Srážení krve, protisrážlivé mechanismy Jeffrey L. Weitz, MD, Přeložila ing. Jana Ďurišová PhD Úvod Koagulace je proces, při němž se v místě poranění cévy tvoří krevní sraženina. Poškozená céva se rychle stáhne, čímž se omezí průtok krve. Koagulace je za normálních okolností regulována tak, aby ke srážení docházelo jen v místě, kde uniká krev z cév, ale zároveň aby nebyl trvale omezen průtok krve.. Koagulace tedy zahrnuje regulovaný sled událostí, v němž se řada neaktivních proenzymů, neboli zymogenů, stane aktivními. Výsledkem procesu je tvorba trombinu, neboli faktoru IIa (FIIa), což je enzym, který nejen přetváří rozpustný fibrinogen na nerozpustný fibrin, ale také katalyzuje řadu reakcí souvisejících s koagulací (aktivuje krevní destičky proteázami aktivovaných receptorů trombocytů). Původní koagulační "kaskáda" tvorby sraženiny zahrnovala dvě nezávislé cesty, kterými je zahájena koagulace krevních destiček ve volném prostředí. I když je rozlišení pojmu vnější a vnitřní cesty užitečný pro pochopení testů koagulace in vitro, dnes už víme, že tyto cesty jsou složitě propojeny. Víme také, že krevní destičky a jiné buněčné složky krve jsou nedílnou součástí koagulačního systému. Buněčný model koagulace se vyvinul ve snaze lépe pochopit složité reakce, které se vyskytují na povrchu buněk, a integraci procesů, které vedou ke tvorbě sítě z fibrinových vláken a zátce zvané trombus. K zahájení nebo spuštění procesu koagulace dojde podle buněčného modelu na povrchu neporušeného tkáňového faktoru (TF). Tkáňovým faktorem jsou buňky nebo buněčné fragmenty, známé jako mikročástice, které se vytvářejí v místě poranění cévy [4, 5]. Mezi tyto buňky patří monocyty, makrofágy a buňky hladkého svalstva. TF se jako transmembránový protein váže na povrchu těchto buněk na cirkulující FVIIa a výsledný TF: FVIIa komplex iniciuje vznik malého množství trombinu.ten pak zvýší svou vlastní tvorbu, což má za následek daší prudkou tvorbu trombinu, který přetváří fibrinogen na fibrin, stabilizuje fibrinovou síť a aktivuje krevní destičky [4,5]. Přesně synchronizovaný sled událostí je
vyvážen systémem antikoagulačních a fibrinolytických mechanismů, které slouží k regulaci hemostatického účinku. Spouštěč koagulace Zranění na cévní stěně je považováno za hlavní impulz, který uvádí koagulační proces do pohybu. Cévní zranění může být způsobeno mechanicky, chemicky, nebo elektrickým proudem. V tepnách je zranění způsobeno především prasknutím aterosklerotického plátu, což způsobí narušení endotelu a tím je krev vystavena vlivu destiček (obr.1) [6]. V žilách je narušení stěny méně důležitým impulzem pro spuštění koagulace. K poraněním cévní stěny může dojít v důsledku operace nebo prozatímním žilním katétrem. Spouštěčem koaguace je snížení průtoku krve (stáza), změna vlastností krve, která je náchylnější ke srážení (trombofilie), a / nebo na změny v endotelu. Obrázek 1 Spouštěče arteriální trombózy a žilní trombózy. A = tepny, b = žíly. Mackman N. Nature. 2008; 451:914-918.6 Přetištěno se svolením.
Endotel obsahuje tři regulátory srážení - oxid dusnatý, [7, 8] prostacyklin, [9] a ektonukleotidázu, CD39 [10], které jsou odpovědné za udržování antikoagulačního prostředí a za zajištění obrany proti vytváření trombu v neporaněné cévě. Kromě toho subendotel kolagenu a TF usnadňují údržbu uzavřeného oběhového systému. Údaj o narušení rovnováhy vysílají receptory subendotelového kolagenu a TF na cirkulující krev. Odkrytý kolagen spouští hromadění a aktivaci krevních destiček, zatímco odkrytý TF je hlavním iniciátorem koagulace. Zahájení koagulace TF, také označován jako F III, je buněčně vázaný transmembránový glykoprotein, který je exprimován na buňkách obklopující krevní cévy jako jsou fibroblasty a buňky hladké svaloviny. TF v monocytech a endoteliálních buňkách mohou ovlivnit zánětlivé podněty (např. bakteriální lipopolysacharidy v sepsi), adhezivní molekuly (např. P-selektin vztažený na aktivitu krevních destiček a CD40 vyjádřené na aktivitu bílých krvinek), zánětlivé cytokiny (např. interleukin-6 a faktor tumor necrosis), a oxidující nízko hustotní lipoprotein (LDL) [12]. Oběhové mikročástice pocházející z monocytů a dalších typů buněk jsou také vyjádřením TF na jejich povrchu [13]. TF hraje důležitou roli nejen při srážení, ale také zprostředkovává intracelulární stimulaci při zánětu, apoptóze, embryonálním vývoji a buněčné migraci. TF, který je na povrchu neporušených a apoptotických buněk