Čisté mlékařské kultury a jejich využití v mlékárenství

Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav technologie potravin Čisté mlékařské kultury a jejich využití v mlékárenství Bakalářská práce Vedoucí práce: Vypracovala: Ing. Táňa Lužová Eva Ptáčková Brno 2011

Prohlášení Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na téma Čisté mlékařské kultury a jejich využití v mlékárenství vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Bakalářská práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího bakalářské práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně. Dne... Podpis autora...

Poděkování Tímto bych chtěla Ing. Táni Lužové za projevenou ochotu, trpělivost a za cenné rady a připomínky, které mi poskytovala v průběhu vytváření bakalářské práce. Dále bych chtěla poděkovat své rodině a přátelům, kteří mi byli oporou.

ABSTRAKT Bakalářská práce je zaměřena na charakterizaci čistých mlékařských kultur a na způsoby jejich využití při výrobě kysaných mléčných výrobků a sýrů. Jsou zde uvedeny požadavky na mléko, dále technologické kroky zpracování mléka, které vedou k zajištění jeho zdravotní nezávadnosti a zlepšení technologických vlastností, jako je tepelné ošetření, homogenizace apod. V další části jsou charakterizovány mikroorganizmy v ČMK. Popsány jsou rovněž parametry na bakteriální zákysové kultury, jejich příprava a vedení, zejména kroky jako inokulace, inkubace. Důraz je kladen na jednotlivé druhy kultur, kde je popisována jejich kultivace, biochemické změny probíhající během fermentace a zmíněny jsou i výrobky, při jejichž výrobě se dané kultury používají. V neposlední řadě se práce zabývá druhy komerčních forem kultur, inhibičními látkami a probiotiky. Klíčová slova: mléko, čisté mlékařské kultury, fermentace, mikroorganismy, fermentované mléčné výrobky ABSTRAKT This bachelor thesis is aimed at characterization of dairy starter cultures and means of their use for fermented milk products and cheese production. Basic milk requirements are listed, as well as technological steps during milk processing like temperature treatment, homogenization etc. These altogether leads to health safety of product with better technological quality. Next part characterizes microorganisms in starter cultures. Parameters and culture technology of bacterial starter (particularly inoculation and incubation) are described. Emphasis is placed on particular culture types, their cultivation and biochemical changes occurring during fermentation. Products whose production process includes the use of given culture are listed. Last but not least this thesis deals with kinds of commercial culture types, inhibitors and probiotics. Key words: milk, dairy starter cultures, fermentation, microorganisms, fermented milk products

Obsah 1 Úvod...8 2 Cíl práce...8 3 Literární přehled...9 3.1 Charakteristika čistých mlékařských kultur...9 3.2 Požadavky na mléko...10 3.3 Úprava mléka...11 3.3.1 Odstřeďování...12 3.3.2 Deaerace...12 3.3.3 Standardizace tuku, sušiny a tukuprosté sušiny...12 3.3.4 Homogenizace...13 3.3.5 Tepelné ošetření mléka...14 3.3.6 Chlazení...15 3.4 Mikrobiální zastoupení v ČMK...15 3.4.1 Tradiční mikroflóra...16 3.4.1.1 Rod Lactococcus...16 3.4.1.2 Rod Leuconostoc...17 3.4.1.3 Rod Pediococcus...17 3.4.1.4 Rod Streptococcus...18 3.4.1.5 Rod Lactobacillus...18 3.4.2 Bakteriální druhy zahrnované mezi mléčné kultury...19 3.4.2.1 Rod Bifidobacterium...19 3.4.2.2 Rod Enterococcus...19 3.4.2.3 Rod Propionibacterium...20 3.4.2.4 Rod Brevibacterium...20 3.4.3 Plísně...20 3.4.3.1 Rod Penicillium...20 3.4.4 Kvasinky...21 3.4.4.1 Rod Kluyveromyces...21 3.5 Požadavky na bakteriální zákysové kultury...21 3.6 Příprava a vedení bakteriálních kultur...22 3.7 Rozdělení ČMK...24 3.7.1 Druhy ČMK...25 3.7.1.1 Smetanová kultura...26 3.7.1.2 Jogurtová kultura...28 3.7.1.3 Acidofilní kultura...31 3.7.1.4 Kefírová kultura...32 3.7.1.5 Sýrařská kultura...33 3.7.1.6 Plísňová kultura...35 3.7.1.7 Propionová kultura...35 3.7.1.8 Mazová kultura...36 3.8 Formy kultur...37 3.9 Inhibiční látky...39 3.10 Probiotika, prebiotika, synbiotika...40 3.10.1 Probiotika...40 3.10.2 Prebiotika...42

3.10.3 Synbiotika...43 4 Závěr...44 5 Přehled použité literatury...46 6 Seznam zkratek...49 Přílohy...50

1 ÚVOD Používání mikroorganismů pro výrobu kysaných mléčných výrobků má velmi dlouhou tradici. Dříve se k zakysávání mléka využívala pouze jeho přirozená mikroflóra, což vedlo k nejistým výsledkům především z hygienického hlediska, jelikož se v mléce často vyskytovaly i patogenní mikroorganismy. Jakost těchto výrobků byla velmi kolísává. Radikální změnu původního primitivního mlékařství přinesly technické objevy, zejména odstřeďování mléka a jeho pasterace, které se staly základem nové etapy mlékařství. Následně došlo k objasnění mikrobiologického složení mléka a podstaty činnosti mikroorganismů, což přispělo k objevu čistých mlékařských kultur. Tím byla odstraněna závislost jakosti mléčných výrobků na více nebo méně příznivém složení přírodní mikroflóry. Používáním čistých mlékařských kultur pak byly vytvořeny předpoklady pro pasteraci mléka, a tím zajištění zdravotní nezávadnosti mléčných výrobků. Podle TEPLÉHO (1984): Čisté mlékařské kultury jsou klíčové výrobní prostředky, kterými se do suroviny (např. mléka), zbavené všech patogenních a pokud možno všech nežádoucích a technologicky škodlivých mikroorganismů, zavádějí vybrané účelově zaměřené druhy specifických mikroorganismů, aby jimi byl vyvolán a zajištěn správný průběh výrobního procesu a dosažena žádoucí jakost hotového výrobku. 2 CÍL PRÁCE Cílem bakalářské práce bylo prostudovat dostupnou literaturu týkající se tématu čistých mlékařských kultur a jejich využití v mlékárenství. Největší pozornost měla být věnována charakteristice a rozdělení ČMK, ale také mléku určenému pro přípravu čistých mlékařských kultur a na výrobu mléčných výrobků, mikrobiálnímu zastoupení a také požadavkům na bakteriální zákysové kultury a přípravu a vedení bakteriálních kultur. 8

