Ing. Petr Žák, CSc., Roche s.r.o., Diagnostics Division Nové možnosti v sekvenování - sekvenátor GS- LX Pøedstavte si, že zajdete k lékaøi tøeba s migrénou a už druhý den víte, jestli za bolest hlavy mùže vaše DNA. Nebo ještì lépe - pøedstavte si, že víte, že vaše DNA obsahuje sekvence podmiòující bolest ještì pøed tím, než se projeví. Podobný scénáø se jistì neodehraje v nejbližších pìti èi deseti letech, ale jestli se sen vývojových pracovníkù biotechnologické firmy 454 Life Sciences splní, budou lékaøi v budoucnosti schopni rychle a levnì odhalit tajemství genù a genomù pacientù, odhalit indikátory náchylnosti k nìkterým onemocnìním a urèit potenciální úèinnost rùzných lékových režimù. Díky pokrokùm v sekvenaèních technologiích se tato vize postupnì mùže stát realitou, což by zcela jistì pøineslo revoluci nejenom pøi návštìvì u lékaøe, ale také v náhledu spoleènosti na lidské zdraví a onemocnìní. ce je tedy užiteèné pro základní výzkum (jak organismy žijí a fungují), ale také pro aplikaèní oblasti a pochopitelnì pak i v medicínské oblasti. Pokud má nìjaká choroba genetický základ, pak je její konkrétní pøíèinou zmìna normální (zdravé) formy genu v nesprávnou nebo chorobnou formu. Základem této zmìny je právì konkrétní zmìna sekvence DNA. Podaøí-li se takovou zmìnu po srovnání sekvencí zdravých a nemocných jedincù identifikovat, mùže posloužit k vývoji diagnostického postupu. Znalost zmìny sekvence, která je pøíèinou choroby, také otevírá cestu k budoucí cílené léèbì genovou terapií (tj. náhradou funkce chorobné alely zdravou alelou). První sekvenaèní technologie použitelná pro rozsáhlejší sekvenování byla technika vyvinutá rederickem Sangerem v roce 1977. V roce 1980 byla tato práce ohodnocená Nobelovu cenou za chemii (spolu s Walterem Gilbertem a Paulem Bergem). Tato metoda používá modifikované nukleotidy (dideoxynukleotid trifosfáty) pro sekvenènì specifickou terminaci DNA polymeraèní reakce. Metoda byla postupnì zdokonalovaná a zejména tøi vylepšení pùvodního postupu pøispìly k jejímu velkému rozšíøení - použití fluorescenèních znaèek místo pùvodních radioaktivních znaèek pro detekci syntetizovaných úsekù DNA, použití kapilární elektroforézy místo plochých gelù a nakonec tzv. paired-end sekvenování umožòující uspoøádat poskládané úseky do vzájemnì orientovaných celkù. Rùzné varianty Sangerovy metody tak pøispìly do roku 2005 k osekvenování prakticky všech do té doby sekvenovaných genù a genomù. Sangerova technika má ale nìkterá omezení. Zejména projekty V genetice a biochemii se sekvenováním rozumí urèení primární struktury (nebo primární sekvence) nerozvìtveného biopolymeru. Výsledkem sekvenování je tedy lineární symbolický popis struktury sekvenované molekuly. Sekvenovat mùžeme obecnì nukleové kyseliny (DNA, RNA), proteiny a pøípadnì i polysacharidy (i když zde se vìtšinou nemluví o sekvenování právì proto, že jsou èasto rozvìtvené). Nejèastìji se termín sekvenování používá v souvislosti s urèením primární struktury DNA, tedy urèením posloupnosti nukleotidù daného DNA fragmentu. Sekvence DNA obsahuje pro živé organismy nezbytné informace pro pøežití a reprodukci. Vzhledem ke klíèové úloze DNA pro živé organismy mùže být znalost DNA sekvence užiteèná prakticky pøi jakémkoliv biologickém výzkumu. Urèení sekvenvelkého rozsahu, jako napøíklad sekvenování celých genomù jednotlivých organismù, vyžadují velmi pracnou pøípravu knihovny genomových fragmentù v bakteriálních plasmidech, které jsou potom sekvenovány a skládány do vìtších úsekù. Sangerova metoda se pøesto použila i pøi tak rozsáhlých projektech, jako bylo sekvenování lidského genomu (Human Genome