vyvolaly a zajistily správný průběh výrobního procesu a dosažení žádoucí jakosti hotových výrobků. (Hylmar, 1985) Pro mlékárenskou výrobu kysaných mléčných výrobků je zvlášť důležitý výběr vhodných čistých mlékařských kultur. Proto se stále hledají nové a speciální kmeny, které by umožňovaly zavádět další druhy kysaných mléčných výrobků do výroby a na trh. U čistých mlékařských kultur používaných při výrobě kysaných mléčných výrobků se požadují základní charakteristické vlastností, a to zajištění správného průběhu biochemických pochodů, především mléčného kvašení, správný vývoj senzorických vlastností a příznivé dieteticko - léčebné účinky. Výběr se zaměřuje hlavně na čisté mlékařské kultury se zvýšenými antagonistickými účinky, s odolností vůči jiným antibiotikům a jiným inhibičním látkám, na možnost jejich adaptace v trávicím traktu a odolnost kultur vůči fágům. U směsných kultur se požaduje, aby použité druhy a kmeny mezi sebou nevykazovaly antibiózu, ale naopak reverzní symbiózu, které zajišťuje vzájemné stimulující působení na růst a biologickou aktivitu. (Hylmar, 1986) Přestože se ve světě vyrábí mnoho druhů kysaných mléčných výrobků, liší se svými enzymovými procesy jen velmi málo a okruh využívaných mikroorganismů není velký. Při výrobě kysaných mléčných výrobků se uplatňují tři skupiny čistých mlékařských kultur, a to mezofilní laktokoky mléčného kvašení, termofilní bakterie mléčného kvašení a kombinace bakterií mléčného kvašení s kvasinkami zkvašujícími laktosu. (Hylmar, 1986) Mezofilní laktokoky se uplatňují při výrobě kysaných mléčných výrobků především v mikroflóře smetanové kultury. Tato kultura obsahuje různou kombinaci vhodných kyselinotvorných kmenů Lactococcus lactis a Lactococcus cremoris a kmenů tvořících aroma Leuconostoc cremoris a Leuconostoc dextranicum. Z termofilních bakterií mléčného kvašení se při výrobě kysaných mléčných výrobků využívají laktobacily a streptokoky. Z laktobacilů se uplatňují především Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus a Lactobacillus helveticus var. jogurti a ze streptokoků Streptococcus thermophilus, dále Bifidobacterium bifidum, Pediococcus acidilactici a další. 22

22 Z bakterií mléčného kvašení používaných při výrobě kysaných mléčných výrobků v kombinaci s kvasinkami, kde kromě mléčného kvašení dochází i ke kvašení ethanolovému, je nutné především zmínit Lactobacillus lactis var. caucasicus, Lactobacillus casei, Lactobacillus lactis a především Lactococcus lactis. Z kvasinek zkvašující laktózu se uplatňují především Candida kefyr, Kluyveromyces lactis a Kluyveromyces fragilis. (Hylmar, 1986) Čistá kultura smetanová K výrobě ušlechtile zakysaného mléka a smetany se používá smetanové kultury. Mikroflóru smetanové kultury tvoří kyselinotvorné bakterie, zastoupené převážně druhy Lactococcus lactis a Lactococcus cremoris a bakterie tvořící aroma, zastoupené druhy Leuconostoc citrovorum a Leuconostoc dextranicum. V některých typech smetanové kultury se vyskytují ještě kultury Lactococcus diacetylactis. Uvedené mikroorganismy se v jednotlivých typech smetanové kultury vyskytují v různých kombinacích a v různém poměru, přitom však poměr bakterií kyselinotvorných k bakteriím k aromatvorným má být v jakostní kultuře asi 9:1, nejvýše 8:2. (Teplý, et. al, 1968) Tyto mezofilní bakteriální kultury se v mlékařské praxi používají nejčastěji. Jejich kysací nebo aromatvorná schopnost se využívá při