3 LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Charakteristika čistých mlékařských kultur Čisté mlékařské kultury jsou vlastně izolované kultury užitečných mikroorganismů (GAJDŮŠEK, 1998). Jsou to přesně určené, nepatogenní a netoxické kultury bakterií mléčného kysání s homofermentativní nebo heterofermentativní produkcí kyseliny mléčné. Ve výrobní praxi se používají čisté mlékařské kultury a směsné kultury (LUKÁŠOVÁ et al., 2001). Po tepelném ošetření syrového mléka jako základní suroviny, které směřuje ke zničení, resp. potlačení činnosti nežádoucích mikroorganismů (TEPLÝ et al., 1984), se čisté mlékařské kultury (specifické bakterie mléčného kysání), používají k inokulaci mléka. Činností jejich metabolismu vznikají charakteristické mléčné produkty (GAJDŮŠEK, 1998). Pojem čisté mlékařské kultury je nutno si vykládat pouze technicky. Nejde totiž o čisté kultury v pravém slova smyslu tohoto pojmu, ani o absolutní druhovou čistotu kultur, ale o jejich pojmové odlišení od dříve používaných přírodních kyšek neznámého mikrobiologického složení (TEPLÝ et al., 1984). Starterové kultury se uplatňují pří výrobě mléčných výrobků, kde podmínkou zdárné výroby je optimální průběh mikrobiologických procesů, tedy zejména u kysaných mléčných výrobků, másla ze zakysané smetany, pomazánkového másla a všech typů přírodních sýrů (GAJDŮŠEK, 1998). Jejich význam spočívá v tom, že svou činností způsobují fyzikálně-chemické změny, které mají vliv na strukturu a konzistenci mléčných výrobků. Další jejich významnou vlastností je tvorba kyseliny mléčné, která má významný podíl na zvýšení kyselosti, a produkce antibiotik, které brání rozvoji škodlivých mikroorganismů, čímž prodlužují trvanlivost mléčných výrobků (KNĚZ et al., 1960). Díky pasteraci a následnému zaočkování požadovanými kulturami je možné vyrobit široký sortiment nezávislý na původní mikroflóře mléka (VAŇURA, 2010). 9

3.2 Požadavky na mléko Na jakost mléka pro výrobu ČMK i fermentovaných mléčných výrobků jsou kladeny nejpřísnější požadavky (GAJDŮŠEK, 1998). Jakost mléka je určena celkovým chemickým složením a jeho fyzikálními, mikrobiálními a hygienickými vlastnostmi. Mléko musí být zdravotně nezávadné, od zdravých a správně krmených dojnic (TEPLÝ et al., 1984). Nejvýznamnějším požadavkem je mikrobiální čistota. Má vliv nejen na trvanlivost, ale také na technologické vlastnosti suroviny (ŠTĚTINA, 2009). Kromě nízkého celkového počtu mezofilních (aerobních i fakultativně anaerobních) mikroorganismů je důležité i druhové zastoupení kontaminujících mikroorganismů. Nežádoucí je především vysoký podíl psychrotrofních mikroorganismů. Pomalu se pomnožují i při teplotách pod 10 C. Pasterací mléka sice dojde k jejich usmrcení, ale produkují termorezistentní proteázy a lipázy (k úplné deaktivaci nedojde ani při sterilačním záhřevu), které mohou způsobovat vady konzistence, chuti a vůně výrobků. Dále produkují volné mastné kyseliny, které mohou inhibovat růst bakterií mléčného kysání (FORMAN et al., 1994; GAJDŮŠEK, 1998; ŠTĚTINA, 2009). Zásadní vliv na složení mléka (obsah tuku, bílkovin a minerálních látek) má výživa dojnic, tedy vyváženost krmné dávky. Na charakteru krmiva se významně podílí sezónní vliv. Mléko snadno přejímá pachové a chuťové látky z krmiva (ŠTĚTINA, 2009). Zcela nevhodné z mikrobiologického i technologického hlediska je mléko od mastitidních dojnic. Je považováno za hygienicky závadné, a nesmí se tudíž používat pro lidskou výživu. Toto mléko obsahuje zvýšený počet somatických buněk (indikátor zdravotního stavu), vysoký počet mikroorganismů, včetně patogenních druhů, zvýšený obsah látek s antimikrobiálním působením, případně antibiotika používaná k léčbě dojnic. Mění se také složení mléka, které obsahuje méně kaseinu a laktózy, více chloridů, sérových bílkovin (především imunoglobulinů) a dalších antibakteriálních látek. Změny složení mléka spolu s výše zmíněnými faktory a abnormálně nízkým ph působí zcela nepříznivě na rozvoj mikroflóry ušlechtilých kultur (FORMAN et al., 1994; ŠTĚTINA, 2009; TEPLÝ et al., 1984). 10

Dalším důležitým kritériem je dobrá kysací aktivita mléka a nepřítomnost reziduí inhibičních látek (antibiotik, insekticidů, detergentů, desinfekčních a mycích prostředků, sulfonamidů), k nimž jsou zákysové kultury v různé míře citlivé (FORMAN et al., 1994; GAJDŮŠEK, 1998; HYLMAR, 1986). Z hlediska chemických parametrů mléka je nejdůležitější vysoký obsah tukuprosté sušiny, která nemá klesnout pod 8,5 %. Vyjadřuje dostatečně vysoký obsah bílkovin nezbytný jako zdroj dusíku pro růst bakterií mléčného kysání (FORMAN et al., 1994; HYLMAR, 1986). Základní požadavky na mléko přijímané ke zpracování: musí pocházet od zdravých dojnic (hodnotí se dle počtu somatických buněk, který by měl být do 400 000 JTK/ml), nesmí obsahovat inhibiční látky, celkový počet mikroorganismů by neměl překročit limit 100 000 JTK/ml, složení mléka musí být neporušené, např. podle obsahu bílkovin a tuku, bodu mrznutí (průkaz zvodnění mléka) a podle titrační kyselosti (6,2 7,8 SH), musí být dodržena teplota uchovávání 4 6 C (zchlazeno musí být mléko do 3 hod od začátku dojení), senzorické znaky jakosti (barva, konzistence a vzhled, chuť a vůně) musí být typické pro mléko bez zjevných změn, cizích příchutí a pachů (ŠTĚTINA, 2009; ŠUSTOVÁ, 2010). 3.3 Úprava mléka Veškeré mléko zpracovávané v mlékárnách musí být tepelně ošetřeno, aby byla zajištěna jeho zdravotní nezávadnost a trvanlivost. Toto ošetření se provádí na pasterační stanici, kde jsou zařazeny i další základní operace zpracování mléka (odstřeďování, standardizace tučnosti a tukuprosté sušiny, homogenizace, pasterace mléka a smetany) (ŠTĚTINA, 2009). 11

Mléko převzaté k mlékárenskému ošetření musí být vytříděno, vyčištěno, tepelně ošetřeno a vychlazeno. 3.3.1 Odstřeďování Prvním krokem při mlékárenském ošetření mléka je jeho čištění (HOLEC et al.,1989). Provádí se filtrací před zpracováním a dále pak při odstřeďování na samoodkalovacích odstředivkách. Rozdělování mléka odstřeďováním je založeno na rozdílu měrných hmotností tuku, mléčné plazmy a nečistot. Při odstřeďování se z plnotučného mléka získá odstředěné mléko (zbytkový obsah tuku asi 0,05 %) a smetana o tučnosti obvykle 40 % (ŠTĚTINA, 2009). Tento proces je spojen se současným čištěním mléka, kdy jsou odstraňovány jemnější mechanické nečistoty, určitý podíl mikroorganismů a buněčných částic ve formě odstředivkového kalu (LUKÁŠOVÁ et al., 2001). 3.3.2 Deaerace Před odstředivku lze zařadit i proces deaerace, který vede k odstranění většiny vzduchu a těkavých pachových látek. Snížení obsahu vzduchu na minimum zmenšuje riziko oxidace tuku ve výrobcích a zlepšuje funkci řady zařízení (ŠTĚTINA, 2009). 3.3.3 Standardizace tuku, sušiny a tukuprosté sušiny U syrového mléka se po vyčištění filtrací nebo na odstředivkách upravuje obsah tuku, sušiny a tukuprosté sušiny podle požadovaného typu výrobku (FORMAN et al., 1994). Při zpracování mléka na výrobu většinu produktů se provádí standardizace tučnosti mléka smícháním části smetany s odstředěným mlékem v požadovaném poměru (ŠTĚTINA, 2009). Pojem fortifikace je užíván pro popis procesu zvyšujícího obsah sušiny směsi za účelem dosažení požadovaných rheologických vlastností výrobku. Při realizaci standardizace/fortifikace lze taktéž přidávat stabilizátory (hydrokoloidy, např. modifikované škroby a rostlinné gumy), které snižují vylučování syrovátky hotových výrobků (FORMAN et al., 1994). Stabilizátory často slouží také jako náhrada části mléčné sušiny, tudíž snižují náklady na výrobu např. lehkých jogurtů (GAJDŮŠEK, 1998). 12