v jádru ateromatických plátů v tepnách, je považován po protržení plátu za hlavní stimul arteriální trombózy. [6] V žilách vyúsťuje aktivace endoteliálních buněk v expresi adhezivních molekul, které pak upevní nosné monocyty TF nebo mikročástice na svůj povrch. Jsou to právě tyto upevněné řetězce buněk, které jsou považovány za stimul žilní trombózy [5]. V každém případě ale nosné buňky TF nebo mikročástice poskytují klíčové buněčné povrchy pro zahájení koagulace. Koagulace je zahájena, jakmile se TF naváže na cirkulující FVIIa, kdy se vytvoří katalytický komplex TF-FVIIa, tzv. vnější komplex (obr.2). Faktor VIIa je protein, který se váže na negativně nabité fosfolipidové membrány. Vnější komplex pak aktivuje FIX a FX, a výsledný FXa přemění malé množství protrombinu (FII) na trombin. Toto malé množství trombinu vyvolává amplifikační fázi tím, že aktivuje krevní destičky, stejně jako FV, FVIII, a FXI. Aktivované destičky poskytují povrch, na němž se mohou shromáždit koagulační faktory. FXIa generuje další FIXa, který se pak váže na FVIIIa na povrchu aktivovaných
krevních destiček, čímž se vytvoří vnitřní komplex. Tento komplex rozšiřuje koagulaci účinnou aktivací FX. Faktor FXa se váže na FVa na povrchu aktivovaných krevních destiček za tvorby protrombinázového komplexu. Komplex protrombinázy, jako silný aktivátor protrombinu, spouští prudkou tvorbu trombinu. Obrázek 2 Přehled koagulační kaskády. Amplifikační fáze koagulace K amplifikační fázi koagulace dochází především na povrchu krevních destiček, ačkoli může nastat i na mikročásticích, aktivovaném endotelu a dalších buňkách. Malé množství trombinu vznikající při zahajovací fázi aktivuje krevní destičky a převádí FV na FVa, FVIII na FVIIIa, a FXI na FXIa [4] (obr.2). FIXa, vytvořený v průběhu iniciační fáze za přítomnosti svého aktivního kofaktoru tvoří spolu s FVIIIa za přítomnosti vápníku na aktivním povrchu destiček vnitřní soudržný komplex (FIXa-FVIIIa) [15]. Vnitřní soudržný komplex zesiluje aktivaci FX. FXa spolu s aktivními kofaktory a s FVa tvoří protrombinázový komplex (FXa- FVa) na povrchu krevních destiček. Vnitřní soudržný komplex (FIXA-FVIIIa) a komplex protrombinázy (FXa-FVa), které jsou spolu lokalizovány na membráně destiček, vytvoří za přítomnosti vápníku pozitivní zpětné vazby, jejichž výsledkem je rychlá tvorba trombinu.
Propagační fáze koagulace Aktivní krevní destičky jsou posíleny v propagační fázi (trombin je důležitý pro toto posílení) na místě zranění, aby poskytnuly odpovídající lokalizaci vnitřního soudržného komplexu, komplexu protrombinázy a vápníku na povrchu destiček pro optimální tvorbu trombinu. Výsledný prudký nárůst trombinu vede ke vzniku fibrinu z fibrinogenu. Rozpustné monomery fibrinu splynou v gelový polymer fibrinu a FXIIIa, který se aktivuje trombinem, vzniknou kovalentní můstky fibrinového vlákna a dojde k vytvoření stabilní fibrinové sítě [16] (obr. 2). Tvorba trombinu pokračuje i po formování sraženiny. Tento dodatečný trombin nejen že zpevní sraženinu, ale má také další protizánětlivé a proliferační funkce, které podporují hojení rány. Vytvořený trombin také aktivuje trombinem aktivovatelný fibrinolýzový inhibitor (TAFI), který slouží k ochraně sraženiny proti předčasné fibrinolýze zprostředkované plazminem. TAFIa zmírňuje fibrinolýzu tím, že štěpí karboxyterminus lysin ze zbytku fibrinu; což sníží regulaci fibrinolýzy, protože zbytky lysinu, které jsou vystaveny působení degradujícího fibrinu, představují vazebná místa pro plazminogen a plazmu. Regulace koagulace K regulaci koagulační dráhy dochází v každé fázi buď enzymatickou inhibicí nebo ztlumením činnosti kofaktorů. Inhibitor dráhy tkáňového faktoru (TFPI) a inhibitor typu Kunitz upravují vnější soudržný komplex. TFPI se váže na FXa a neutralizuje jeho činnost. TFPI-FXa komplex pak inhibuje FVIIa vázaný na TF. TFPI je převážně syntetizován endotelovými buňkami a v menší míře megakaryocyty. V oběhu jsou k dispozici 4 zásobárny TFPI: zásobárna v plazmě (asi 80% je vázáno na LDL, zatímco zbytek je volný), zásobárna vázaná na endotelu, která je uvolněná po podání heparinu a malá zásobárna v krevních destičkách. [18]. Antitrombin, inhibitor serin proteázy (serpin), je nejvýznamnějším inhibitorem koagulace. Antitrombin inaktivuje trombin, FXa a další srážecí enzymy v reakci, která je urychlena heparinem [19]. In vivo může být heparan sulfát cévní stěny náhradou za lékařský heparin jako aktivátor antitrombinu.
