MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta Ústav experimentální biologie Oddělení mikrobiologie Antibiotická rezistence a distribuce genů rezistence u izolátů Escherichia coli a koliformních bakterií z potravního řetězce člověka (Diplomová práce magisterského studijního programu Biologie oboru Obecná biologie směr Mikrobiologie) Monika Dolejská Brno 2006
OBSAH 1. Úvod... 4 1.1 Escherichia coli 5 1.1.1 Charakteristika a význam... 5 1.1.2 Patogenita 5 1.1.3 Shiga toxin produkující E. coli... 6 1.1.3.1 Faktory virulence.. 6 1.1.3.2 Hemolyticko-uremický syndrom.. 7 1.1.3.3 Zdroj nákazy. 7 1.1.3.4 Epidemiologie... 8 1.1.3.5 Diagnostika a léčba... 8 1.2 Antimikrobiální látky u potravinových zvířat.... 9 1.2.1 Antimikrobiální látky jako prevence a kontrola infekce. 9 1.2.2 Antimikrobiální látky jako růstové stimulátory.... 10 1.2.2.1 Historie a současnost. Povolené a zakázané růstové stimulátory 10 1.2.3 Antimikrobiální látky ve veterinární medicíně v ČR... 11 1.3 Rezistence bakterií k antimikrobiálním látkám....12 1.3.1 Výskyt antibiotické rezistence u izolátů E. coli... 12 1.3.2 Mechanizmy a genetické determinanty rezistence E. coli a koliformních bakterií k vybraným antimikrobiálním látkám. 13 1.3.2.1 Rezistence k β-laktamovým antibiotikům... 14 1.3.2.2 Rezistence k aminoglykosidům... 16 1.3.2.3 Rezistence k sulfonamidům a trimetoprimu 17 1.3.2.4 Rezistence k tetracyklinům. 19 1.3.2.5 Rezistence k chloramfenikolu. 20 1.3.3 Integrony... 21 1.4 Metody průkazu antibiotické rezistence..22 1.4.1 Fenotypové metody.. 23 1.4.1.1 Speciální metody pro detekci rezistence k β-laktamovým antibiotikům 23 1.4.2 Genotypové metody.. 24 2. Cíl práce.....26 1
3. Materiál a metody...27 3.1 Použité mikroorganizmy 27 3.2 Chemikálie... 28 3.3 Kultivační média a roztoky 29 3.4 Identifikační soupravy a antiséra. 30 3.5 Antibiotické disky... 30 3.6 Přístroje.. 30 3.7 Pomůcky.. 31 3.8 Metody. 31 3.8.1 Uchovávání bakteriálních kultur. 31 3.8.2 Očkování bakteriálních kultur ze zamražení... 31 3.8.3 Průkaz rezistence bakteriálních izolátů diskovou difuzní metodou 32 3.8.4 Identifikace vybraných bakteriálních izolátů testem API 10S...35 3.8.5 Typizace O-antigenů E. coli...36 3.8.5.2 Typizace antigenu O157 u E. coli latexovou aglutinací..36 3.8.5.2 Typizace O-antigenů E. coli typově specifickými O-antiséry.37 3.8.6 Průkaz širokospektré β-laktamázy..38 3.8.6.1 Vyhledávací ( screeningový ) test..38 3.8.6.2 Double-disk synergy test..39 3.8.7 Průkaz inducibilní β-laktamázy..40 3.8.8 Izolace bakteriální DNA rezistentních izolátů...41 3.8.9 Polymerázová řetězová reakce se specifickými primery...41 3.8.9.1 Příprava PCR reakční směsi....41 3.8.9.2 Provedení PCR....44 3.8.10 Detekce PCR produktu agarózovou gelovou elektroforézou..44 4. Výsledky....46 4.1 Vyhodnocení antibiotické rezistence 4 skupin izolátů 46 4.2 Výběr rezistentních izolátů pro další testování...48 4.3 Identifikace vybraných bakteriálních izolátů testem API 10S...49 4.4 Typizace O-antigenů E. coli humánního původu. 49 4.4.1 Typizace antigenu O157 latexovou aglutinací 49 4.4.2 Typizace O-antigenů E. coli typově specifickými O-antiséry 50 4.5 Průkaz širokospektré β-laktamázy... 50 4.5.1 Vyhledávací ( screeningový ) test 51 4.5.2 Výsledky double-disk synergy testu.. 51 4.6 Průkaz inducibilní β-laktamázy... 53 2
4.7 Průkaz genů antibiotické rezistence metodou PCR... 55 4.7.1 Průkaz genů rezistence k β-laktamovým antibiotikům 55 4.7.2 Průkaz genů rezistence k tetracyklinu.. 57 4.7.3 Průkaz genů rezistence ke streptomycinu. 59 4.7.4 Průkaz genů rezistence k sulfonamidům.. 61 4.7.5 Průkaz genů rezistence k chloramfenikolu... 63 4.7.6 Průkaz genu int1 a integronu třídy 1..... 65 4.7.7 Průkaz genových kazet integronu. 65 4.8 Průkaz genů antibiotické rezistence a integronu u multirezistentních izolátů E. coli O157:H7 izolovaných v Jordánsku. 68 5. Diskuze. 69 5.1 Antibiotická rezistence vyšetřovaných izolátů a její vztak ke spotřebě antimikrobiálních látek v ČR... 69 5.2 Vyhodnocení antibiotické rezistence jednotlivých skupin izolátů a její srovnání s jinými studiemi 71 5.3 Průkaz determinant antibiotické rezistence... 72 5.3.1 Průkaz širokospektré β-laktamázy 72 5.3.2 Průkaz inducibilní β-laktamázy 73 5.3.3 Výskyt genů rezistence k β-laktamovým antibiotikům 74 5.3.4 Výskyt genů rezistence k tetracyklinu.. 75 5.3.5 Výskyt genů rezistence ke streptomycinu 76 5.3.6 Výskyt genů rezistence k sulfonamidům.. 76 5.3.7 Výskyt genů rezistence k chloramfenikolu.. 77 5.3.8 Průkaz genu int1, genových kazet a integronu... 78 5.4 Multirezistentní izoláty E. coli O157:H7 z Jordánska.. 80 6. Závěr.... 81 7. Literatura 83 Přílohy...94 3
1. ÚVOD Antibiotika, přirozené látky produkované převážně mikroorganizmy potlačující růst jiných organizmů, se v určité formě užívaly již ve starém Egyptě, ale jejich skutečný rozvoj nastal až s Flemingovým objevem penicilinu v roce 1929. V souvislosti s jejich používáním se dokonce uvažovalo o vymizení bakteriálních onemocnění jako zdravotnického problému. Tomu odpovídalo i jejich použití, téměř neomezované a určitě nadbytečné. V roce 1940 byl popsán první enzym schopný destrukce penicilinu u izolátu Escherichia coli. Tento objev byl prvním svědectvím o existenci bakteriální rezistence k účinku antibiotika. V následujících desetiletích problematika antibiotické rezistence nabyla celosvětového významu a přístup k antibiotikům musel být přehodnocen. Byly vypracovány zásady racionální antimikrobiální terapie, omezeno profylaktické užívání antibiotik a používání těchto látek jako růstových stimulátorů. Přesto je v současné době celosvětově pozorován zvyšující se výskyt rezistentních bakterií k antimikrobiálním přípravkům, který následně představuje vážný problém při terapii infekčních onemocnění i v epidemiologické praxi. Kromě racionální aplikace antimikrobiálních látek je možné problém stále rostoucí antibiotické rezistence řešit především sledováním výskytu a rozšíření rezistentních bakterií v různých ekologických nikách, studiem mechanizmů rezistence a rovněž genetických determinant podmiňujících tuto rezistenci včetně možnosti jejich přenosu na dosud citlivé bakterie. Nejprve se hlavní zájem soustředil na patogenní mikroorganizmy. V současnosti se výzkum zaměřuje především na studium přenosu a šíření genů antibiotické rezistence mezi nepatogenními bakteriemi běžné střevní flóry zvířat a člověka hlavně prostřednictvím přímého kontaktu nebo nepřímo potravou a vylučovanými odpadními produkty kontaminujícími prostředí, s nimiž se člověk i zvířata dostávají do styku. Právě střevní trakt je považován za jeden z nejdůležitějších rezervoárů rezistentních bakterií a genetických determinant rezistence. Prevalence a hladina antibiotické rezistence u indikátorových bakterií ve střevním traktu člověka i zvířat, jakou je i Escherichia coli a jiné koliformní bakterie, mohou sloužit jako vhodné ukazatele selekčního tlaku vzniklého v důsledku používání antimikrobiálních látek. 4
