Iontové zdroje I. Ionizace, vlastnosti iontových zdrojů, iontová optika API zdroje: Iontové zdroje pracující za atm. tlaku Elektrosprej Nanoelektrosprej Chemická ionizace za atmosférického tlaku Fotoionizace za atmosférického tlaku Thermosprej Kombinované zdroje Iontový zdroj Vzorek Data Iontový zdroj Hmotnostní analyzátor Detektor Zdroj vakua
Ionizace Ionizace: převedení neutrálních molekul, případně iontů v roztoku na ionty v plynné fázi Příklady ionizací: M + e - -> M + + 2e - (tvorba radikál kationtu v EI) M + e - -> M 2+ +3e - (vznik vícenásobně nabitých iontů v EI) M + h -> M + + e - (tvorba radikál kationtu v APPI) M + [BH] + -> [M+H] + + B (přenos protonu, CI, ESI, APCI) M + B -> [M-H] - + [BH] + (vznik negativně nabitých iontů v CI, ESI, APCI) M + X + -> [M+X] + (elektrofilní adice, kationizace, ESI, MALDI) molekulární ion (M + ) vs. molekulární adukt ([M+H] +, [M+Na] +, [M+NH 4 ] + ) Ionizace, iontový zdroj, interface Neexistuje univerzální ionizační technika pro všechny molekuly, pro různé typy sloučenin jsou vhodné různé ionizace, které vedou k molekulárním iontům nebo aduktům. ionizace měkká ionizace za sníženého tlaku tvrdá za atmosférického tlaku Rozdělení podle energie tvrdé ionizační techniky vysoce energetická ionizace, molekuly se rozpadají na fragmenty (EI, PB) měkké ionizační techniky málo energetické, vznikají hlavně molekulární adukty, minimální fragmentace (API techniky, MALDI) Rozdělení podle tlaku v iontovém zdroji: ionizace může probíhat za sníženého tlaku (EI, MALDI) nebo za atmosférického tlaku tzv. API techniky, MALDI
Ionizační techniky APCI: chemická ionizace za atmosférického tlaku APPI: fotoionizace za atmosférického tlaku EI: elektronová ionizace ESI: ionizace elektrosprejem MALDI: ionzace za spoluúčasti matrice TSI: ionizace termosprejem Ionizační techniky http://masspec.scripps.edu
Ideální iontový zdroj pro GC, HPLC, CE Musí být kompatibilní s mobilními fázemi a jejich průtoky běžně používanými v separačních metodách. Vysoké průtoky mobilní fáze nesmí ovlivnit vakuum v hmotnostním spektrometru. Nesmí výrazně přispívat k rozšiřování chromatografických zón. Musí zajistit vysokou účinnost ionizace a transportu vzniklých iontů do MS (citlivost). Ionizace co největšího množství látek (struktura, polarita, hmotnost). Spektra musí být reprodukovatelná a interpretovatelná. Signál musí být koncentračně závislý (umožňovat kvantifikaci). Zařízení musí být spolehlivé, robustní, jednoduché na obsluhu, cenově dostupné. API zdroje: Iontové zdroje pracující za atmosférického tlaku ESI, nanoesi, APCI, APPI
Sprejování mobilní fáze Společným prvkem technik ionizace za atmosférického tlaku je tvorba spreje. elektrickým polem (elektrosprej) sprejování pneumatické, za pomocí plynu vyhříváním kapiláry Vzájemné uspořádání sprejeru a vstupu do hmotnostního spektrometru (kóna, kapilára) ovlivňuje citlivost, velikost matričních efektů i robustnost systému. Iontová optika iontových zdrojů - maximalizace transportu iontů do analyzátoru / omezení vstupu neutrálních částic -účinná desolvatace / deklasterizace Účinnost přenosu iontů z iontového zdroje do MS zásadním způsobem ovlivňuje citlivost a dynamický rozsah spektrometru Skimmer: kónická elektroda s otvorem, která odděluje oblasti s různým tlakem; vzorkování iontů ve spreji nebo v expanzním prostoru za štěrbinou Vyhřívaná vstupní kapilára: vyhřívanáná trubice, která odděluje oblasti s různým tlakem Ztráty při převodu iontů z vyššího tlaku do nižšího v oblasti skimmeru (u ESI může být detekovaný iontový proud až o 3 řády nižší než generovaný).