3.3.4 Homogenizace Homogenizace mléka se provádí za účelem ovlivnění rheologických i senzorických vlastností finálního výrobku (GAJDŮŠEK, 1998). Je to mechanická operace, které se používá k roztříštění tukových globulí na jemné disperzní částice o průměru méně než 2 μm, čímž se zabrání vyvstávání a oddělování mléčného tuku z plazmatu (LUKÁŠOVÁ et al., 2001). Homogenizace se dosahuje protlačením mléka vysokým tlakem úzkou štěrbinou homogenizační hlavy. Provádí se obvykle při teplotě 60 70 C (ŠTĚTINA, 2009; ŠUSTOVÁ, 2010). Z jedné tukové globule může vzniknout až 1 000 dalších, což vede ke zvýšení celkového povrchu globulí. Z mléčných bílkovin se vytváří nové obaly, které jsou zapotřebí k tomu, aby se nové kuličky opět nespojovaly (ŠTĚTINA, 2009). Homogenizace se uskutečňuje v jednom nebo ve dvou stupních: jednostupňová homogenizace (jedna hlava), dvoustupňová homogenizace (mléko prochází dvěma homogenizačními hlavami). Při homogenizaci se mění koloidní systém mléka, s čímž souvisí např.: zvýšení viskozity mléka (především při použití jednostupňové homogenizace za podmínek, které podporují tvorbu shluků tukových kuliček), mění se charakter obalů tukových kuliček; nové obaly na jednu stranu snižují riziko oxidace mléčného tuku, na druhou stranu nechrání tuk před účinky lipáz, což má za následek náchylnost mléka k lipolýze. Proto musí ihned následovat tepelné ošetření dostatečné k inaktivaci lipázy, spojením tukových kuliček s kaseinovými micelami se mění vlastnosti mléka při srážení bílkovin (ŠTĚTINA, 2009). snižuje se tepelná stabilita mléka, při výrobě fermentovaných mléčných výrobků a sýrů se rychleji vytváří sraženina, ta má ovšem jemnější texturu (měkčí) a zadržuje více syrovátky (HOLEC et al.,1989). To je pozitivní pro fermentované mléčné 13

výrobky, nikoliv však při výrobě polotvrdých a tvrdých sýrů (ŠTĚTINA, 2009). Homogenizace se většinou uskutečňuje před pasteračním záhřevem mléčné směsi, resp. po jejím předehřátí v regenerační sekci pasteru (FORMAN et al., 1994). Je součástí technologického postupu řady mléčných výrobků, např. kysaných mlék a smetan, jogurtů a jogurtových nápojů, kefírů a některých čerstvých sýrů (ŠTĚTINA, 2009). 3.3.5 Tepelné ošetření mléka Tepelné ošetření mléka patří mezi nejdůležitější technologické postupy zpracování mléka (LUKÁŠOVÁ, 2001). Provádí se za účelem zajištění zdravotní nezávadnosti a zvýšení trvanlivosti mléka, resp. finálního výrobku (ŠTĚTINA, 2009). Pasterací se rozumí záhřev pod 100 C. Cílem pasterace je zničení vegetativních forem patogenních, podmíněně patogenních a toxinogenních mikroorganismů, devitalizace většiny ostatních a deaktivace části enzymů a dále bezpečné usmrcení všech choroboplodných zárodků. Jsou požadovány co nejmenší změny fyzikálních, chemických a biologických vlastností mléka (ŠUSTOVÁ, 2010). Pasterací by se mělo dosáhnout snížení počtu mikroorganismů pod 1 000 JTK/ml a inaktivace mléčné lipázy pod 1 % její původní aktivity (ŠTĚTINA, 2009). Tepelný záhřev má dále inaktivovat přirozené inhibiční látky v mléce (lakteniny, aglutininy atd.), snižovat kyselost mléka a ovlivňovat strukturu syrovátkových bílkovin (denaturací a částečnou termickou degradací) (FORMAN et al., 1994). Denaturované syrovátkové bílkoviny se váží na kaseinové micely, a tím zvyšují vazbu vody a snižují vylučování syrovátky fermentovaných výrobků, zvyšuje se také viskozita vytvořeného gelu (GAJDŮŠEK, 1998). Významné je též umrtvení specifických fágů (LUKÁŠOVÁ, 2001). Dle legislativy musí být pasterizované mléko získáno ošetřením zahrnujícím krátkodobý záhřev na teplotu přinejmenším 71,7 C po dobu 15 s nebo na jakoukoli rovnocennou kombinaci teploty a času za účelem získání rovnocenného účinku ŠUSTOVÁ, 2005). 14

Pasterace mléka se realizuje několika způsoby: dlouhodobá pasterace: 65 C po dobu 30 min; šetrná pasterace: 72 C po dobu 15 s (průkaz negativní reakcí ve fosfatázovém testu a pozitivní reakcí v peroxidázovém testu), pasterační efekt nad 99,9 %; vysoká pasterace: 85 C po dobu 5 s (průkaz negativní reakcí v peroxidázovém testu), pasterační efekt nad 99,99 % (ŠTĚTINA, 2009; ŠUSTOVÁ, 2005). Mléko na výrobu kysaných mléčných výrobků se ošetřuje většinou vysokou pasterací. Provádí se buď kontinuálně při teplotě 90 95 C po dobu 3 5 min nebo diskontinuálně při teplotě 80 85 C s výdrží 15 30 min (GAJDŮŠEK, 1998). Smetana se pasteruje při teplotě 90 95 C s výdrží několik sekund. Důvodem pro vyšší teploty je především inaktivace lipáz a tvorba volných -SH skupin, které působí proti autooxidaci tuku (ŠTĚTINA, 2009; ŠUSTOVÁ, 2005). Dalšími důvody jsou zpravidla vyšší obsah bakterií než v syrovém mléce a nižší vodivost tepla kvůli zvýšenému obsahu tuku, což snižuje pasterační efekt (LUKÁŠOVÁ, 2001). 3.3.6 Chlazení Po tepelném ošetření se mléko vychladí na teplotu vhodnou pro zakysání daného výrobku (GAJDŮŠEK, 1998). 3.4 Mikrobiální zastoupení v ČMK Při výrobě fermentovaných mléčných výrobků a sýrů se využívá řada mikroorganismů (bakterie, kvasinky, plísně nebo jejich kombinace) (ROBINSON, 2002). Rozdělení BMK dle způsobu rozkladu laktózy: homofermentativní hlavním produktem fermentace je kyselina mléčná (více než 90 %), do této skupiny patří např. rody Lactoccocus, Streptococcus, Pediococcus a někteří zástupci rodu Lactobacillus; 15