1.1 Escherichia coli 1.1.1 Charakteristika a význam Escherichia coli je fakultativně anaerobní gramnegativní nesporulující tyčka náležící do čeledi Enterobacteriaceae. Je běžnou součástí střevní flóry zdravých lidí i zvířat. E. coli je komenzálem, saprofytem a také symbiontem, neboť svým působením znemožňuje průnik patogenů produkcí kolicinů, které jsou pro některé jiné bakterie toxické. Zároveň je pro makroorganizmus prospěšná i přímo podílí se na tvorbě některých vitaminů, především vitaminu K (Tancrede, 1992; Votava a kol., 2003). Komenzální E. coli jsou indikátory fekálního znečištění vody a potravin (Bednář a kol., 1999). 1.1.2 Patogenita E. coli patří mezi podmíněně patogenní mikroorganizmy. Ve střevě se patogenní účinek uplatňuje jen tehdy, když je tato bakterie vybavena specifickými faktory virulence. Mimo střevo je E. coli téměř vždy patogenní. E. coli patogenní pro člověka zahrnují kromě dalších čtyři hlavní skupiny (Bednář a kol., 1999; Lhotová, 2001; Votava a kol., 2003): Enteropatogenní E. coli (EPEC) jsou spojovány s onemocněním novorozenců získané především v nemocničním prostředí. Nejběžnější jsou antigenní typy O55, O126 a O86. Enteroinvazivní E. coli (EIEC) disponují faktory invazivity a vyvolávají onemocnění připomínající bacilární dyzenterii. Enterotoxigenní E. coli (ETEC) vyvolávají průjmy v oblasti tropů a subtropů s nízkým hygienickým standardem. Onemocnění vyvolaná tímto typem se označují jako tzv. cestovatelské průjmy. Shiga toxin produkující E. coli (STEC, také VTEC, EHEC) způsobují nejzávažnější onemocnění. Vyvolávají hemoragickou kolitidu a hemolyticko- -uremický syndrom (HUS). Nejčastější jsou antigenní typy O157 a mezi EPEC dříve řazený antigenní typ O26 (Kaper a O Brien, 1998). 5
1.1.3 Shiga toxin produkující E. coli Dříve byly tyto vysoce patogenní typy E. coli označovány jako verotoxigenní (VTEC) (Votava a kol., 2003). Název verotoxigenní pochází z jejich schopnosti produkovat jeden nebo oba ze dvou exotoxinů (verotoxiny VT1 a VT2), které vyvolávají cytopatický efekt na buňkách Vero (Konowalchuk a kol., 1977). Dnes je však propagován název Shiga toxin produkující E. coli (STEC), neboť struktura toxinu je velmi podobná Shiga toxinu Shigella dysenteriae (Kaper a O Brien, 1998). Pojem enterohemoragické E. coli (EHEC) souvisí s jejich schopností vyvolávat hemoragický zánět střeva v důsledku produkce hemolyzinu (Votava a kol., 2003). Shiga toxin produkující E. coli byly poprvé identifikovány jako lidské patogeny schopné vyvolávat onemocnění potravinového původu v roce 1982; onemocnění bylo způsobeno konzumací nedostatečně tepelně upraveného hovězího masa (Kaper a O Brien, 1998). Infekce potravinového původu vyvolané STEC O157 jsou závažným zdravotnickým problémem v Severní Americe a Velké Británii (Griffin a Tauxe, 1991). Naproti tomu infekce tohoto typu se ve střední Evropě vyskytují velmi řídce, kde první případ HUS vyvolaného STEC byl poprvé zaznamenán až v roce 1988 v Německu (Stewart a kol., 1997). 1.1.3.1 Faktory virulence Hlavním faktorem virulence STEC je produkce Shiga toxinů, které zahrnují dva toxiny Stx1 a Stx2. Toxin Stx1 je vysoce homologický (99 %) s Shiga toxinem, který produkuje Shigella dysenteriae typu 1. Naproti tomu Stx2 se od Shiga toxinu Shigella dysenteriae typu 1 výrazně liší. Geny pro produkci obou toxinů jsou lokalizovány na chromozomu (Leung a kol., 2003; Mainil, 1999). Patogenní účinek Shiga toxinů spočívá v jejich schopnosti spojovat se specifickým receptorem glykolipidové povahy (Gb3), který se nachází na povrchu endotelových buněk krevních kapilár, endotelových buněk ledvin a červených krvinek. Toxin následně inhibuje proteosyntézu, což má za následek buněčnou smrt (Lingwood a kol., 1987). V genomu STEC se nachází také specifický chromozomální gen eae. Tento gen je lokalizován uvnitř tzv. patogenního ostrůvku LEE ( locus of enterocyte effacement ). Gen eae řídí činnost intiminu, což je bílkovina s funkcí adhezinu a napomáhá tak připojení patogenních STEC a EPEC k buňkám střevního epitelu (Mainil, 1999). 6
Geny kódující další faktory virulence jsou lokalizovány na plazmidech; jedná se o geny pro produkci enterohemolyzinu (gen ehx), bifunkční katalázy-peroxidázy (gen katp), serin proteázy (geny espp a pssa) a gen etp podílející se na řízení sekrečního systému typu 2 (Mainil, 1999). 1.1.3.2 Hemolyticko-uremický syndrom Hemolyticko-uremický syndrom (HUS) byl poprvé popsán ve Švýcarsku v roce 1955 (Gasser a kol., 1955); jedná se o závažné onemocnění, při kterém dochází k akutnímu renálnímu selhání, ke vzniku trombocytopénie a mikroangiopatické hemolytické anémie (Lhotová a Sevčíková, 2000). Bylo prokázáno, že HUS může být vyvolán různými faktory jako například léky, chemikáliemi a toxiny některých mikroorganizmů (S. dysenteriae typu 1, Salmonella typhi, Campylobacter jejuni, STEC) (Kaper a O Brien, 1998). HUS jako následek infekce STEC je častou příčinou akutního selhání ledvin u dětí nejmladší věkové kategorie (do 5 let), ale setkáváme se s ním i u dětí starších, kde může vyústit v chronické postižení ledvin. Tento fakt je dán vyšší vnímavostí dětí k Shiga toxinu, neboť buňky ledvin mají vysoký obsah receptoru pro Shiga toxin (Lhotová a Sevčíková, 2000). 1.1.3.3 Zdroj nákazy Shiga toxin produkující E. coli vstupují do potravinového řetězce člověka nejrůznějšími způsoby. Nejčastějším zdrojem nákazy je nedostatečně tepelně upravené hovězí maso, ale také nepasterizované mléko, jogurt, brambory, čerstvý jablečný džus a jiné potraviny. Byla prokázána možnost přenosu z člověka na člověka a rovněž infekce kontaminovanou vodou (Kaper a O Brien, 1998). Ve srovnání s infekcemi vyvolanými salmonelami, kde je nutná infekční dávka 10 5 až 10 8 bakterií (Votava a kol., 2003), je riziko infekce STEC podobně jako u shigelózy vysoké i v důsledku velmi nízké infekční dávky, která je menší než 100 bakterií (Kaper a O Brien, 1998). Střevní trakt přežvýkavců je považován za hlavní rezervoár STEC patogenních pro člověka. Ke kontaminaci potravin dochází nejčastěji během porážky dobytka, kdy střevní bakterie mohou kontaminovat maso, které je následně určené ke konzumaci člověkem. Pokud 7