Iontová optika iontových zdrojů Šestiotvorová vstupní kapilára Vstupní kapiláry/štěrbiny průměr typicky 0,2 1,0 mm ESI: maximální tvorba iontů v oblasti 3-5 mm od středu spreje (Agilent AJS) Vyšší průměry nevedou ke významnému zvýšení signálu (ztráty kvůli změně laminárního proudění na turbulentní), vyšší nároky na čerpadla. vstupní element tvořený soustavou 6 kapilár (zvýšení transmise, vyšší nároky na čerpání) Firemní materiály Agilent Iontová optika iontových zdrojů Iontová nálevka (ion funnel) soustava prstencových elektrod s otvory, jejichž vnitřní průměr se postupně snižuje. Na elektrody se vkládá stejnosměrné a střídavé napětí ionty jsou kolizně ochlazeny, zaostřeny do úzkého svazku a účinně přeneseny dále do MS. Zvýšení citlivosti oproti skimmerům: 10x 30x Shaffer et al., Rapid Commun. Mass Spectrom. 1997, 11, 1813 1817; Firemní materiály Agilent, Bruker
Iontová optika iontových zdrojů StepWave - soustava prstencových elektrod tvořících dva oddělené kanály. Ionty a neutrální částice ze zdroje vstupují do spodní trubice; potenciálový rozdíl mezi trubicemi směruje ionty do horní trubice, neutrální částice jsou odstraněny vakuovým systémem. Ionty jsou dále vedeny pomocí kombinace RF a DC (T-wave technologie) Firemní materiály Waters Elektrosprej (ESI) Eluát prochází kapilárou, na niž je vloženo vysoké napětí. Intenzivní pole na konci kapiláry tvoří kónický meniskus (Taylorův kužel), ze kterého se uvolňuje sprej vysoce nabitých kapiček. Následným postupným odpařením rozpouštědla vznikají ionty. Pokud je více ionizačních míst v molekule mohou vznikat vícenásobně nabité ionty. ESI převod iontů, které již existují v kapalné fázi do fáze plynné.
Elektrosprej (ESI) Rayleighův limit - stav, kdy jsou repulsní síly stejné jako povrchové napětí, které drží kapku pohromadě q 8 ( R 3 1/ 2 0 ) q náboj, 0 permitivita vakua, - povrchové napětí, R poloměr kapky Elektrosprej (ESI) jednoduchý, s velmi širokou oblastí použití, díky tvorbě vícenásobně nabitých iontů umožňuje analyzovat velmi velké molekuly (proteiny apod.) omezená použitelnost pro nepolární MF a nepolární analyty Elektrosprej je vhodný pro: Měkká ionizační technika, tvorba [M+H] +, [M+Na] +, [M-H] - iontů, fragmentace jen v některých případech. polární i iontové látky, peptidy, proteiny, sacharidy, nukleové kyseliny, organometalické i anorganické komplexy průtoky 5 µl/min - 1 ml/min (při >50 µl/min je nutné použít nebulizační/pomocný plyn) Elektrosprej je nejčastěji používaný iontový zdroj v LC/MS.
Elektrosprej ESI zdroj (Waters) ESI zdroj (Thermo) Elektrosprej N CH 3 Příklad: Analýza léčiv antiepileptikum Midazolam F N N Cl N N OH N F Cl Tvorba molekulárních aduktů [M+H] +, žádná fragmentace. Muchohi et al., J. Chromatogr. B, 821, 2005, 1
Elektrosprej Příklad: Analýza peptidů - bradykinin bradykinin Tvorba molekulárních aduktů [M+H] +, [M+Na] +. Většinou velmi intenzivní signály. Toll et al., J.Chromatogr. A, 1079, 2005, 274. Elektrosprej Příklad: Analýza proteinů - myoglobin myoglobin 16951 Da, 153 AA Tvorba vícenásobně nabitých molekulárních aduktů [M+H] +, [M+2H] 2+, [M+3H] 3+, [M+4H] 4+, atd. Distribuce nábojových stavů závisí na ph mobilní fáze.
Elektrosprej Příklad: Analýza oligonukleotidů Tvorba vícenásobně negativně nabitých molekulárních aduktů [M- H] -, [M-2H] 2-, [M-3H] 3-, [M-4H] 4-, atd. Mohou se vyskytnout výměny protonu za alkalický kov (Na, K). Nanoelektrosprej (nanosprej) Taylorův kužel Wilm, M. S.; Mann, M. Int. J. Mass Spectrom. Ion Processes 1994, 136, 167. velmi malá spotřeba vzorku, sprejování z vody bez přítomnosti organických rozpouštědel, vyšší tolerance k solím, možnost spojení s kapilární HPLC experimentální náročnost Nanoelektrosprej - obdoba ESI pracující s průtoky nl/min. Sprejuje se z kapilár o velmi malém průměru (několik m), vkládá se nižší napětí než u ESI (0,5 1,5 kv). Tvoří se menší kapky, které snáze desolvatují. Zvyšuje se účinnost ionizace. Práce s nanoelektrosprejem je experimentálně náročnější, polohu sprejeru je nutno pečlivě optimalizovat. Nanoelektrosprej je vhodný: pro obdobné látky jako ESI, hlavní využití v analýze proteinů a peptidů průtoky 20-500 nl/min 0,5-5 l/min = microesi Nanoelektrosprej je používaný pro kapilární a nano-hplc/ms a CE/MS.