heterofermentativní vzniká asi 50 % kyseliny mléčné, dále kyselina octová, CO 2 a ethanol. Do této skupiny patří např. rody Leuconostoc, Bifidobacterium a někteří zástupci rodu Lactobacillus (FORMAN et al., 1994; GÖRNER, VALÍK, 2004; ŠILHÁNKOVÁ, 2002). 3.4.1 Tradiční mikroflóra 3.4.1.1 Rod Lactococcus Startovací kultury rodu Lactococcus se skládají z druhů: Lactococcus lactis subsp. cremoris. Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactococcus lactis subsp. lactis biovar diacetylactis. Členové rodu Lactococcus jsou negativní na katalázu, grampozitivní, mikroaerofilní, homofermentativní koky o velikosti 0,5 až 1,0 μm. Tvoří ovoidní buňky izolované v párech nebo řetízcích, ve směru řetízku bývají prodloužené, takže se někdy jeví jako krátké tyčinky (GÖRNER, VALÍK, 2004). Tvoří L(+)-kyselinu mléčnou. Některé kmeny L. lactis produkují antibiotikum nisin, které inhibuje rozvoj řady grampozitivních bakterií (ŠILHÁNKOVÁ, 2002). Lactococcus lactis subsp. lactis je grampozitivní bakterie vejcovitého tvaru o průměru 0,5 až 1 μm. Buňky se tvoří většinou v párech anebo krátkých řetízcích. Patří do serologické skupiny N. Roste při teplotě 10 C, ale neroste při 45 C. Jeho teplotní optimum pro produkci kyseliny mléčné je asi 30 C (TEPLÝ et al., 1984). Neroste v bujonu s 6,5 % NaCl, ale roste při 4 % NaCl. Neroste při ph 9,6, ale projevuje počáteční růst při ph 9,2. Je schopný růst v mléce s obsahem 0,3 % methylenové modři a v bujonu se 40 % žluče. Homofermentativně zkvašuje glukosu, laktózu a maltosu na kyselinu mléčnou. Některé kmeny Lactococcus lactis subsp. lactis mají schopnost fermentovat citrát za přítomnosti fermentovatelného sacharidu (laktóza) za tvorby CO 2, kyseliny octové, mléčné, acetoinu a diacetylu (GÖRNER, VALÍK, 2004). Při tvorbě 16

kyseliny tvoří z argininu amoniak (MULLAN, 2011). Lactococcus lactis subsp. lactis biovar diacetylactis je velmi podobný L. lactis subsp. lactis. Kromě kyseliny mléčné má však schopnost vytvářet také diacetyl (typická vůně másla a smetanových produktů), kyselinu octovou, CO 2, acetoin, a to fermentací citrátu za přítomnosti fermentovatelného sacharidu, např. laktózy (ZADRAŽIL, 2002; GÖRNER, VALÍK, 2004). Řadíme ho mezi producenty flavoru (ROBINSON, 2002). Lactococcus lactis subsp. cremoris má podobné vlastnosti jako L. lactis subsp. lactis. Liší se od něj především tvorbou větších buněk a dlouhých řetízků. Roste při teplotě 10 C i nižších, ale teplota 40 C už růst inhibuje. Optimální teplota růstu je 30 C. Neroste v bujonu se 4 % NaCl, při ph 9,2, v mléce s 0,3 % methylenové modři, ale roste za přítomnosti 40 % žluče. Fermentuje glukosu a laktózu, naproti tomu maltosu a sacharosu zřídka. Z argininu netvoří amoniak. Podobně jako Lactococcus lactis subsp. lactis mají některé jeho kmeny schopnost produkovat z citrátu za přítomnosti fermentovatelného sacharidu kyselinu octovou, mléčnou, CO 2, acetoin a diacetyl (GÖRNER, VALÍK, 2004; TEPLÝ et al., 1984). 3.4.1.2 Rod Leuconostoc V mlékařství jsou z tohoto rodu využívány především: Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum, Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris. Tento rod tvoří heterofermentativní grampozitivní koky seskupené v párech nebo řetízcích. Glukosu fermentují za vzniku D( )-kyseliny mléčné, CO 2 a ethanolu, některé kmeny tvoří místo ethanolu kyselinu octovou. Velká část zástupců tohoto rodu disimiluje citrát za přítomnosti fermentovatelného sacharidu (laktózy) a vzniká acetoin, 2,3-butylenglykol a diacetyl, který má významný aromatvorný charakter. Mají sérologickou skupinu N (GÖRNER, VALÍK, 2004). 3.4.1.3 Rod Pediococcus Jediný zástupce tohoto rodu používaný v mlékařství: 17

Pediococcus acidilactici Patří mezi mikroaerofilní až anaerobní grampozitivní koky izolované v párech nebo v tetrádách. Laktózu fermentuje pomalu, za vzniku pouze DL-laktátu a biacetylu, tedy homofermentativně. Roste při 30 C, je náročný na růstové podmínky, hlavně na aminokyseliny a vitaminy (GÖRNER, VALÍK, 2004; ROBINSON, 2002; ŠILHÁNKOVÁ, 2002). 3.4.1.4 Rod Streptococcus V mlékařství jediný využívaný streptokok: Streptococcus salivarius subsp. thermophilus Je to grampozitivní anaerobní kok roustoucí nejlépe při teplotě 40 45 C, neroste při 15 C. Tvoří ovoidní buňky o velikosti 0,7 0,9 μm seskupené v párech až řetízcích. Homofermentativně přeměňuje laktosu za vzniku L(+)-laktátu, acetaldehydu a diacetylu. Fermentuje také glukózu, mannózu a fruktózu. Některé kmeny produkují exopolysacharidy. Roste v bujonu s obsahem 2,5 % NaCl, ale neroste již při obsahu 4 % NaCl. Neroste v přítomnosti žluče, při ph 9,6 a v mléku s obsahem 0,1 % methylenové modři (GÖRNER, VALÍK, 2004; ROBINSON, 2002). 3.4.1.5 Rod Lactobacillus Tento rod se skládá z grampozitivních, na katalázu negativních tyčinkovitých bakterií (MULLAN, 2011). Dělí se podle způsobu fermentace na 3 skupiny: Druhy I. skupiny, obligátně homofermentativní laktobacily (hexosy fermentují téměř výlučně na kyselinu mléčnou (více než 90 %), pentosy a glukonáty nefermentují). Zástupci: Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus acidophilus. Vlastnosti: jsou to grampozitivní mikroaerofilní tyčinky. Rostou při 45 C, optimální teplota je 30 45 C, nerostou při 15 C. Optimální ph je 5,5 6,2. Druhy II. skupiny, fakultativně homofermentativní laktobacily (hexosy fermentují téměř výlučně na kyselinu mléčnou (více než 90 %); při nedostatku glukosy mohou 18

některé kmeny produkovat kyselinu octovou, mravenčí, ethanol; pentosy fermentují pomocí indukovatelné fosfoketolázy) (GÖRNER, VALÍK, 2004). Zástupci: Lbc. casei, Lbc. paracasei subsp. paracasei, Lbc. paracasei subsp. tolerans, Lbc. rhamnosus, Lbc. plantarum (ROBINSON, 2002). Vlastnosti: mezofilní grampozitivní mikroaerofilní tyčinky, tvoří řetízky. Rostou při 15 C, výjimečně při 45 C, optimum je 28 32 C (GÖRNER, VALÍK, 2004). Druhy III. skupiny, obligátně heterofermentativní laktobacily (hexosy fermentují heterofermentativně na kyselinu mléčnou a kyselinu octovou, ethanol a CO 2 ; pentosy fermentují na kyselinu mléčnou a octovou). Zástupci: Lbc. brevis, Lbc. kefir, Lbc. reuteri. Vlastnosti: grampozitivní tyčinky, někdy i kokoidní buňky. Teplota růstu je optimálně 28 32 C, rostou i při 15 C (GÖRNER, VALÍK, 2004). 3.4.2 Bakteriální druhy zahrnované mezi mléčné kultury Do mléka se někdy přidává (kromě bakterií mléčného kysání) také široké rozpětí mikroorganismů pro speciální použití (ROBINSON, 2002). 3.4.2.1 Rod Bifidobacterium Zástupci tohoto rodu: Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium longum. Jsou to grampozitivní, anaerobní, homofermentativní, nesporolující tyčinky. Jsou negativní na katalázu, rostou jednotlivě, v řetízcích, v palisádovém i v nepravidelném uspořádání. Z dvou molekul glukózy fermentují tři molekuly kyseliny octové a dvě molekuly kyseliny mléčné (ROBINSON, 2002). 3.4.2.2 Rod Enterococcus V mlékárenství našly využití především mikroorganismy: 19