při kuchyňské úpravě takto kontaminované potravy není dodržen dostatečný čas a teplota, může se stát zdrojem nákazy konzumenta (Borczyk a kol., 1987). 1.1.3.4 Epidemiologie Shiga toxin produkující E. coli jsou vážným problémem Severní Ameriky, Japonska, jižní Afriky, Austrálie a některých oblastí v Evropě (především Německa a skandinávských zemí) (Kaper a O Brien, 1998). Z epidemiologického hlediska je zajímavá skutečnost, že konzumace nedostatečně tepelně upravených hamburgerů a jiných hovězích produktů je hlavním zdrojem nákazy STEC především v Severní Americe a Velké Británii. Navíc v těchto zemích je naprostá většina infekcí vyvolána sérotypem O157:H7 (Griffin a Tauxe, 1991). V Evropě jsou zdrojem nákazy výhradně mléčné výrobky a kontaminované prostředí a sérotyp O157:H7 reprezentuje pouze malé procento STEC izolovaných ze střevního traktu dobytka. Naopak infekce vyvolané sérotypy O26, O103, O111, O113 a O128 jsou zde mnohem častější (Kaper a O Brien, 1998). 1.1.3.5 Diagnostika a léčba Mezi důležité vlastnosti STEC O157, které se využívají při diagnostice, patří jejich neschopnost fermentovat sorbitol a produkovat β-d-glukuronidázu. K záchytu STEC se využívá MacConkeyho agar, ve kterém je laktóza nahrazena sorbitolem (Votava a kol., 2003). Tato metoda záchytu však může selhat, neboť byly v Evropě izolovány i sérotypy O157:H7, které sorbitol fermentují (Bitzan a kol., 1991; Gunzer a kol., 1992). Problémem zůstává záchyt jiných sérotypů, kde se vlastnost neokyselování sorbitolu nedá využít. V diagnostice se používá sérotypizace pomocí sklíčkové či latexové aglutinace. K podrobnějšímu studiu se využívá molekulárně-biologických metod DNA sondy, PCR se specifickými primery, stanovení plazmidového profilu; dále je možné použít metody imunologické detekci monoklonálních protilátek a ELISA testy (Kaper a O Brien, 1998). U nejmladších dětí, kde je průběh onemocnění prudký, se perorálně podávají aminoglykosidy. Role antibiotik při léčbě onemocnění vyvolané STEC není jasná. In vitro bylo prokázáno, že po aplikaci antibiotik je produkce toxinu zvýšená. Při léčbě se proto 8
pozornost zaměřuje především na rehydrataci organizmu (Cimolai a kol., 1990; Walterspiel a kol., 1992). 1.2 Antimikrobiální látky u potravinových zvířat Na rozdíl od humánní medicíny jsou antibiotika u potravinových zvířat používána ze dvou různých důvodů k prevenci a kontrole bakteriálních infekcí a dále jako růstové stimulátory (Schwarz a Chaslus-Dancla, 2001). Aplikace antibiotik u potravinových zvířat se v posledních letech stala předmětem mnoha diskuzí. Obavy ze stále rostoucí rezistence bakteriálních patogenů k antibiotikům běžně užívaným k terapeutickým účelům v humánní medicíně a možnost přenosu rezistentních bakterií z potravinových produktů ke člověku vedly k celosvětové změně v oblasti užití antibiotik v chovech potravinových zvířat (Aerestrup a Wegner, 1999; Englen a kol., 2005; McEwen a Fedorka-Cray, 2002). Důležitým aspektem, který je specifický pro veterinární medicínu je problém zbytkového množství antibiotika. Evropská legislativa stanovuje tzv. maximální hladiny reziduí (MRL - maximum residue level ), což je maximální přijatelné množství antibiotika v živočišném produktu určenému ke konzumaci člověkem, které nemá vliv na lidské zdraví (Schwarz a Chaslus-Dancla, 2001). 1.2.1 Antimikrobiální látky jako prevence a kontrola infekce Počátky antibiotické terapie u zvířat se datují do 40. letech minulého století, kdy se penicilinové preparáty začaly používat ve formě intramamárních infuzí k léčbě mastitid u skotu (Prescott a kol., 2000). Obecně mohou být antimikrobiální látky u potravinových zvířat používány k terapeutickým, metafylaktickým a profylaktickým účelům. Účelem terapie je léčit zjevnou infekci. Naproti tomu metafylaxí se rozumí podávání antibiotika velké skupině zvířat nejčastěji prostřednictvím pitné vody nebo krmiva. Infekce je v tomto případě prokázána pouze u omezeného počtu zvířat, ale antibiotika jsou podávána všem zvířatům v chovu z důvodu zabránění přenosu infekce na zdravé jedince (Schwarz a kol., 2001). Profylaktická aplikace antibiotik znamená podávání antimikrobiální látky určitým jedincům popřípadě skupině zvířat za zvláštních okolností (při chirurgickém zákroku, vakcinaci) nebo v určitém stádiu jejich života, ve kterém jsou náchylnější k různým infekcím (při odstavování 9
selat, na konci laktace u skotu určeného k produkci mléka léčba mastitid v zaprahlosti) (Schwarz a Chaslus-Dancla, 2001). 1.2.2 Antimikrobiální látky jako růstové stimulátory Jako růstové stimulátory mohou být použity pouze zákonem schválené látky. Přesné podmínky jejich použití zahrnující cílovou skupinu zvířat, dobu užití a dávkování jsou jasně definovány zákonem. Hlavní podmínkou je, aby žádný z povolených antimikrobiálních růstových stimulátorů nezpůsoboval zkříženou rezistenci s molekulami antibiotik podávanými v humánním lékařství (Schwarz a Chaslus-Dancla, 2001). Přesný mechanizmus účinku růstových stimulátorů není znám, ale pravděpodobně se na něm podílí nárůst vitaminové produkce intestinálních mikroorganizmů, eliminace subpopulací patogenních bakterií a nárůst střevní absorpce živin (Butaye a kol., 2003). 1.2.2.1 Historie a současnost. Povolené a zakázané růstové stimulátory Antibiotika jako přípravky podporující růst zdravého dobytka a drůbeže jsou používány již 60 let (Prescott a kol., 2000). Prvními popsanými antibiotiky s tímto účinkem byly streptomycin a chlortetracyklin (Moore a kol., 1946; Stokstad a kol., 1949). První diskuze ohledně užití antibiotických růstových stimulátorů z důvodů zaznamenání nárůstu antibiotické rezistence bakteriálních patogenů začaly v 60. letech. Od roku 1975 je v Evropě zakázána aplikace β-laktamových antibiotik a tetracyklinů jako stimulátorů růstu (Schwarz a Chaslus-Dancla, 2001). V letech 1998 až 1999 bylo v Evropě k těmto účelům rovněž zakázáno použití glykopeptidu avoparcinu, u kterého byla prokázána zkřížená rezistence s vankomycinem používaným v humánní medicíně, dále tylosinu, spiramicinu, virginiamycinu a Zn-bacitracinu (Teale, 2002). Mezi růstové stimulátory, jejichž použití bylo do konce minulého roku v zemích EU povoleno, patřily flavofosfolipid, monensin, salinomycin a avilamycin (Butaye a kol., 2003; Prescott a kol., 2000). Nové nařízení Rady EU 1831/2003 zakazuje v zemích EU od 1. 1. 2006 použití antibiotických růstových stimulátorů u potravinových zvířat. 10