výrobě skoro všech fermentovaných mléčných produktů (s výjimkou jogurtů): kysané mléko, smetana, tvarohy, všechny druhy sýrů (samostatně nebo vedle specifických kultur). Mezofilní bakterie mléčného kvašení se vhodně kombinují na složené nebo směsné kultury. Takové se mohou vyrábět pouze z druhů a kmenů, které se dobře snášejí a podle možností se mají v růstu a metabolizmu doplňovat. V žádném případě nesmí docházet k antagonismu. Jeho příčinou mezi jednotlivými druhy a kmeny může být tvorba známých nebo neznámých antibiotických látek. Do úvahy přicházejí i rozdílné rychlosti růstu, diferencovaná přizpůsobivost na společné růstové médium, odlišné teplotní optimum růstu a maximálního metabolizmu. (Görner, Valík, 2004) V průběhu mléčného kvašení lze rozeznat čtyři fáze. V první fázi, nazývané také inkubační, která při 20 C trvá 2 až 6 hodin, se projevuje jen nepatrná biochemická aktivita. Teprve v následující, druhé fázi, která u smetanové kultury probíhá přibližně až do 20. hodiny zrání, je množení mikroorganismů kultury nejintenzivnější, přitom též dosahuje kyselost kultury optimálních hodnot. V této fázi mezi 16. a 20. hodinou kultivace je také třeba kulturu znovu přeočkovat nebo alespoň uložit do chladničky, aby 23

23 se zabránilo dalšímu prokysání. Třetí fáze, mezi 20. a 24 hodinou, je fáze stacionární, v tomto stádiu zralosti kultura již neprodělává podstatné změny, a to ani mikrobiologické, ani chemické. Kultura v této době stagnuje a není schopna dalšího vývoje, i když dosud nejeví žádné znaky degenerace. Konečně čtvrtá fáze, tzv. fáze dožívání, jeví již znaky odumírání kultury, a to hlavně zřetelným úbytkem počtu živých organismů a menším úbytkem kyselosti. (Teplý, et. al, 1968) Po skončení zrání smetanové kultury se nemá oddělovat viditelné množství syrovátky. Smetanová kultura má jemnou konzistenci a mléčně kysanou, čistou a mírně aromatickou vůni a chuť. Po promíchání se na stěně skleněné baňky vytvoří celistvý film, který se do jedné minuty netrhá. (Grieger, et. al, 1990) Čistá kultura jogurtová K výrobě jogurtů se používají různé typy jogurtových kultur. Jogurtová kultura (klasická) je směsný typ kultury, kterou tvoří termofilní tyčinky Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus a termofilní streptokok druhu Streptococcus salivarius ssp. thermophilus. (Teplý, et. al, 1968) Tito mikroorganismy mají symbiotický vztah a spolu se vyznačují rychlou tvorbou kyseliny mléčné, při optimální teplotě 40 až 43 C koagulují kasein za 2 až 3 hodiny. Koagulace začíná při hodnotě ph 5,3 a při 4,5 je ukončená. Druhou významnou vlastností jogurtového zákysu je tvorba aromatické látky jogurtů acetaldehyd v množství 20 až 30 mg/l. (Görner, Valík, 2004) Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus stimuluje růst Streptococcus salivarius ssp. thermophilus, který má malou schopnost hydrolyzovat bílkovinu, proto první ho podporuje uvolňováním aminokyselin z bílkovin mléka svojí větší proteolytickou aktivitou. Streptococcus salivarius ssp. thermophilus naopak stimuluje tvorbu kyseliny mravenčí (při anaerobní kultivaci), růst a metabolizmus Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus. Při vysokém záhřevu mléka určeném pro výrobu jogurtu (80 C po dobu 20 až 30 min nebo 95 C po dobu 5 min) vzniká termickým rozkladem laktózy taktéž kyselina mravenčí, ale ne dostatečné množství. Při výrobě jogurtů z nezahuštěného mléka (jogurtové mléko a jiné) se stává, že vzniklá sraženina nemá požadovanou konzistenci, velmi snadno se poruší a uvolňuje syrovátku. Z tohoto důvodu se používá jogurtová kultura, která se vyznačuje tvorbou slizu, vedle ostatních požadovaných vlastností. Slizy zvyšují kompaktnost koagulátu. 24