Enterococcus faecium, Enterococcus durans, Enterococcus faecalis. Jsou to anaerobní, grampozitivní, nesporolující koky negativní na katalázu. Tvoří řetízky různé délky. Rostou při 45 C, ph 9,6 a vysoké koncentraci soli (ROBINSON, 2002; MULLAN, 2011). 3.4.2.3 Rod Propionibacterium Nejvýznamnější zástupci jsou: Propionibacterium freudenreichii subsp. freudenreichii, Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii. Kulturu tvoří mírně protáhlé buňky a velikosti 0,5 0,6 μm, sdružené povětšinou v mapovité shluky. Tvoří katalázu. Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii zkvašuje laktózu. Sacharidy zkvašují za vzniku významného množství kyseliny propionové, CO 2, H 2 O a za malého množství kyseliny mravenčí, jantarové a mléčné (GÖRNER, VALÍK, 2002; TEPLÝ et al., 1984). 3.4.2.4 Rod Brevibacterium Brevibacterium linens Je to krátká, striktně aerobní, grampozitivní tyčinka tvořící oranžové kolonie. Hydrolyzuje kasein a její optimální teplota pro růst je 25 25 C (ROBINSON, 2002; TEPLÝ et al., 1984) 3.4.3 Plísně 3.4.3.1 Rod Penicillium Hlavní zástupci rodu: Penicillium camemberti Penicillium album 20

Penicillium caseicolum Penicillium candidum Penicillium roqueforti Penicillium camemberti tvoří vlnité, převážně bílé kolonie velikosti 2 3 cm, Charakteristická je žampionová vůně. Vyznačuje se dobrou lipolytickou aktivitou. Silnou proteolytickou aktivitou rozkládá bílkoviny až na amoniak. Penicillium roqueforti má asymetrické plodnice, na nichž vyrůstají konidie velikosti 4,0 5,0 μm. Optimální ph pro růst je 5,6. Po vytvoření spor má zelenou nebo modrozelenou barvu. Optimální teplota růstu se pohybuje mezi 15 23 C. Tato plíseň není náročná na kyslík, ale vyžaduje přítomnost alespoň 5 % kyslíku (TEPLÝ et al., 1984). 3.4.4 Kvasinky 3.4.4.1 Rod Kluyveromyces Kluyveromyces marxianus var. lactis Je to kvasinka oválného tvaru. Roste dobře v rozmezí ph 5,5 7,5, optimum růstu je při ph 6,5 a teplotě 25 28 C. Roste však i při teplotě 10 C 3.5 Požadavky na bakteriální zákysové kultury U bakteriálních kultur jsou v závislosti na typu výrobku, pro jejichž výrobu se používají, požadovány zvláště tyto aktivity v různé intenzitě: fermentace sacharidů, která vede ke snížení ph (při výrobě všech fermentovaných mléčných výrobků ovlivňují vzniklé kyseliny mléčná a případně další chuť, vůni a konzistenci výrobků působením na kasein 21

a redukují nebo zcela potlačují růst nežádoucích mikroorganismů, nižší ph při výrobě sýrů podněcuje činnost enzymů syřidla), hydrolýza bílkovin a katabolismus aminokyselin, jež ovlivňují zejména konzistenci, chuť a vůni sýrů, produkce plynných a senzoricky významných sloučenin z různých substrátů (citráty, laktóza, bílkoviny, lipidy), syntéza sloučenin, které ovlivňují texturu produktů (exopolysacharidy), produkce antimikrobiálně působících sloučenin (peroxid vodíku, CO 2, biacetyl, organické kyseliny, reuterin, přirozená antibiotika a další), produkce speciálně biologicky aktivních látek, jako jsou peptidy s imunostimulační nebo antihysperzní aktivitou (HYLMAR, 1985; PLOCKOVÁ, 2009 a). 3.6 Příprava a vedení bakteriálních kultur Kysací proces jakéhokoliv fermentovaného mléčného výrobku (kysané mléčné výrobky nebo sýry) závisí zcela na čistotě a aktivitě zákysových kultur s podmínkou, že mléko nebo růstové médium je prosté všech inhibičních látek, jako jsou antibiotika nebo bakteriofágy (fágy) (TAMIME, 2006). Proto je nezbytné dbát na jakost ČMK dodávaných výrobcem kultur, na výběr a ošetření mléka, média pro kultivaci, dodržovat hygienicko-sanitační režim propagační stanice i výroby fermentovaných mléčných výrobků a udržovat odbornou úroveň a pracovní kázeň personálu (FORMAN et al., 1994). Tepelné ošetření média zlepšuje podmínky pro rozvoj mikroorganismů zákysové kultury zvláště: destrukcí bakteriofágů, eliminací některých inhibičních látek, určitým stupněm rozkladu bílkovin, 22

vypuzením rozpuštěného kyslíku, destrukcí živých mikroorganismů. Ošetření mléka pro přípravu matečné kultury ve skleněných lahvích o objemu 100 ml se provádí sterilací v autoklávu. Mléko pro přípravu matečného a mezioperačního zákysu se zahřívá na teplotu 90 95 C v kontejnerech na jejich přípravu s výdrží 30 45 C. Při stejné teplotě a výdrži se ošetřuje mléko pro kultivaci provozního zákysu v tanku pro přípravu provozního zákysu. Následuje ochlazení na teplotu inokulace. Teplota se liší dle typu bakteriální kultury a je třeba ji dodržovat podle doporučení výrobce. Při propagaci vícedruhových kultur je to obzvláště důležité, jelikož už mírná odchylka od teplotního optima může podpřit růst jednoho druhu, a tím pozměnit požadované parametry finálního výrobku. Typická inokulační teplota pro mezofilní kultury je 20 30 C, pro termofilní 42 45 C (PLOCKOVÁ, 2009 a). Inokulace se provádí aseptickým přenosem požadovaného množství bakteriální kultury do kultivačního média. Do lahve pro přípravu matečné kultury se vpraví očkovací dávka pomocí sterilní injekční stříkačky (PLOCKOVÁ, 2009 a). Matečních kultur se vede v laboratoři několik a po vyhodnocení se vybírají nejvhodnější kmeny kultur pro provozní použití. Při vysoké spotřebě se připravuje ještě mateční zákys matečnou kuturou se zaočkuje větší objem mléka (GAJDŮŠEK, 1998). Do kontejneru pro matečný, případně mezioperační zákys a do tanku pro přípravu provozního zákysu se požadovaná dávka inokula dopravuje proudem sterilovaného vzduchu (PLOCKOVÁ, 2009 a). Mléko vytemperované na kultivační teplotu se po inokulaci a promíchání inkubuje po dobu, která závisí na použitém typu bakterií v kultuře a velikosti inokula, tento proces trvá 3 20 hod. Bakterie se nyní rychle množí a fermentují přítomnou laktózu za vzniku kyseliny mléčné. V přítomnosti heterofermentativních a aromatvorných bakterií vznikají i četné další látky. Výše inkubační teploty ovlivňuje poměr přítomných bakteriálnách rodů, tím pádem i produkci některých metabolitů a průběh ph. Je důležité proto teplotu kontrolovat, aby bylo možné při dosažení požadovaného stupně kyselosti ukončit proces fermentace (PLOCKOVÁ, 2009 a). 23