1.2.3 Antimikrobiální látky ve veterinární medicíně v ČR Použití antibiotik ve veterinární medicíně v České republice upravuje Vyhláška 325/2003 Sb., která je v souladu se směrnicemi Evropského parlamentu a Rady. Stanovuje pravidla pro použití veterinárních přípravků při poskytování veterinární péče a nařizuje veterinárním lékařům i chovatelům vést záznamy o použití léčivých přípravků. Na základě informací zpracovaných Ústavem pro státní kontrolu veterinárních biopreparátů a léčiv v Brně (Hera a kol., 2005) jsou v České republice tetracykliny nejčastěji aplikovanými antibiotiky při terapii zvířat. Další významný podíl z celkové spotřeby antimikrobiálních látek tvoří β-laktamová a diterpenová antibiotika a dále sulfonamidy včetně sulfonamidů potencovaných. Souborný přehled spotřeby jednotlivých skupin antimikrobiálních látek v České republice za rok 2004 uvádí Tabulka 1. Tabulka 1: Spotřeba antimikrobiálních látek ve veterinární medicíně v ČR v roce 2004 antimikrobiální látka spotřeba antimikrobiální látky (v kg) a % spotřeby antimikrobiální látky z celku tetracyklinová antibiotika 31039 41,9 β-laktamová antibiotika 20634 27,9 diterpenová antibiotika 8542 11,5 sulfonamidy 5267 7,1 potencované sulfonamidy 3377 4,6 makrolidová antibiotika 1853 2,5 aminoglykosidy 1463 2 chinolony 1145 1,5 ostatní (amfenikoly, linkosamidy, polypeptidová a jiná antibiotika) 704 1 Celkem 74024 100 a zaokrouhleno na celá čísla 11
1.3 Rezistence bakterií k antimikrobiálním látkám Zavedení antibiotik k léčbě bakteriálních infekcí v humánní a veterinární medicíně bylo brzy následováno popsáním bakterií rezistentních k příslušné antimikrobiální substanci. Relativně krátké časové rozpětí mezi zavedením antibiotika a popsáním prvních rezistentních bakterií k dané látce je důkazem rychlé a efektivní schopnosti bakterií přizpůsobit se změněným podmínkám vnějšího prostředí v důsledku nadměrného užívání antibiotik (Schwarz a Chaslus-Dancla, 2001). Kromě selekce rezistentních bakterií v přítomnosti antibiotika hraje nezanedbatelnou roli v rychlém šíření antibiotické rezistence i horizontální přenos genů podmiňujících rezistenci k dané substanci mezi bakteriemi stejného i různého druhu nebo rodu. Tyto geny antibiotické rezistence jsou obvykle součástí mobilních genetických elementů plazmidů, transpozonů a integronů, které umožňují jejich efektivní šíření (Carattoli, 2001). Antibiotická rezistence se stala jedním z hlavních problémů v terapii člověka. Snížení spotřeby antibiotik v humánní a veterinární medicíně, omezení aplikace růstových stimulátorů u potravinových zvířat a zavádění nových antimikrobiálních látek schopných odolat nejrůznějším mechanizmům bakteriální rezistence jsou jedny z možností řešení tohoto problému (Livermore, 2005; Teale, 2002). 1.3.1 Výskyt antibiotické rezistence u izolátů E. coli V posledních letech je zaznamenán vysoký nárůst rezistence bakteriálních komensálů i patogenů člověka a zvířat (White a kol., 2002). Frekvence výskytu rezistentních izolátů se v jednotlivých zemích liší. Výskyt rezistentních bakterií souvisí s použitím antimikrobiálních látek u člověka nebo zvířete, ze kterého byl rezistentní izolát získán, neboť bylo prokázáno, že aplikace určitého antibiotika vede k selekci bakterií rezistentních k této antimikrobiální látce (Schwarz a Chaslus-Dancla, 2001). Bylo prokázáno, že antibiotická rezistence izolátů E. coli získaných z prasat a drůbeže je mnohem vyšší než rezistence izolátů ze skotu a souvisí s nadměrnou aplikací antibiotik v chovech prasat a drůbeže (Guerra a kol., 2003; Lanz a kol., 2003; Sáenz a kol., 2001). Podle mnoha studií jsou sulfonamidy, streptomycin, tetracyklin a ampicilin antimikrobiální látky, ke kterým je vysoké procento patogenních i nepatogenních izolátů E. coli získaných ze zvířat, potravin a člověka rezistentní (Aerestrup a kol., 1999; Gassama a kol., 2004; Guerra a kol., 2003; Kijima-Tanaka a kol., 12
2003; Lanz a kol., 2003; Meng a kol., 1998; Mora a kol., 2005; Nijsten a kol., 1996; Schroeder a kol., 2002; Zhao a kol., 2001). Vysoký výskyt rezistentních nepatogenních bakterií je dokumentován u mléčného a masného skotu. DeFrancesco a kol. (2004) prokázali rezistenci k tetracyklinu u 33 %, k sulfonamidům u 20 %, ampicilinu a streptomycinu u 16 % izolátů E. coli získaných z dojnic. Obdobné výsledky publikovali i Lanz a kol. (2003), podle kterých je rezistence k ampicilinu, streptomycinu, sulfonamidům a tetracyklinu nejčastější a vyskytuje se u 20 22 % izolátů E. coli pocházejících ze skotu. Sáenz a kol. (2001) zaznamenali vysoký výskyt nepatogenních izolátů E. coli rezistentních k ampicilinu, kyselině nalidixové a tetracyklinu získaných z potravin (přibližně u 50 % izolátů). U nepatogenních izolátů E. coli z vepřového masa byla zaznamenána i poměrně vysoká rezistence k sulfonamidům (Hammerum a kol., 2006). Patogenní bakterie E. coli O157 byla dlouho považována za citlivou k mnoha antimikrobiálním látkám. Na počátku 80. let se rezistence vyskytovala pouze u 1 3 % izolátů těchto bakterií (Bopp a kol., 1987; Ratman a kol., 1988), ale od konce 80. let je dokumentován nárůst antibiotické rezistence (Kim a kol., 1994). Současné studie dokazují vysokou prevalenci rezistence a výskyt multirezistence u E. coli O157 izolovaných ze zvířat, potravin i lidí (Mora a kol., 2005; Sáenz a kol., 2001; Schroeder a kol., 2002; You a kol., 2006; Zhao a kol., 2001), které jsou způsobené častou aplikací antibiotik u potravinových zvířat, především skotu (Tollefson a kol. 1999), který je hlavním rezervoárem E. coli O157 (Kaper a O Brien, 1998). Antibiotická rezistence se vyskytuje u 7 70 % izolátů E. coli O157 získaných ze skotu (Wilkerson a kol., 2004; You a kol., 2006). U izolátů STEC O157 byl oproti jiným sérotypům STEC prokázán nižší výskyt antibiotické rezistence (Mora a kol., 2005; Zhao a kol., 2001). Zajímavým je rovněž nižší výskyt rezistence u izolátů STEC ve srovnání s patogenními E. coli bez produkce Shiga toxinu (Bettelheim a kol., 2003; Schroeder a kol., 2002). 1.3.2 Mechanizmy a genetické determinanty rezistence E. coli a koliformních bakterií k vybraným antimikrobiálním látkám Rezistence E. coli a koliformních bakterií může být způsobena nejrůznějšími mechanizmy, které přehledně shrnuje Tabulka 2. 13