24 Tuto vlastnost získávají jogurtové kultury vlivem nižší kultivační teploty (30 C), při vyšší hodnotě ph, při méně častém přeočkovávání jako i izolací kmenů, u kterých je tato vlastnost významná. (Görner, Valík, 2004) Někteří autoři uvádějí jako třetí složku některých tradičních jogurtových kultur také Lactobacillus jogurti, který tvoří inaktivní kyselinu mléčnou a má slabou proteolytickou činnost. Jogurtové kultury běžně používané v našem mlékárenském průmyslu však obsahují jen Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus a Streptococcus salivarius ssp. thermophilus. (Teplý, et. al, 1968) Kultura acidofilního jogurtu je složena tak, že doplňuje mikroflóru normální jogurtové kultury ještě o tyčinku Lactobacillus acidophilus tak, že poměr tyčinek a streptokoků zůstává v zásadě nezměněn 1:1. Účelem je doplnit výživný účinek jogurtu o léčivé účinky Lactobacillus acidophilus. Z tohoto hlediska je někdy v jogurtové kultuře nahrazena vůbec bulharská tyčinka tyčinkou acidofilní. Jogurtová kultura se podobně jako kultura smetanová pěstuje ve vybraném mléce. Na obsahu tuku kultura nezávisí a lze ji proto pěstovat i v odstředěném mléce. Optimální kultivační teplota je 40 až 45 C. Některé kmeny kultur jsou adaptovány až na 48 C, neodlučují syrovátku, a proto tím bezpečně zajišťují mikrobiální čistotu. Kultivační doba je asi 3 až 3,5 hodiny. Jakmile se vytvoří viditelná, byť i nepatrná vrstvička syrovátky, kultura se ihned vychladí bez třepání ve vodní lázni a uskladní v chladu. (Kněz, et. al, 1960) Dobrá jogurtová kultura ve vychlazeném stavu (asi +10 C) má hustou konzistenci, hrubší než smetanová kultura. Film na stěnách neulpívá, ale rozděluje se v praménky, které stékají po skle. Chuť je čistě kyselá, specificky jogurtová. Jogurt musí být na povrchu suchý, prostý syrovátky. (Kněz, et. al, 1960) Čistá kultura acidofilní Acidofilní kultura je důležitá pro výrobu acidofilních mléčných výrobků nejen v mlékařském průmyslu, ale i ve zdravotnictví. Základní mikroflórou čisté acidofilní kultury je termofilní tyčinka bakterií mléčného kvašení Lactobacillus acidophilus. (Teplý, et. al, 1968) Pěstování acidofilní kultury je v podstatě velmi jednoduché, neboť kultura má poměrně velké tepelné rozmezí a kmeny používané v mlékárenském průmyslu jsou značně vitální. Plnotučné nebo odstředěné sterilní mléko se naočkuje 1 % matečné 25

25 kultury a kultivuje se při teplotě 37 C. Kultivační doba je obvykle 8 až 16 hodin. Použije-li se denně přeočkovávaných nebo zvlášť vitálních kultur nebo většího množství k očkování, je tato doba kratší, použije-li se silně oslabených kultur, je naopak delší. (Teplý, et. al, 1968) Matečná kultura, popř. matečný a provozní acidofilní zákys mají po skončení doby kultivace mít vzhled hustě sraženého mléka s nepatrnou vrstvou syrovátky pod povrchem. Konzistence vychlazených acidofilních zákysů bývá obvykle podle druhu použitého kmene acidofilní kultury mezi konzistencí smetanového nebo jogurtového zákysu, často však bývá hustší a u některých kmenů středně nebo plně táhlovitá. Chuť acidofilního zákysu je ostře, ale čistě kyselá a typická pro všechny kmeny acidofilní