Zralý zákys se vychladí a ve vychlazeném stavu ponechá do dalšího přeočkovaní, u matečného zákysu k provoznímu použití (GAJDŮŠEK, 1998). Bakteriální růst se tím zastaví, a tak je možné zachovat vysoký stupeň aktivity kultury (PLOCKOVÁ, 2009 a). Vhodné je uchovávání za aseptických podmínek (FORMAN et al., 1994). Pro úspěšně vedení kultur je nezbytné, aby byly povrchy výrobního zařízení dokonale zbavené nežádoucích mikroorganismů a prosté všech zbytků detergentů i dezinfekčních látek (PLOCKOVÁ, 2009 a). 3.7 Rozdělení ČMK Bakterie mléčného kysání jsou vybrané definované mikroorganismy, které se používají ve vhodné formě jako očkovací dávka v množství nejméně 10 6 buněk/g s cílem zahájení procesu fermentace, která má zlepšit vzhled, vůni, chuť a trvanlivost, případně zajistit další požadované funkční vlastnosti produktu. Zákysové kultury používané v mlékárenství se rozdělují podle různých kritérií. Podle obsažených skupin mikroorganismů se kultury rozdělují na: bakteriální dále se dělí podle optimální teploty růstu na: mezofilní (20 30 C), termofilní (40 45 C), kvasinkové, plísňové, smíšené (obsahují bakterie i kvasinky). Podle druhové a kmenové skladby se kultury dělí na: jednokmenové (Single Strain Starters) obsahující jeden kmen určitého druhu, vícekmenové (Multiple Strain Starters) obsahující známé kmeny jednoho druhu, 24

směsné vícekmenové (Multiple-Mixed-Strain Starters) obsahující různé definované kmeny různých druhů, tradiční kultury (Traditional Starters or Raw Mixed Strain Starters) obsahující druhy a kmeny částečně nebo zcela neznámé. Podle funkce rozlišujeme kultury: starterové požadována je funkce technologická, tedy schopnost mikroorganismů přeměňovat substráty (sacharidy, bílkoviny, lipidy, ) na metabolity, které ovlivní výslednou chuť, vůni a konzistenci výrobků, protektivní jejich funkce souvisí s produkcí antimikrobiálně aktivních metabolitů, jimiž jsou organické kyseliny, biacetyl, CO 2, peroxid vodíku, bakteriociny, deriváty aminokyselin, které potlačují růst nežádoucích mikroorganismů způsobujících různá onemocnění z potravin, probiotické funkce vyplývá z mnoha aktivit chemické, biochemické a mikrobiální povahy, jejichž výsledkem je pozitivní působení na zdravotní stav člověka. Jedna a tatáž kultura může být však použita pro různé účely za různých podmínek nebo lze pro zajištění optimálních parametrů výrobku použít kombinace více kultur s různými funkcemi (PLOCKOVÁ, 2009 a). 3.7.1 Druhy ČMK Pro výrobu kysaných mléčných výrobků Smetanová kultura Jogurtová Kefírová kultura Acidofilní kultura Mlékařské kultura s obsahem probiotických mikroorganismů 25

Pro výrobu sýrů a tvarohů Smetanová kultura Sýrařská kultura Plísňová kultura Propionová kultura Mazová kultura 3.7.1.1 Smetanová kultura Smetanová kultura je pokládána za základní kulturu. Slouží k výrobě celého sortimentu kysaných mléčných výrobků: kysaných mlék, kysaných smetan, kysaného podmáslí a je také součástí výroby másla ze zakysané smetany, pomazánkového másla, tvarohů a sýrů (samostatně nebo v kombinaci se specifickými kulturami) (GÖRNER, VALÍK, 2004; PLOCKOVÁ, 2009 b; TEPLÝ et al., 1984). Základní kultura je směsná, skládá se z různých diplokoků a streptokoků mléčného kysání mezofilního charakteru (TEPLÝ et al., 1984): Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactococcus lactis subsp. cremoris, Lactococcus lactis subsp. lactis biovar diacetylactis Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum (tj. citrovorum) (GÖRNER, VALÍK, 2004). Kyselinotvorné jsou laktokoky, některé z nich mají schopnost menší tvorby diacetylu. Aromatvorné jsou leukonostoky, Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum tvoří i menší množství kyseliny mléčné. Lactococcus lactis subsp. lactis biovar diacetylactis je oboustranně aktivní, vytváří jak kyselinu mléčnou, tak i aromatické látky. 26

Optimální teplota kultivace laktokoků se pohybuje v rozmezí 28 31 C, u leukonostoků je 20 25 C (TEPLÝ et al., 1984). Podle požadovaného typu výrobku se bakterie různě kombinují (FORMAN et al., 1994). Kombinace se mohou vytvářet pouze z druhů a kmenů, které se dobře snášejí a podle možností se mají v růstu a metabolismu doplňovat. V žádném případě nesmí docházet k antagonismu. Nejprve se rozmnožují laktokoky, které slabě proteolyzují kasein a uvolněnými aminokyselinami stimulují růst leukonostoků, čímž se zajišťuje tvorba aroma v kultuře. Účelem kombinace druhů a kmenů je získat stabilní kulturu a tím dosáhnout co nejpříznivějších vlastností vyráběných produktů (GÖRNER, VALÍK, 2004; ŽIŽKOVÁ, 2008). Kultivace se provádí ve vysoce pasterovaném mléce, po homogenizaci zaočkuje 1 % smetanové kultury a kultivuje se při teplotě 21 23 C po dobu 16 20 hod (GAJDŮŠEK, 1998). Po ukončení kultivace je nutné kulturu zchladit a do použití uchovat při teplotě asi 5 C. Po dokončení zrání kultury se nesmí oddělovat viditelní množství syrovátky. Doporučená teplota kultivace působí příznivě na udržení optimálního vzájemného poměru kyselinotvorných a aromatvorných bakterií. Také snižuje možnost ztrát vyprodukovaného diacetylu. Šestnáctihodinová kultivace zaručuje maximální rozvoj mikroflóry, optimální zvýšení obsahu kyseliny mléčné a zachování poměru jednotlivých druhů mikroflóry. (TEPLÝ et al., 1984). Charakteristika kultury: čistě mléčně kyselá a aromatická chuť i vůně, homogenní sraženina jemné husté konzistence, film na stěně nádoby stálý po dobu 1 min, titrační kyselost 36 42 SH, mikroskopický obraz hustá mikroflóra diplokoků a streptokoků v poměru 4:1 až 1:1. Uvedené výsledky dává i kultura stará 6 dnů uchovávaná při chladničkových 27

teplotách (FORMAN et al., 1994; ŠUSTOVÁ, 2005). Smetanová kultura se často kombinuje s jinými kulturami, např. s acidofilní (Lactobacillus acidophilus), bifidogenní (Bifidobacterium bifidum) nebo pediokokovou (Pediococcus acidilactici). Na výrobu čerstvých aromatických produktů jako je kysané podmáslí, kysané mléko, kysaná smetana čerstvé sýry, u kterých není podmínkou stálost aroma, se používají kyselinotvorné kmeny (Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactococcus lactis subsp. cremoris) i významné aromatvorné (Lactococcus lactis subsp. lactis biovar diacetylactis). Tyto kultury jsou vhodné i na výrobu sýrů a mírnou tvorbou ok v těstě (sýry holandského typu) (GÖRNER, VALÍK, 2004). Některé kmeny Lactococcus lactis subsp. lactis produkují antibiotikum nisin. Této vlastnosti se využívá při výrobě holandských sýrů a Blaťáckého zlata. Tato kultura potlačuje klostridia způsobující máselné kvašení a zlepšuje konzistenci sýrů (ŽIŽKOVÁ, 2008). Na výrobu másla ze zakysané smetany, na konzumní zakysané smetany a na výrobu tvarohů a čerstvých sýrů, které se nebalí do vzduchotěsných obalů, jsou vhodné kultury obsahující sortiment kyselinotvorných i aromatvorných laktokoků a leukonostoků. Přináší dobré okyselení a bohaté aroma. Lactococcus lactis subsp. lactis biovar diacetylactis se vyznačuje rychlou tvorbou diacetylu, naproti tomu Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris pomalejší, proto je aroma vyrobených produktů trvanlivější. Mezofilní zákysové kultury jsou významné zejména pro tvorbu kyselin, aromatických látek a CO 2 (GÖRNER, VALÍK, 2004). 3.7.1.2 Jogurtová kultura Tato směsná kultura termofilního charakteru se používá především k výrobě různých typů jogurtů a jogurtových mlék (GÖRNER, VALÍK, 2004). Jogurtové výrobky patří celosvětově k nejrozšířenějším a sortiment těchto výrobků a různou konzistencí a přídavnými látkami je velice rozšířený (FORMAN et al., 1994). 28