Tabulka 2: Mechanizmy rezistence E. coli a koliformních bakterií k vybraným antimikrobiálním látkám rezistence k antimikrobiální látce mechanizmus rezistence a β-laktamová antibiotika tetracykliny sulfonamidy trimetoprim aminoglykosidy chloramfenikol nadprodukce PBP snížená propustnost antibiotika (nízká exprese porinu OmpF) multidrug transportéry produkce β-laktamáz eflux proteiny multidrug transportéry snížená propustnost antibiotika mutace genů kódujících DPHS produkce DPHS s nízkou afinitou nadprodukce DHFR produkce DHFR s nízkou afinitou snížená vazba antibiotika na podjednotku 30 S ribozomu snížený průnik antibiotika bakteriální stěnou snížená permeabilita cytoplazmatické membrány eflux proteiny AcrD produkce enzymů modifikujících aminoglykosidy enzymatická inaktivace acetyltransferázami eflux proteiny a PBP = proteiny vázající penicilin, DPHS = dihydrofolátsyntetáza, DHFR = dihydrofolátreduktáza 1.3.2.1 Rezistence k β-laktamovým antibiotikům β-laktamová antibiotika patří mezi nejpoužívanější antimikrobiální látky. Obsahují β-laktamový kruh, čtyřčlennou strukturu skládající se ze tří atomů uhlíku a jednoho atomu dusíku. Mají schopnost usmrtit mikroorganizmy blokováním syntézy buněčné stěny vazbou na transpeptidázy a karboxypeptidázy, které se účastní tvorby peptidoglykanu (Walsh, 2003). Rezistence E. coli a koliformních bakterií k β-laktamovým antibiotikům může být způsobena následujícími mechanizmy: 14
1. nadprodukcí proteinů vázajících penicilin (PBP) (Ferrari a Turnidge, 2003) 2. sníženou propustností antibiotika v důsledku nedostatečné exprese porinu OmpF (Schwarz a Chaslus-Dancla, 2001) 3. aktivním vypuzováním antibiotika prostřednictvím multidrug transportérů (Putman a kol., 2000) 4. produkcí β-laktamáz nejčastější mechanizmus rezistence gramnegativních bakterií (Schwarz a Chaslus-Dancla, 2001) Rezistence zprostředkovaná β-laktamázami β-laktamázy jsou skupina enzymů s určitými podobnostmi ve struktuře. Jejich účinek spočívá v interakci s β-laktamovým antibiotikem a jeho následné hydrolýze (Ferrari a Turnidge, 2003). První β-laktamáza TEM-1 byla popsána v roce 1965 u izolátu E. coli, brzy po zahájení užívání penicilinu v klinické praxi (Datta a Kontomichalou, 1965). V současné době rozlišujeme více než 340 typů různých β-laktamáz produkovaných gramnegativními a grampozitivními bakteriemi (Finch a kol., 2003). Geny kódující β-laktamázy se nachází na chromozomu bakterií nebo na přenosných genetických elementech (Mascaretti, 2003). β-laktamázy mohou být produkovány konstitutivně či induktivně. Při konstitutivní produkci vytváří bakterie tyto enzymy nezávisle na přítomnosti či nepřítomnosti antibiotika uvnitř nebo vně buňky. Inducibilní β-laktamázy AmpC jsou produkovány pouze v případě, že se v okolí nebo uvnitř bakteriální buňky nachází β-laktamové antibiotikum. Produkce inducibilních β-laktamáz je častým mechanizmem rezistence k cefalosporinům vyšších generací u rodů Enterobacter, Citrobacter, Serratia a Proteus (Livermore, 1995; Qin a kol., 2004). β-laktamázy typu TEM Nejrozšířenějšími β-laktamázami E. coli rezistentních k ampicilinu jsou β- -laktamázy typu TEM (Guerra a kol., 2003; Sáenz a kol., 2004). Jeho nejfrekventovanější varianta TEM-1 je kódována genem bla TEM-1 lokalizovaným na transpozonu Tn3 (Briñas a kol., 2002). Umístění genu bla TEM-1 na mobilních genetických elementech umožňuje jeho snadné šíření mezi bakteriemi (Bradford, 2001; Briñas a kol., 2002; Livermore, 1995). 15
Širokospektré β-laktamázy Širokospektré β-laktamázy jsou schopné rozkládat cefalosporiny 3. generace, aztreonam a další β-laktamová antibiotika (kromě karbapenemů) s různou intenzitou, která závisí na typu produkovaného enzymu. Zkráceně se označují ESBL ( extended-spectrum betalactamase ) a v současné době je jim věnována velká pozornost, neboť komplikují léčbu bakteriálních infekcí. Rozlišujeme více než 150 druhů ESBL, což není číslo rozhodně konečné, neboť selekční tlak a nadměrné užívání nových β-laktamových antibiotik má za následek vznik nových variant (Bradford, 2001). 1.3.2.2 Rezistence k aminoglykosidům Aminoglykosidy jsou baktericidní antibiotika inhibující syntézu proteinů na úrovni bakteriálních ribozomů. Chemicky se jedná o cyklický aminoalkohol spojený glykosidickou vazbou se dvěma aminocukry (Ferrari a Turnidge, 2003). Rezistence E. coli a koliformních bakterií k aminoglykosidům může být způsobena následujícími mechanizmy (Kolář a kol., 2002; Schwarz a Chaslus-Dancla, 2001): 1. změnou ribozomové bílkoviny, kterou se snižuje vazba aminoglykosidu na 30S podjednotku ribozomu 2. sníženým průnikem antibiotika bakteriální stěnou nebo sníženou permeabilitou metabolicky aktivní cytoplazmatické membrány 3. eflux proteiny AcrD popsanými u E. coli (Rosenberg a kol., 2000) 4. produkcí enzymů modifikujících aminoglykosidy Enzymy modifukující aminoglykosidy Produkce enzymů modifikujících aminoglykosidy je nejdůležitějším mechanizmem rezistence gramnegativních bakterií k těmto antibiotikům. Geny kódující tyto enzymy mohou být mezi bakteriemi přenášeny transpozony a plazmidy (Schwarz a Chaslus-Dancla, 2001) a mohou tvořit součást integronů (Recchia a Hall, 1995). Enzymy modifikující aminoglykosidy se dělí do tří skupin podle typu reakce, kterou katalyzují, na fosfotransferázy (APH), adenyltrasferázy (ANT) a acetyltransferázy (AAC) (Mascaretti, 2003). 16