kultury. (Teplý, et. al, 1968) V acidofilním mléce mají být v době končící trvanlivosti nebo minimální spotřeby v koncentraci více než 6 10 KTJ/ml. Pouze v této vyšší koncentraci mají ve střevě požadovaný účinek. Obyčejně do výrobku, který byl okyselený pravými bakteriemi mléčného kvašení, se přidávají kultury probiotických bakterií před jeho zráním nebo v době zrání v takovém množství, aby i bez pomnožení měli na konci uvedenou koncentraci. (Görner, Valík, 2004) Lactobacillus je trvalým a typickým obyvatelem zdravého zažívacího traktu savců. Vyznačuje se značnou aktivitou ve tvorbě kyselin, jichž tvoří 1,6 až 2 %. Je to mikrob homofermentativní, který zkvašováním cukrů tvoří inaktivní kyselinu mléčnou a podle variet v některých případech i přebytek kyselin levotočivé a nepatrné množství kyselin těkavých. Zkvašuje maltózu, aesculin a zpravidla i sacharózu, dále laktózu, glukózu, galaktózu, levulózu, manózu. Pouze některé variety zkvašují výjimečně i rafinózu, salicin, trehalózu, vzácně inulin, dextrózu a škrob. Nezkvašují pentózy ani vyšší alkoholy. Produkt biochemické činnosti Lactobacillus acidophilus, kyselina mléčná, se uplatňuje ve vtahu k fosforečným a vápenatým solím v mléce a má primární vliv na vysrážení kaseinu. Přitom tvoří mimo jiné i rozpustný mléčnan vápenatý, a proto ovlivňuje požívání acidofilních výrobků bilanci vápníku a vyvolává bez protiopatření nebezpečí acidózy. Kromě uvedeného rozkladu laktózy odbourává Lactobacillus acidophilus svými endoenzymy po odumření nepatrně i mléčný tuk za tvorby mastných kyselin. Podstatou léčivých účinků jsou hlavně tyto vlastnosti acidofilní tyčinky: schopnost implantace v lidském střevním traktu, silná aktivita v tvorbě kyseliny mléčné a tvorba vitamínů a specifických antibiotických látek. (Kněz, et. al, 1960) 26

26 Probiotické bakterie mají jednoznačně pozitivní vliv na kvalitativní a kvantitativní složení normální střevní mikroflóry, na osídlení střevní sliznice příznivou mikroflórou, na potlačení střevních choroboplodných bakterií a na zlepšení frekvence stolice především u starších lidí. Za pravděpodobný se považuje pozitivní účinek probiotických bakterií na stimulaci imunitního systému a na přeměnu některých prekurzorů prokancerogenních látek v zažívacím traktu. (Görner, et. al, 2004) Čistá kultura kefírová Používání kefírové kultury je v zahraničí velmi rozšířeno k výrobě dietetického mléčného výrobku - kefíru. Kefírová kultura má zvláštní postavení mezi čistými mlékařskými kulturami. K její přípravě se používá buď originálních kefírových zrn, nebo se ve speciálních závodech na výrobu čistých mlékařských kultur uměle sestavuje z čistých mikroorganismů příslušného druhu. Složení kefírových kultur nebývá proto jednotné. (Teplý, et. al, 1968) Typická mikroflóra kefírových zrn je složená z mléčných kvasinek, laktokoků a laktobacilů typických pro kefírová zrna. Z laktokoků jsou to převážně Lactococcus lactis ssp. lactis a Lactococcus lactis ssp. cremoris. Z laktobacilů jsou to Lactobacillus delbrueckii (starší název L. caucasicus), Lactobacillus brevis, Lactobacillus casei a Lactobacillus kefir. Z mléčných kvasinek (fermentujících laktózu s minimální tvorbou ethanolu) jsou to Kluyveromyces fragilis a Torulopsis kefir (Candida kefir). (Görner, Valík, 2004) Různí autoři uvádějí ještě další složky kefírové kultury, které byly izolovány z kefíru připraveného z originálních kefírových zrn. Někdy je