Jogurtová kultura se skládá z mikroorganismů: Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Streptococcus salivarius subsp. Thermophilus. Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus je homofermentativní tyčinka, která produkuje karbonylové sloučeniny (acetaldehyd, aceton, diacetyl, acetoin), které se podílí na tvorbě aroma. Vykazuje mírně proteolytickou a lipolytickou činnost (FORMAN et al., 1994). Streptococcus salivarius subsp. thermophilus je homofermentativní streptokok (GAJDŮŠEK, 1998). Tyto mikroorganismy mají symbiotický vztah a spolu se vyznačují rychlou tvorbou kyseliny mléčné. Významnou vlastností jogurtové kultury je tvorba množství nosné aromatické složky jogurtů acetaldehydu (GÖRNER, VALÍK, 2004). Jogurtová kultura se pěstuje v pasterovaném mléce. Je možno ji pěstovat i v mléce zahuštěném odpařováním nebo přídavkem sušeného mléka. Mléko vytemperované na kultivační teplotu se zaočkuje 1 % kultury. Optimální kultivační teplota se pohybuje v rozmezí 42 45 C a doba kultivace je 3 3,5 hod. Jakmile je zpozorováno uvolnění nepatrného množství syrovátky, kultura se rychle bez třepání zchladí (FORMAN, 1994; TEPLÝ et al., 1984). Charakteristika kultury: čistě aromatická kyselá jogurtová chuť i vůně, hustá homogenní sraženina, hruběji vysrážená než smetanová kultura, film na stěně nádoby tvoří praménky, titrační kyselost 40 50 SH, mikroskopický obraz hustá mikroflóra tyčinek a streptokoků v poměru 1:2 až 2:1, dnes až 1:10. Kultura stará 3 dny uchovávaná při chladničkových teplotách dává stejné výsledky (ŠUSTOVÁ, 2005). 29

Na počátku zrání produkuje Streptococcus salivarius subsp. thermophilus růstové látky (např. kyselinu mravenčí), které stimulují růst laktobacilů. Naopak Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus svou proteolytickou aktivitou uvolňuje v mléce aminokyseliny a umožňuje tak pokračování růstu streptokoků po spotřebování důležitých aminokyselin v mléce. Tato symbióza také příznivě ovlivňuje tvorbu aroma, jehož hlavní složkou je acetaldehyd (ŽIŽKOVÁ, 2008). Poměrové zastoupení obou mikroorganismů závisí na době a teplotě kultivace a na velikosti inokula. Při zvýšení teploty a doby inkubace a vyšší dávce inokula se ve fermentovaném mléce zvyšuje podíl laktobacilů, titrační kyselost a aromatičnost. Avšak roste i podíl fyziologicky méně výhodného D( ) izomeru kyseliny mléčné. Naproti tomu při snížení teploty a prodloužení doby inkubace roste podíl streptokoků a dochází k pomalejšímu prokysávání a menší tvorbě aromatických látek, což má za následek slabší typickou chuť a vůni. Dle těchto poznatků se upravují podmínky fermentace a složení kultur pro dosažení požadovaného výrobku. V současné době se fermentace obvykle vede tak, aby výrobek obsahoval v převaze streptokoky, byl méně kyselý a obsahoval vyšší podíl L(+) izomeru mléčné kyseliny (GAJDŮŠEK, 1998; PLOCKOVÁ, 2009 b). Pro zlepšení funkčních vlastností jogurtů bývá někdy klasické složení jogurtové kultury doplněno o druhy zvyšující odolnost vůči inhibičním látkám (Pediococcus acidilactici) nebo o druhy zvyšující dieteticko-léčebné účinky (Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium bifidum) (FORMAN et al., 1994). Metody fermentace: metoda termostatová (jogurty s nerozmíchaným koagulátem ve spotřebitelském obalu set yoghurts), obvykle 3 3,5 hod při teplotě 42 45 C, inokulum 1 2 %; metoda tanková (jogurty s rozmíchaným koagulátem stirred yoghurts), obvykle 16 18 hod při teplotě 30 C, inokulum 0,05 1 % (FORMAN et al., 1994). 30

3.7.1.3 Acidofilní kultura Vzhledem k organoleptickým vlastnostem (ostře kyselá chuť) se tato kultura používá většinou v kombinaci s dalšími kulturami, především k výrobě acidofilního mléka a Biokysu (FORMAN et al., 1994). Acidofilní kultura je tvořena homofermentativní tyčinkou Lactobacillus acidophilus. Tento mikroorganismus vytváří velké množství kyseliny mléčné, jež má prvořadý význam při srážení kaseinu, a produkuje inhibiční látky tlumící růst škodlivé mikroflóry. Projevuje mírnou lipolytickou a proteolytickou aktivitu. Řadíme jej mezi probiotické mikroorganismy (TEPLÝ et al., 1984; ŽIŽKOVÁ, 2008). Vysoce pasterovaná homogenizovaná směs se zaočkuje 1 % inokula a kultivuje se 15 hod při teplotě 37 C (FORMAN et al., 1994). Charakteristika kultury: ostře, ale čistě kyselá chuť a vůně, hustá homogenní sraženina, film na stěně potrhaný, titrační kyselost 60 70, ale i 90 SH, mikroskopický obraz hustá mikroflóra krátkých a středně dlouhých tyčinek. Uvedené výsledky dává i kultura stará 6 dnů uchovávaná při chladničkových teplotách (TEPLÝ et al., 1984; ŠUSTOVÁ, 2005). V současnosti se tato monokultura při výrobě zakysaných mléčných výrobků samostatně nepoužívá. Výsledným produktem je hrubá sraženina, která má sklon k oddělování syrovátky. Ostře kyselá a nearomatická chuť výrobku není spotřebiteli pozitivně přijímána. Proto byla zavedena výroba acidofilního mléka, kde se vedle kmenů acidofilní kultury, jež zajišťujících dieteticko-léčebné funkce, vyskytují i kmeny smetanové kultury, které zajišťují příznivé organoleptické vlastnosti finálního produktu. Acidofilní mléko se získává metodou oddělené fermentace acidofilní a smetanové kultury. Po skončení fermentace v oddělených fermentačních nádobách se obě sraženiny 31