Acetyltransferázy acylují aminoskupiny antibiotika pomocí kofaktoru acetyl-coa jako donoru acetátové skupiny a jsou kódovány geny aac lokalizovanými na plazmidech, transpozonech nebo uvnitř integronu. V současnosti rozlišujeme přinejmenším 16 různých variant acetyltransferáz, které se liší spektrem účinku (Schwarz a Chaslus-Dancla, 2001). Fosfotransferázy využívají ATP jako donor fosfátové skupiny, fosforylují hydroxylové skupiny aminoglykosidů a jsou kódovány geny aph; dosud bylo popsáno 11 odlišných variant tohoto genu (Schwarz a Chaslus-Dancla, 2001). Fosfotransferázy kódované geny aph(3 )-Ib (rovněž s označením stra) a aph(6)-id (strb) jsou frekventovanými enzymy u E. coli rezistentních ke streptomycinu. Geny stra a strb tvoří genový pár (stra-strb), jsou součástí malých plazmidů skupiny RSF1010 a vyskytují se nezávisle na integronu (Guerra a kol., 2003; Lanz a kol., 2003; Madsen a kol., 2000; Sørum a Sunde, 2001). Adenyltransferázy adenylují hydroxylovou skupinu aminoglykosidů, využívají ATP jako donor adenylové skupiny a jsou kódovány geny ant (Schwarz a Chaslus-Dancla, 2001). Rozšířenou genovou kazetou integronu odpovědnou za rezistenci ke streptomycinu a spektinomycinu je kazeta ant(3 )-I (rovněž s označením aada) (Guerra a kol., 2003). 1.3.2.3 Rezistence k sulfonamidům a trimetoprimu Sulfonamidy a trimetoprim blokují různé enzymatické kroky syntézy kyseliny tetrahydrolistové. Sulfonamidy jsou strukturní analogy kyseliny p-aminobenzoové a způsobují kompetitivní inhibici dihydrofolátsyntetázy (DPHS), zatímco trimetoprim inhibuje dihydrofolátreduktázu (DHFR). Sulfonamidy byly do klinické praxe zavedeny v roce 1932 (Schwarz a kol., 2001). Tyto levné antimikrobiální látky byly široce užívány v humánní i veterinární medicíně, což v posledních desetiletích vedlo k rapidnímu nárůstu rezistence mezi nejrůznějšími druhy bakterií. Použití sulfonamidů je dnes omezeno a jsou často používány v kombinaci, převážně s trimetoprimem (Infante a kol., 2005). Rezistence E. coli a koliformních bakterií k sulfonamidům může být způsobena strukturními změnami enzymů DPHS v důsledku mutace genu dphs (folp) lokalizovaného na chromozomu nebo produkcí DPHS rezistentních k sulfonamidům, které jsou kódovány geny sul lokalizovanými na plazmidech (Mascaretti, 2003). Rezistence E. coli a koliformních bakterií k trimetoprimu je podmíněna produkcí DHFR kódovaných geny, které se nachází na plazmidech. Doprovodným mechanizmem 17
rezistence je rovněž nadprodukce běžně se v buňce vyskytujících chromozomálně kódovaných DHFR v důsledku změny v oblasti promotoru (Mascaretti, 2003). Rezistence podmíněná přítomností genů sul Geny sul, determinanty rezistence k sulfonamidům, byly popsány v 60. letech minulého století jako geny kódující enzymy DPHS se sníženou afinitou k sulfonamidům (Nakaya a kol., 1960). Rozlišujeme 3 typy těchto genů; nejfrekventovanějšími jsou geny sul1 a sul2 a nově popsaný gen sul3 se vyskytuje pouze ojediněle (Grape a kol., 2003; Infante a kol., 2005; Perreten a Berlin, 2003). Hlavním důvodem šíření determinant rezistence k těmto antimikrobiálním látkám je jejich přitomnost na R plazmidech. Intenzivní užívání sulfonamidů po jejich uvedení do veterinární a humánní medicíny pravděpodobně stimulovalo rozvoj R plazmidů obsahujících tyto geny rezistence (Rådström a kol., 1991). Gen sul1 je lokalizován v 3 -konzervativní oblasti integronů třídy 1, které jsou součástí velkých konjugativních plazmidů a transpozonů skupiny Tn21. S šířením integronů třídy 1 v bakteriální populaci se tedy automaticky šíří i gen sul1 (Infante a kol., 2005). Gen sul2 byl popsán u gramnegativních bakterií z velmi odlišných ekologických nik (Enne a kol., 2001; Guerra a kol., 2003; Hochhut a kol., 2001). Nachází se na malém konjugativním plazmidu pgc05 a nekonjugativních plazmidech pbp1 a RSF1010. Právě poslední dva zmíněné plazmidy pbp1 a RSF1010 nesou také geny odpovědné za rezistenci ke streptomycinu. Z tohoto důvodu bývá rezistence k těmto dvěma typům antimikrobiálních látek úzce spjata (Huovinen a kol., 1995; Rådström a kol., 1991). Gen sul3 byl poprvé popsán u E. coli izolovaných na farmách s chovem prasat ve Švýcarsku v roce 2003 (Perreten a Berlin, 2003). Rezistence zprostředkovaná plazmidovými geny dhfr Nejčastější příčinou rezistence E. coli a koliformních bakterií k trimetoprimu je produkce DHFR kódovaných plazmidovými geny dhfr se sníženou afinitu k trimetoprimu. Bylo popsáno přes 20 různých variant genů dhfr (Mascaretti, 2003), přičemž u izolátů E. coli se v nejvyšší frekvenci vyskytuje gen dhfr1, a to ve formě genové kazety integronu (Sáenz a kol., 2004; Skurnik a kol., 2005). 18
1.3.2.4 Rezistence k tetracyklinům Tetracykliny jsou širokospektrá antibiotika s bakteriostatickým účinkem, která inhibují proteosyntézu bakteriální buňky tím, že brání vazbě aminoacyl-trna na ribozom. Jsou to relativně levná a bezpečná antibiotika se širokým spektrem účinku. Díky svým výhodným vlastnostem byly tetracykliny široce využívané po celém světě k profylaxi a terapii bakteriálních infekcí v humánní i veterinární medicíně a dále jako růstové stimulátory zvířat. V posledních dvaceti letech se z důvodu nárůstu rezistentních bakterií použití těchto antibiotik výrazně omezilo (Roberts, 1996). I přesto patří tetracykliny mezi nejčastěji používaná antibiotika (Schwarz a Chaslus-Dancla, 2001). Rezistence E. coli a koliformních bakterií k těmto antibiotikům může být způsobena přítomností eflux proteinů, sníženou propustností antibiotika nebo multidrug transportéry (Roberts, 1996). Eflux proteiny Eflux proteiny odpovědné za rezistenci k tetracyklinům se nachází v cytoplazmatické membráně a vylučují tetracykliny do vnějšího prostředí buňky, čímž je snižována intracelulární koncentrace antibiotika a chráněny ribozomy. Exprese genů tet pro eflux proteiny probíhá induktivně v přítomnosti tetracyklinu. Geny tet jsou lokalizovány na konjugativních plazmidech nebo jiných přenosných genetických elementech, což je vysvětlením jejich širokého rozšíření mezi bakteriemi. Eflux proteiny gramnegativních bakterií zahrnují TetA, TetB, TetC, TetD, TetE, TetG, TetH a TetI (Roberts, 1996). U izolátů E. coli se je rezistence k tetracyklinu způsobena především přítomností proteinů TetA a TetB (Guerra a kol., 2003; Lanz a kol., 2003; Sáenz a kol., 2004; Wilkerson a kol., 2004). Snížená propustnost cytoplazmatické membrány a multidrug transportéry Rezistence k tetracyklinu jako důsledek snížené propustnosti antibiotika byla popsána u E. coli a je způsobena nízkou produkcí porinu OmpF, který přenáší tetracykliny skrze cytoplazmatickou membránu do buňky. Dalším příkladem je mutace v oblasti operonu mar, který se podílí na expresi genů pro porin OmpF (Schwarz and Chaslus-Dancla, 2001). 19