Nanoelektrosprej (nanosprej) sprejovací kapiláry nanoelektrosprej Waters nanoelektrosprej Proxeon Nanoelektrosprej (nanosprej) Integrace sprejeru, kolony a termostatu do snadno vyměnitelného dílu Zdroj: Thermo
Nanoelektrosprej (nanosprej) Čip = mikrofabrikovaná chromatografická kolona pro UHPLC, spojovací kapilára a nanoelektrosprejer (keramický materiál) Zdroj: Waters Čip = mikrofabrikovaná chromatografická kolona, spojovací kapilára a nanoelektrosprejer (polyimid); sendvičová struktura, čipy na zakázku Zdroj: Agilent Nanoelektrosprej (nanosprej) Čip = křemíková destička s mikrofabrrikovanými sprejery a integrovanou SD kartou. Automatická změna sprejeru při zablokování. Zdroj: Advion
Nanoelektrosprej (nanosprej) Vliv napětí na sprejovací kapiláře na kvalitu spreje: Sprejování 5% kyseliny octové v 30% MeOH, průtok 200 nl/min, 5mm od vstupní kóny 900 V žádný sprej 1000 V oscilace mezi Taylorovým kuželem/kapkami, více kapek než spreje 1100 V - oscilace mezi Taylorovým kuželem/kapkami, 50% sprej 1200 V sprej s kapkami na jeho okraji 1300 V stabilní sprej 1400 V nestabilní sprej 1550 V vícenásobný sprej, pokles signálu Nanoelektrosprej (nanosprej) Příklad: Analýza inzulínu srovnání ESI a nanoesi v přítomnosti solí ESI nanoesi V přítomnosti sodných kationtů se v případě elektrospreje tvoří vedle [M+4H] 4+ ještě sodné adukty. NanoESI je méně citlivý na přítomnost solí, proto se adukty s Na + netvoří. Schmidt et al., J Am Soc Mass Spectrom. 2003 14(5):492.
Nanoelektrosprej (nanosprej) Příklad: Analýza tryptického digestu cytochromu c chromatogram MS spektrum MS/MS spektrum Nejčastější využití nanoesi analýza proteinů po jejich enzymatickém štěpení na peptidy. ESI při nízkých tlacích: subatmosférický tlak ESI ve vakuu? atmosférický tlak vakuum (10 5 10 6 Torr) Atmosférický tlak snižuje rychlost kapiček, zvyšuje hustotu náboje a způsobuje rozšiřování spreje sprejování za nižších tlaků umožňuje účinnější transmisi iontů do analyzátoru příliš nízký tlak způsobuje velmi rychlé odpařování rozpouštědel, zamrzání, nestabilitu spreje; výhodnější je nepříliš nízký (subatmosférický) tlak. Komerčně (zatím) nedostupné. Další aplikace: sprejování iontových kapalin (zanedbatelně těkavé, vysoká el. vodivost) ve vysokém vakuu jako ESI zdroj pro SIMS J. Fluid Mech. 2008, 604, 339; Anal. Chem. 2008, 80, 1800; Anal. Chem. 2010, 82, 9344
Chemická ionizace za atmosférického tlaku - APCI Horning, E.C., Carroll, D.I., Dzidic, I., Haegele, K.D., Horning, M.G., Stillwell, R.N., J. Chromatogr. 99, 13, 1974. Eluát je rozprašován do vyhřívané komůrky (~400-500 C). Koronový výboj je zdrojem elektronů, které ionizují plyny ve zdroji (zmlžovací plyn N 2, vzduch). Vzniklé ionty kolidují s molekulami rozpouštědla za tvorby sekundárních reakčních iontů (např. (H 2 O) n H + ). Tyto ionty ionizují molekuly analytu (záleží na jejich protonové afinitě). Chemická ionizace za atmosférického tlaku - APCI Mechanismus tvorby iontů v APCI: kladně nabité ionty: přenos protonu, výměna náboje záporně nabité ionty: ztráta protonu, záchyt elektronu
Chemická ionizace za atmosférického tlaku - APCI jednoduchá, se širokou oblastí použití, snadné použití s konvenční HPLC (kompatibilita průtoků), vhodná i pro méně polární analyty nevhodná pro termálně nestálé sloučeniny Měkká ionizační technika, tvorba [M+H] +, [M-H] - iontů, adukty se solventem, fragmentace je běžná, ale většinou v malém rozsahu. APCI je vhodná pro: polární i málo polární analyty < 2000 u, průtoky 0,5 2,0 ml/min APCI je druhý nejčastěji používaný iontový zdroj v LC/MS. Chemická ionizace za atmosférického tlaku - APCI APCI zdroj Varian APCI zdroj Thermo