smíchají v poměru 1:9 (1 díl acidofilní a 9 dílů smetanové kultury), homogenizují, vychladí a teprve potom plní do spotřebitelských obalů (FORMAN et al., 1994; ŽIŽKOVÁ, 2008). Dále se acidofilní kultura může využívat k výrobě kysaných nápojů, případně i tvarohů, tvarohových krémů, acidofilního podmáslí atd. Používá se také k zakysání delaktózovaných nebo i sojových mlék, kde svou výraznou chutí a vůní překrývá některé organoleptické odlišnosti těchto mlék od kravského mléka (GAJDŮŠEK, 1998). 3.7.1.4 Kefírová kultura Tato směsná kultura, tvořená bakteriemi i kvasinkami, se využívá převážně k výrobě kumysu, kefíru a kefírového mléka. Kultura se získává přímo z kefírových zrn nebo je sestavena uměle z čistých mlékařských kultur bakteriálních a kvasinkových. Přesné složení není konstantní (FORMAN et al., 1994). V kultuře se mohou vyskytovat: laktokoky (např. Lactococcus lactis subsp. lactis), laktobacily (např. Lbc. delbrueckii, Lbc. acidophilus, Lbc. Brevis, Lbc. casei), leukonostoky, laktózu fermentující kvasinky rodů Kluyveromyces, Candida a Torulopsis, laktózu nefermentující kvasinky rodů Pichia a Saccharomyces (GAJDŮŠEK, 1998; PLOCKOVÁ, 2009 b; TEPLÝ et al. 1984). Kulturu lze obohatit o další kmeny ČMK ke zlepšení chuti nebo dieteticko-léčebných účinků kefíru a kefírového mléka. Mikroorganismy se musí zvolit tak, aby spolu rostly v symbióze (ŠUSTOVÁ, 2005; TEPLÝ et al. 1984). Homogenizované vysoce pasterované mléko zaočkované 5 10 % kultury se kultivuje při 15 20 C po dobu 48 hod. Po té se protřepe a zchladí (ŠUSTOVÁ, 2005). Charakteristika kultury: chuť a vůně štiplavá po kyselině mléčné a uhličité se slabou kvasničnou příchutí, 32

hustší konzistence, titrační kyselost 45 55 SH, značný obsah CO 2, takže objem oproti původnímu mléku je i třetinu větší, mikroskopický preparát hustá mikroflóra koků, tyčinek, kvasinek v poměru 7:2:1. Tyto výsledky dává i kultura uchovávaná 3 dny při chladničkových teplotách (ŠUSTOVÁ, 2005). U kefíru se uplatňuje homofermentativní i heterofermentativní mléčné i ethanolové kvašení. Typické aroma je výsledkem rovnováhy mezi kyselinou mléčnou, biacetylem, ethanolem, acetaldehydem a acetonem. Šumivý charakter je dán produkcí CO 2 (PLOCKOVÁ, 2009 b). Poměr mléčného a ethanolového kvašení je dán charakterem a kultury (kefírová zrna, uměle sestavená kultura) a podmínkami kultivace. Vyšší teplota kultivace podporuje bakterie, nižší teplota a provzdušňování media podporují činnost kvasinek. Na délce kultivace je závislá hloubka i rozsah proteolýzy a lipolýzy (FORMAN et al., 1994). 3.7.1.5 Sýrařská kultura Základní kulturou pro výrobu prakticky všech druhů sýrů a tvarohů je mezofilní, tj. smetanová kultura (bakteriální složení viz 3.7.1.1 Smetanová kultura), která je podle typu sýra doplněna o další kultury (TEPLÝ et al., 1984). Mlékařské kultury se uplatňují již před sýřením při tzv. předezrání, kdy se pasterované standardizované mléko inokuluje ochrannou dávkou mezofilní kultury; zpravidla se stejná kultura používá i pro vlastní výrobu. Mléko po pasteraci se ochladí na 5 12 C a zaočkuje se přídavkem 0,01 0,05 % mezofilní kultury, důkladně se promíchá a nechává se zrát do druhého dne. Předezráním se obnoví fyzikálně chemické a mikrobiologické vlastnosti mléka po tepelném ošetření a skladování a zlepší se také jeho syřitelnost (ČURDA, 2009). 33

Vlastní přídavek kultur pro výrobu následuje po ohřátí skladovaného mléka na teplotu sýření, což je většinou 30 33 C. Mezofilní kultura se dávkuje 30 45 min před sýřením v množství 0,5 2 %. Důležité je důkladné rozmíchání inokula. Doba inokulace závisí na bakterálním složení kultury. Účelem použití zákysových kultur při výrobě tvarohů a sýrů je úprava kyselosti mléka před sýřením, fermentace laktózy a tvorba kyseliny mléčné během koagulace a zpracování sraženiny. Snížení ph má i jistý konzervační účinek a brání rozvoji nežádoucích mikroorganismů, podílí se na koagulaci. Významné je i uplatnění proteolytické a lipolytické aktivity v průběhu zrání, což má vliv na vytváření senzorických vlastností i na texturu a konzistenci (ČURDA, 2009; FORMAN, 1994). Mezofilní zákysové kultury se vyznačují především tvorbou kyselin, aromatických látek a CO 2, jejich proteolytická aktivita je v porovnání s termofilními kulturami minimální. V sýrech s nízkodohřívanou sýřeninou vyráběných pomocí mezofilních zákysů (holandský typ sýrů) je požadována tvorba ok. Ta jsou vytvořena oxidem uhličitým, který produkují rozkladem citrátu aromatvorné zákysové bakterie. Nosná aromatická látka mezofilních zákysů je diketon diacetyl (CH 3 CO CO CH 3 ), který vzniká v mléce z kyseliny citronové. Specifické kmeny Lactococcus lactis subsp. cremoris a Lactococcus lactis subsp. lactis se nazývají O-kultury. Netvoří CO 2. Vyznačují se dobrou odolností vůči fágům. Využití nachází při výrobě sýrů čedarového typu, sýrů v solném nálevu (feta, balkánský sýr) a dalších sýrů s uzavřeným těstem. LD-kultury obsahují specifické kmeny Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris, Lactococcus lactis subsp. lactis biovar diacetylactis, Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactococcus lactis subsp. cremoris. Tyto kultury se vyznačují vysokou odolností vůči fágům. Typická je pro ně tvorba CO 2 a diacetylu. Využívají se při výrobě másla ze zakysané smetany, tvrdých a polotvrdých sýrů a sýrů s tvorbou ok v těstě (GÖRNER, VALÍK, 2004). 34

3.7.1.6 Plísňová kultura Tato kultura se používá pro zrání plísňových sýrů. Vznikající produkty dodávají sýrům charakteristické senzorické vlastnosti (GÖRNER, VALÍK, 2004). Kultura zahrnuje zejména kmeny druhů: Penicillium camemberti a Penicillium caseicolum, Penicillium roqueforti. Pro výrobu sýrů je třeba vybírat jen kmeny, které neprodukují toxiny. Plísňové kultury se obvykle pěstují na povrchu polotuhých a tuhých substrátů a dodávají se do mlékáren v komerční formě suspenzí nebo lyofilizovaných prášků (PLOCKOVÁ, 2009 a). Kultivace obou kultur probíhá při pokojové teplotě (15 23 C) po dobu 5 až 8 dnů, u druhu Penicillium roqueforti na syrovátkovém agaru a po ukončení kultivace musí mít homogenní porost zelené nebo modrozelené barvy, obvykle se inokuluje přímo do mléka pro výrobu sýrů. Penicillium camemberti se pěstuje na žemlových kostkách ovlhčených mlékem, musí vykazovat sněhobílý nebo lehce nažloutlý vatovitý povlak a jeho inokulace probíhá buď přímo do mléka pro výrobu sýra nebo je kultura rozstřikována na sýry (GÖRNER, VALÍK, 2004; TEPLÝ et al., 1984). Penicillium roqueforti, tzv. modrá plíseň, se používá pro výrobu sýrů se plísní v těstě (Gorgonzola, Niva). Penicillium camemberti Thom, tzv. bílá plíseň, se používá pro výrobu sýrů s plísní na povrchu (Camembert, Hermelín). Oba druhy se vyznačují výraznou lipolytickou a proteolytickou aktivitou. Rozkládají mléčný tuk za vzniku methylketonů a volných mastných kyselin, čímž vzniká typická výrazná chuť a vůně těchto sýrů. Pro sýry s plísní na povrchu je typické žampionové aroma (PLOCKOVÁ, 2009 a). 3.7.1.7 Propionová kultura Tato kultura se řadí mezi tzv. sekundární (přídavné) kultury, které se používají pro zvýšení organoleptické kvality sýrů. 35