Thrombomodulin, integrální membránový protein exprimovaný na endoteliálních buňkách, slouží jako receptor trombinu. Jakmile se naváže na thrombomodulin, trombin již neslouží jako prokoagulační a nemůže aktivovat krevní destičky, převést fibrinogen na fibrin, ani rozšířit svou tvorbu. Trombin navázaný na trombomodulin výrazně aktivuje endoteliální receptor proteinu C, rovněž exprimovaný na povrchu endotelových buněk a dependentní protein vitaminu K. Aktivovaný protein C, v přítomnosti proteinu S jako kofaktoru, inaktivuje faktory FVa a FVIIIa, blokuje amplifikaci koagulačního systému, čímž se omezí další tvorba trombinu [20]. Protein Z (proteázový inhibitor, další dependentní protein vitaminu K) inhibuje FXa. Fibrinolýza Fibrinolýza je nezbytná pro odbourání sraženiny poté, co splnila svou hemostatickou funkci. Plazmin, hlavní prostředník fibrinolýzy, odbourává fibrin vzniklý při tvorbě rozpustných degradačních produktů fibrinu [22] (obr.3). Plazmin je produkován proteolytickým štěpením cirkulujícího plazminogenu za pomoci vnějších plazminogenových aktivátorů. K dispozici jsou 2 funkčně odlišné aktivátory plazminogenu: aktivátor plazminogenu tkáňového typu (t-pa) a aktivátor plazminogenu urokinázového typu (u-pa). t- PA je vypouštěn z endoteliálních buněk jako odpověď na trombin a žilní okluzi. u-pa je produkován jako neaktivní forma, prourokináza, která se aktivuje plazminem, kallikreinem, a FXIIa (tzv. kontaktní faktory). Fibrinolýza je regulována dvoustupňově. Plazmin je inaktivován α2-antiplasminem, zatímco inhibitory aktivátorů plazminogenu regulují aktivitu t-pa a u-pa [22].
Obrázek 3 Fibrinolýza Antikoagulační léčba Antikoagulační terapii je možné použít k prevenci nebo léčbě arteriální nebo žilní trombózy. K trombóze dochází, když jsou zničeny regulační mechanismy hemostázy patologickými procesy a je tvořeno nadměrné množství trombinu. Arteriální trombóza na narušeném aterosklerotickém plátu je kritickou událostí předcházející ve většině případů infarktu myokardu (MI) a cévní mozkové příhodě [6]. Venózní tromboembolismus (VTE) se vyskytuje u 10% - 40% pacientů imobilizovaných z důvodu nemoci nebo po operaci, a u 40% - 60% pacientů po velké ortopedické operaci [23]. VTE, který zahrnuje hlubokou žilní trombózu (DVT) a plicní embolii (PE), je spojen se značnou nemocností a úmrtností. PE je hlavní vyhnutelnou příčinou smrti u hospitalizovaných pacientů, a u těch, kteří podstupují velké ortopedické operace nebo rozsáhlé operace rakoviny. Jsou k dispozici jak parenterální tak orální preparáty antikoagulační terapie. Hepariny a antagonisté vitaminu K (VKAs) byly až do nedávné doby dvěmi hlavními skupinami parenterální a perorální antikoagulantů. Tyto látky jsou spojené s omezením, přestože jsou účinné. I když např. riziko pro heparin-indukované trombocytopenie je menší u heparinu s nízkou molekulovou hmotností než u nefrakcionovaného heparinu a téměř neexistuje u fondaparinuxu, [6] vyžadují všechny tyto látky podkožní injekci alespoň jednou denně, což omezuje jejich užitečnost pro dlouhodobé podávání.
Vznikající cíle pro nová antikoagulatika V současné době dostupné antikoagulanty blokují všechny koagulační faktory (především pak trombinu a FXa), a to buď přímo nebo nepřímo. Trombin je logickým cílem kvůli své mnohonásobné roli při koagulaci. Převádí fibrinogen na fibrin, je posledním krokem v koagulační kaskádě, ale rozšiřuje svou vlastní tvorbu zpětné vazby aktivací FV a FVIII, což jsou klíčové kofaktory pro vytvoření protrombinázi a vnitřního komplexu, a koordinuje aktivaci destiček a agregaci s koagulací. Inhibice trombinu blokuje nejen fibrin, ale také zmenšuje tvorbu trombinu a aktivaci destiček. [62] FXa má také ústřední roli v procesu koagulace a aktivaci destiček. FXa je základní součástí komplexu protrombinázy, která spouští tvorbu trombinu. To znamená, že inhibice FXa a následně trombinu představují důležitou strategii pro nové antikoagulační léky [63].