Chemická ionizace za atmosférického tlaku - APCI Příklad: Analýza oxkarbazepinu a jeho metabolitů ve vlasech (forenzní toxikologie) [M+H] + Ve spektrech je molekulární adukt [M+H] + a fragmenty. frg. Kłys et al., J. Chromatogr. B, 825, 38, 2005 Chemická ionizace za atmosférického tlaku - APCI Příklad: analýza triacylglycerolů v tukovém tělese čmeláků 150 mm + 300 mm NovaPak C18 J.Cvačka, O. Hovorka, P.Jiroš, J. Kindl, K. Stránský, I. Valterová: J. Chromatogr.A, 1101, 226-237, 2006 E.Kofroňová, J.Cvačka, P.Jiroš, D.Sýkora, I.Valterová: J. Lipid Sci. Technol., 2009,
Chemická ionizace za atmosférického tlaku - APCI Příklad: analýza triacylglycerolů v tukovém tělese čmeláků Triacylglycerol OOP [M+NH 4 ] + 876.4 577.4 [M+H] + 603.4 282; FA 18:1 859.5 256; FA 16:0 GC/APCI-MS McEwan and McCay, J. Am. Soc. Mass Spectrom., 16, 1730 1738 (2005). APCI lze použít jako iontový zdroj pro GC. lze použít vyšší průtoky nosného plynu, rychlé přepínání polarit méně univerzální než EI (nelze ionizovat např. uhlovodíky), méně fragmentace, spektra nejsou vhodná pro srovnávání s EI knihovnami Stejně jako u LC/APCI vznikají molekulární adukty [M+H] +.
Fotoionizace za atmosférického tlaku - APPI Eluát je rozprašován do vyhřívané komůrky. VUV lampa je zdrojem fotonů (energie ~10 ev), které jsou absorbovány molekulami analytu. Analyt ztrácí elektron a vznikají molekulární ionty M +. Do zdroje se může přivádět dopant s nízkou ionizační energií (toluen, aceton) ke zvýšení koncentrace ionizovaných molekul a tím i ke zvýšení účinnosti ionizace analytu. Fotoionizace za atmosférického tlaku - APPI detekce látek s velmi nízkou polaritou, velký lineární dynamický rozsah APPI je vhodná pro: látky, které se obtížně ionizují v ESI a APCI (APPI není závislá na acidobazických reakcích v plynné fázi). Energie fotonů je volena tak, aby byla dostatečná pro ionizaci analytů, ale zároveň dostatečně nízká, se neionizoval vzduch a rozpouštědla (voda, MeOH, MeCN). Dochází k přímé ionizaci analytů. průtoky 0,5 2,0 ml/min API metoda, měkká ionizace. Tvorba M +, M -, [M+H] +, [M-H] - iontů, aduktů se solventem.
Fotoionizace za atmosférického tlaku - APPI Fotoionizace za atmosférického tlaku - APPI Příklad: Analýza polycyklických aromatických uhlovodíků Benzo[a]pyren dává v ESI minimální odezvu [M+H] +, v APCI část iontů fragmentuje. Maximální odezvu poskytuje APPI. Hanold et al., Anal.Chem.76, 2842, 2004
Thermosprejová ionizace - TSI C. R. Blakley, J. J. Carmody, and M. L. Vestal: J. Am. Chem. Soc. 1980; 102(18), 5931 Pro průtoky 0,5-2,0 ml/min Eluát prochází kapilárou, jejíž konec je vyhřívaný. Na konci kapiláry se tvoří sprej, mobilní fáze obsahující těkavý pufr (např. 0,1 M octan amonný) je rychle zplyněna. Analyty přitom tvoří adukty s přítomnými ionty. Ionty jsou extrahovány do vstupní štěrbiny analyzátoru. Nízká účinnost ionizace, nízká citlivost. Dnes téměř nepoužívaný zdroj. Není pravý API zdroj, v prostoru zdroje je tlak jen několik Pa. Thermosprejová ionizace - TSI Příklad: Identifikace saponinů v sóji luštinaté (Glycine max) * fragmenty Tvorba aduktů se složkami mobilní fáze, rozsáhlá fragmentace. N.Fuzzati, R.Pace, G.Papeo, F.Peterlongo, J. Chromatogr. A, 777, 1997, 233
Kombinované (duální) iontové zdroje: ESI + APCI - současná detekce v módu ESI a APCI bez nutnosti přepínání zdroje - pro ionizace látek, které mají výrazně jiné citlivosti v ESI a APCI Př. Analýza vitamínů Zdroj: Agilent, Shimadzu Kombinované (duální) iontové zdroje: APCI + APPI Př. Polycyklické látky - současná ionizace v módu APCI a APPI může zvyšovat celkovou odezvu detektoru Zdroj: Thermo