Multidrug transportéry podmiňují rezistenci různých gramnegativních bakterií k tetracyklinům i k řadě strukturně vzdálených sloučenin (například k β-laktamovým antibiotikům). U E. coli byl popsán transportér EmrE (Putman a kol., 2000). 1.3.2.5 Rezistence k chloramfenikolu Chloramfenikol je širokospektré antibiotikum inhibující proteosyntézu vazbou na podjednotku 50S bakteriálního ribozomu, jejíž aplikace kvůli vedlejším hematotoxickým účinkům v posledních letech upadá (Ferrari a Turnidge, 2003). Použití chloramfenikolu u potravinových zvířat bylo v roce 1994 v Evropě zakázáno (Arcangioli a kol., 1999). Rezistence E. coli a koliformních bakterií k chloramfenikolu může být způsobena enzymatickou inaktivací antibiotika účinkem acetyltransferáz nebo aktivním vypuzováním antibiotika prostřednictvím eflux proteinů (Ferrari a Turnidge, 2003; Mascaretti, 2003). Enzymatická inaktivace chloramfenikolu Nejběžnějším mechanizmem rezistence k chloramfenikolu u gramnegativních i grampozitivních bakterií je produkce enzymů acetylfransferáz (Cat), které jsou kódovány geny cat lokalizovanými na plazmidech (Arcangioli a kol., 1999; Schwarz a kol., 2001). Acetyltransferázy využívají acetyl-coa jako donor acetylové skupiny a jsou schopné acetylovat hydroxylové skupiny vázané na uhlíku molekuly chloramfenikolu v pozici 1 a 3. Acetylovaný derivát chloramfenikolu není schopný se navázat na 50S podjednotku ribozomu a inhibovat tak syntézu bakteriálních proteinů (Ferrari a Turnidge, 2003; Mascaretti, 2003). Eflux proteiny První gen s označením cmla odpovědný za aktivní vypuzování chloramfenikolu popsali Bissonnette a kol. (1991). Dalším genem kódujícím eflux protein je gen flor, který byl detekován u izolátů E. coli a Salmonella spp. Na rozdíl od eflux systému kódovaného genem cmla je tento systém specifický pro chloramfenikol i florfenikol (Ferrari a Turnidge, 2003). Oba zmíněné geny mohou být součástí genových kazet integronu (Schwarz a Chaslus- -Dancla, 2001). 20
1.3.3 Integrony Charakteristika integronů a jejich význam v šíření antibiotické rezistence Geny podmiňující rezistenci k antibiotikům mohou být součástí genetických elementů plazmidů, transpozonů nebo integronů, které umožňují rozšiřování těchto genů mezi nejrůznější druhy bakterií (Ferrari a Turnidge, 2003). Collins a Hall (1995) definovali integrony jako genetické elementy složené z místně specifického rekombinačního systému, který rozpoznává a zachycuje mobilní genové kazety. Tyto DNA elementy nejsou schopné vlastního přemisťování mezi různými bakteriálními buňkami, jsou však součástí transpozonů nebo plazmidů s širokým hostitelským spektrem, které umožňují jejich efektivní šíření (Carattoli, 2001). Integrony se vyskytují ve vysoké frekvenci u multirezistentních gramnegativních bakterií izolovaných z veterinárního a humánního klinického materiálu i z prostředí (Sáenz a kol., 2004) a jsou jednou z nejdůležitějších příčin šíření antibiotické rezistence (Fluit a Schmitz, 1999). Struktura integronů Rozlišujeme integrony tříd 1 až 4. Integrony každé třídy jsou charakteristické svou strukturou, existuje však i variabilita v rámci jedné třídy (Carattoli, 2001). Integrony třídy 1 jsou nejrozšířenějšími integrony mezi bakteriemi izolovanými z klinického materiálu (Guerra a kol., 2003) a skládají ze dvou konzervativních oblastí oddělených variabilní oblastí, která obsahuje začleněné geny antibiotické rezistence nebo genové kazety dosud neznámé funkce (Carattoli, 2001). Zjednodušenou strukturu integronu třídy 1 popisuje Obrázek 1. 5 -konzervativní oblast (5 -CS) obsahuje gen int1, oblast att1 a promotor. Gen int1 kóduje místně specifickou rekombinázu, která hraje hlavní úlohu při přemisťování genových kazet (při jejich excizi a inzerci). Genové kazety jsou začleňovány do rekombinační oblasti att1 lokalizované za genem int1. Jednotlivé inkorporované genové kazety postrádají vlastní promotor. Jejich exprese je řízena z jednoho společného promotoru P ANT, který se ve skutečnosti skládá ze dvou promotorů P1 a P2 (Carattoli, 2001; Fluit a Schmitz, 1999). 3 -konzervativní oblast (3 -CS) je tvořena geny sul1, qace1 a otevřeným čtecím rámcem ORF5 kódujícím protein neznámé funkce. Gen sul1 kóduje protein odpovědný 21
za rezistenci k sulfonamidům a gen qace1 podmiňuje rezistenci ke kvartérním amoniovým sloučeninám a k ethidium bromidu (Carattoli, 2001). Variabilní oblast tvoří genové kazety lokalizované mezi 5 - a 3 -CS. Tato oblast se skládá z kódující sekvence a rekombinačního místa attc pro připojení další genové kazety. Počet genových kazet začleněných do integronu je různý, byly popsány integrony, které postrádají genové kazety, ale i integrony s pěti kazetami (Fluit a Schmitz, 1999). V současné době je známo přes 70 různých genových kazet (Mazel, 2004) odpovědných za rezistenci k aminoglykosidům, β-laktamovým antibiotikům, chloramfenikolu, sulfonamidům, erytromycinu a dezinfekčním látkám (Martinez-Freijo a kol., 1998). Obrázek 1: Obecná struktura integronu třídy 1 a proces začleňování nové genové kazety (upraveno podle Carattoli, 2001) 1.4 Metody průkazu antibiotické rezistence Stanovení citlivosti (rezistence) klinických bakteriálních izolátů k antibiotikům je často rozhodující pro optimální antibiotickou léčbu infikovaných pacientů. Testování antibiotické rezistence mikroorganizmů nehraje klíčovou roli pouze v oblasti terapie, ale rovněž v oblasti epidemiologie, monitorování šíření rezistentních mikroorganizmů a studia 22
přenosu genů antibiotické rezistence mezi mikroorganizmy žijícími v nejrůznějších typech prostředí (Fluit a kol., 2001). Z obecného hlediska můžeme metody průkazu antibiotické rezistence rozdělit na metody prokazující fenotyp rezistence a metody založené na průkazu genotypu (Ferrari a Turnidge, 2003). 1.4.1 Fenotypové metody Na rozdíl od metod genotypových, které nachází své uplatnění především v oblasti výzkumu, metody založené na průkazu fenotypu rezistence jsou využívány i v oblasti klinické mikrobiologie. Fenotypové metody je možné rozdělit na metody diluční, které se používají k určení minimální koncentrace antibiotika potřebného k inhibici růstu vyšetřovaného mikroorganizmu a zahrnují agarovou a bujónovou diluční metodu. Další kategorii tvoří metody difuzní zahrnující diskovou difuzní metodu, kde citlivost nebo rezistenci stanovíme podle toho, zda vyšetřovaná bakteriální kultura na agarové půdě vytvoří či nevytvoří příslušnou zónu inhibice růstu kolem disků s určitou koncentrací antibiotika. Metodou kombinující principy diskové difuzní metody a metod dilučních je Etest (Ferrari a Turnidge, 2003). Metodika, interpretace získaných výsledků citlivosti bakterií k antimikrobiálním látkám a v neposlední řadě standardizace interpretačních kritérií se řídí určitými pravidly. Jednou z předních mezinárodně uznávaných organizací, která stanovuje tato pravidla, je NCCLS (National Committee for Clinical and Laboratory Standards). 1.4.1.1 Speciální metody pro detekci rezistence k β-laktamovým antibiotikům Průkaz inducibilní β-laktamázy Standardní diskovou difuzní metodou a bujonovou mikrodiluční metodou používanou v klinických laboratořích nemohou být inducibilní β-laktamázy typu AmpC detekovány a dávají tak nesprávné výsledky o citlivosti testovaného infekčního agens. Obtížnost při detekci těchto β-laktamáz způsobují genetické rozdíly determinant antibiotické rezistence, rozdíly v hladině genové exprese a odlišnosti v substrátové specifitě jednotlivých enzymů k testovaným antibiotikům (Ferrari a Turnidge, 2003; Qin a kol., 2004). 23