Lactobacillus caucasicus (L. delbrueckii) doplněn ke zvýšení léčebných účinků kefíru ještě Lactobacillus acidophilus a Propionibacterium. (Teplý, et. al, 1968) Původně se kefír vyráběl z kefírových zrn. Zrna jsou žlutohnědé barvy, mastná, nepravidelného tvaru, tvrdá, ale pružná a zapáchající po sýru nebo žluklém másle. Kefírová zrna v suchém stavu obsahují 12,35 % vody, 3,79 % tuku, 6,62 % popela, 75,71 % bílkovin a 1,44 % kyseliny mléčné. (Kněz, et. al, 1960) Kefírová zrna se uchovávají buď ve stavu latentním, tj. vysušená, nebo živá, tj. v živném roztoku. Použije-li se k výrobě kefíru suchých kefírových zrn, je první částí výroby aktivace zrn. Zrna se aktivují tak, že se uloží na 24 hodin do převařené vody 27

27 zchlazené na 25 až 30 C. Po promytí se tato operace opakuje. Kefírová zrna nabobtnají, dostanou světlejší barvu a pružnou, chrupavčitou konzistenci. Takto oživená zrna se přenesou do převařeného mléka vytemperovaného na 20 C, v němž se kultivují 24 hodin při teplotě 18 až 20 C, nejvýše 22 C. Zrna lze oživit také v mléce. V tom případě se suchá zrna dají do vody teplé 30 C pouze na 3 hodiny, potom se voda slije a zrna se přelijí svařeným mlékem teplým 20 C. Každý den se pak mléko vyměňuje, a to tak dlouho až zrna změknou a dostanou formu podobnou květáku. Dosažení optimálního poměru mikroflóry vyžaduje často delší než desetinásobné přeočkování. Zrna, která ani pak nevyplují na povrch mléka, nutno z výrobku vyřadit. Dobrá kefírová zrna se poznají podle příjemné, typické kefírové vůně a lehce štiplavé chuti. Další postup u oživených, původně vysušených zrn je stejný jako při použití zrn živých. Znaky zralé kefírové kultury se plně projevují až po 48 hodinách kultivace. Zralá kefírová kultura obsahuje 0,5 až 0,9 % alkoholu a má příjemnou a osvěžující chuť. V některých zemích se požaduje středně výrazná, ale příjemná kyselá kvasničná příchuť. Kultura po 24 hodinách kultivace není zcela vyzrálá, to se projevuje její nižší kyselostí, menší šumivostí i celkově menší chuťovou výrazností. Přezrálá kultura je naproti tomu až nepříjemně ostře kyselá, v uzavřených lahvích má vysoký obsah oxidu uhličitého. (Kněz, et. al, 1960) Laktokoky se v umělé kefírové kultuře můžou nahradit vhodným mezofilním smetanovým zákysem. Tvoří v kefírových zrnech většinu bakterií. Jejich úlohou je rychlá tvorba kyseliny mléčné a koagulace kaseinu. Kefírové laktobacily sami v mléce špatně rostou, naproti tomu spolu s kefírovými kvasinkami tvoří symbiózu a v jejich společenství rostou dobře. Tvoří více kyseliny mléčné než laktokoky (1,5 % oproti 0,8 %), ale až v pozdějších fázích fermentace mléka. Jejich další významnou úlohou v kefírových zrnech je tvorba pojiva, které je tvořeno nerozpustnými polymery (slizovité látky), vznikající při extracelulární syntéze. Mléčné kvasinky fermentují laktózu za tvorby menšího množství etanolu (0,1 až 1 %) a oxidu uhličitého. (Görner, Valík, 2004) Bakterie mají vyšší optimální teplotu než kvasinky, proto při teplotách v rozmezí 26 až 30 C kefír rychleji kvasí a tvoří se koagulát. Při těchto teplotách je ale minimální tvorba oxidu uhličitého a etanolu. Jejich produkce se podporuje snížením fermentační teploty na 20 až 15 C a provzdušováním (několikanásobné protřepání), přičemž se dosáhne kyselosti do 16 SH. Pro provozní složitost výroby kefírů při dvou teplotách se mléko kefírovou kulturou v průmyslu fermentuje při jedné kompromisní teplotě 18 až 28