K jejich průkazu je tedy nutné použít specifické testy; první z nich popsali Sanders a Sanders (1979). Do současné doby byly vyvinuty různé varianty testů (Huber a Thomas, 1994; Qin a kol., 2004), všechny jsou ale založeny na tom, že určitá antibiotika jako cefoxitin, ampicilin a karbapenemy indukují produkci těchto enzymů, které jsou pak vylučovány ve vysoké koncentraci a způsobují rezistenci k širokospektrým β-laktamovým antibiotikům. Průkaz širokospektré β-laktamázy Stále rostoucí frekvence výskytu enterobakterií produkujících širokospektré β- -laktamázy nutí odborníky vyvíjet metody pro jejich rutinní průkaz u klinických izolátů (Bradford, 2001). Velký problém při průkazu ESBL nastává v případě, že bakterie produkuje inducibilní β-laktamázu AmpC nebo dokonce oba typy enzymů (AmpC a ESBL současně). Tyto specifické testy využívají toho, že na rozdíl od AmpC je většina ESBL inhibována kyselinou klavulanovou a jinými inhibitory (Pitout a kol., 2003). Testy mají několik variant, mohou být založeny na bujónové diluční mikrometodě a Etestu (Leverstein-van Hall a kol., 2002), dále na diskovém difuzním testu (Jarlier a kol., 1988) a trojrozměrném testu (Thomson a Sanders, 1992). Všechny však prokazují synergický účinek mezi inhibitorem β-laktamázy a cefalosporiny 3. generace. Při hodnocení se srovnává zvýšená aktivita v přítomnosti β-laktamového antibiotika spolu s inhibitorem β-laktamázy (kyselinou klavulanovou) a aktivita v případě, je-li β-laktamové antibiotikum testováno samotné. Podstatou testu je inhibice širokospektré β-laktamázy kyselinou klavulanovou, což má za následek snížení hladiny rezistence k cefalosporinu (Bradford, 2001). 1.4.2 Genotypové metody Systémy založené na detekci nukleových kyselin jsou rychlými a citlivými metodami pro průkaz genů rezistence k danému antibiotiku a hrají důležitou roli v objasnění mechanizmů rezistence (Fluit a kol., 2001). Jednou z nejstarších molekulárních technik rovněž využívaných k detekci genů antibiotické rezistence je hybridizace, která je založena na párování jednořetězcových 24
fragmenů DNA ve vzorku s jednořetězcovou DNA sondou značenou radioaktivním nebo neradioaktivním markerem (Fluit a kol., 2001; Levy a kol., 1989; Oullette a kol., 1988). Nejspolehlivější metodou je přímé sekvencování DNA, které se stalo tzv. zlatým standardem pro analýzu genů kódujících nové typy β-laktamáz. Nevýhodou této metody jsou vysoké náklady a časová náročnost (Fluit a kol., 2001; M Zali a kol., 1998). V oblasti průkazu genů antibiotické rezistence je polymerázová řetězová reakce (PCR) nejvíce využívanou metodou (Cockerill, 1999; Fluit a kol., 2001). Hlavní kroky PCR zahrnují denaturaci DNA, připojení primerů a jejich elongaci termostabilní DNA polymerázou. PCR slouží k amplifikaci mnoha kopií vybrané sekvence. Výběr se provádí pomocí oligonukleotidových primerů, komplementárních k 3 - a 5 -koncovým sekvencím úseku, jenž má být pomnožen (Rumlová a kol., 2003). Tyto primery je možné vybrat podle specifických sekvencí genů antibiotické rezistence v internetových databázících (Genbank, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/index.html) (Bradford, 2001). 25
2. CÍL PRÁCE Escherichia coli a koliformní bakterie jsou často využívanými reprezentativními zástupci čeledi Enterobacteriaceae pro studium mechanizmů a genetických determinant rezistence k antibiotikům a slouží rovněž jako indikátory fekálního znečištění vody a potravin. Komenzální E. coli jsou běžnou součástí střevní mikroflóry člověka a zvířat, kde jsou vystaveny účinku antimikrobiálních látek a výměně genetického materiálu s ostatními bakteriemi a významnou měrou tak přispívají k šíření determinant rezistence. Cíl této diplomové práce je možné shrnout do následujících bodů: vypracovat přehled mechanizmů rezistence E. coli a koliformních bakterií k vybraným antimikrobiálním látkám zjistit frekvenci rezistence k vybraným antimikrobiálním látkám u souboru izolátů E. coli a koliformních bakterií ze zvířat, potravin a lidí u vybraných izolátů prokázat širokospektré a inducibilní β-laktamázy u souboru izolátů E. coli a koliformních bakterií ze zvířat, potravin a lidí prokázat genetické determinanty antibiotické rezistence metodou PCR 26
3. MATERIÁL A METODY 3.1 Použité mikroorganizmy 201 izolátů E. coli a koliformních bakterií získaných z mléčných filtrů odebraných na farmách mléčného skotu 283 izolátů E. coli O157 ze sbírky kultur Ústavu mikrobiologie a imunologie FVL VFU Brno; většina izolátů pocházela ze skotu 68 izolátů E. coli a koliformních bakterií získaných z potravin 61 izolátů bylo získáno z různých potravinových výrobků (především masné produkty) od MVDr. Brychty (Státní veterinární ústav Jihlava) 7 izolátů bylo získáno ze sýrů od MVDr. Žabské (Státní zemědělská a potravinová inspekce, Brno) 27 izolátů E. coli humánního původu izolovaných ze stolice průjmujících lidí; získány od RNDr. Lhotové (Národní referenční laboratoř pro E. coli a shigely, Státní zdravotní ústav, Praha) 8 multirezistentních izolátů E. coli 0157:H7 izolovaných z rektálních výtěrů koz a ovcí, které byly odebrány v Jordánsku (izoláty EC312 až EC319) Jako kontrolní kmeny byly použity: Escherichia coli ATCC 25922 Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 produkující širokospektrou β-laktamázu SHV-18 získaný od MUDr. Urbáškové (Národní referenční laboratoř pro antibiotika, Státní zdravotní ústav, Praha) Multirezistentní kmeny Salmonella enterica serovar Typhimurium (dále jen Salmonella Typhimurium) získané od Mgr. Hradecké (Výzkumný ústavu veterinárního lékařství, Brno): 27