Project, HGP). Byla zlatým standardem po desetiletí. Po celou tuto dobu kralování Sangerovy metody se zvýšení sekvenaèní kapacity dosahovalo v zásadì jenom zvìtšováním poètu sekvenaèních reakcí, používáním stále vìtšího poètu kapilár v jednom pøístroji. Drahá a na práci nároèná pøíprava vzorku pro Sangerovo sekvenování èiní tento postup ménì vhodný i pro rutinní klinické úèely, kde se vyžaduje levné, rychlé a pøesné sekvenování. Zkoušela se øada nových pøístupù - sekvenování hybridizací, pøímé zobrazení DNA sekvence pomocí speciální mikroskopie (atomic force microscopy), hmotnostní spektrometrie, aplikace mikrofluidních èipù atd. Žádná metoda se neukázala jako prakticky použitelná a tak se øada spoleèností a výzkumných týmù snažila najít nìco nového. V roce 1998 Mostafa Ronaghi na univerzitì ve Standordu pøišel na novou technologii, nazvanou pyrosekvenování. Tuto metodu nakonec adaptovala pro své úèely firma 454 Life Sciences. Spoleènost 454 Life Sciences byla založena v roce 2000 právì s cílem pøevést do reality sekvenování genomù jednotlivcù a od okamžiku svého založení je stále na èele pelotonu v závodì o personalizovanou medicínu. Zakladatel 454 Life Sciences, Dr. Jonathan Rothberg, se musel vypoøádat s onemocnìním v rodinì. Jeho novì narozený syn byl nemocný Labor Aktuell 03/09 27
a nakonec na sekvence DNA. V roce 2005 publikoval 454 Life Sciences genom Mycoplasma genitalium, prvního organismu sekvenovaného touto technologií. Sekvenaèní reakce v pøístroji Genome Sequencer System LX a když Dr. Rothberg èekal na nové zprávy od lékaøù, uvažoval o možnosti pøesnì urèit synùv stav pøeètením jeho genomu. Tak zaèalo jeho tažení, jehož cílem bylo poskytnout rychlé a dostupné sekvenování genomu. Roche Diagnostics zaèal velmi záhy s firmou 454 Life Sciences úzce spolupracovat a v bøeznu 2007 po dohodì firmu 454 Life Sciences koupil. Pyrosekvenováním se oznaèuje série enzymatických reakcí, bìhem kterých se zaznamenává zaèlenìní DNA báze do syntetizovaného øetìzce díky uvolnìnému viditelnému záøení. Struènì - DNA templát je inkubován s nìkolika enzymy, vèetnì DNA polymerázy a ATP sulfurylázy. Inkorporace kteréhokoliv ze ètyø deoxynukleotid trifosfátù (dntp) do komplementárního øetìzce k templátové (sekvenované) DNA vede k uvolnìní pyrofosfátu, slouèeniny, která je dále pøevedená na ATP pomocí ATP sulfurylázy. ATP pak slouží v reakci spøažené s enzymem luciferázou k uvolnìní protonu a ke vzniku svìtelného signálu. Svìtlo uvolnìné pøi zabudování nového nukleotidu se zaznamenává (zpravidla CCD èipem) a tento cyklus se pøi prodlužování øetìzce komplementárního k sekvenované jednoøetìzcové DNA opakuje. 454 sekvenování posouvá technologii pyrosekvenování díky masivní paralelizaci tìchto reakcí (soubìžnì probíhají stovky tisíc až více než milión sekvenaèních reakcí) o krok dále a umožòuje sekvenování tøeba i celých genomù. Jak tedy celý proces 454 sekvenování vypadá? Genomová DNA je nejdøíve mechanicky fragmentovaná na kratší úseky. K tìm jsou potom pøipojeny specifické adaptorové molekuly, které se používají jako templát pro primery v bìžné polymerázové øetìzové reakci (PCR) a pro sekvenaèní primery. PCR reakce probíhá na syntetických kulièkách v olejové emulzi - jedna molekula sekvenované jednoøetìzcové DNA, která je typicky pøihybridizovaná ke kulièce, je tzv. emulzní PCR reakcí namnožena, takže na konci PCR reakce je k DNA kulièce pøichyceno v prùmìru 10 miliónù identických kopií pùvodní jednoøetìzcové DNA. Dále jsou tyto kulièky vpraveny do jamek speciální optické destièky, tzv. pikotitraèní destièky (PTP), spoleènì s dalšími kulièkami, na které jsou pøichycené enzymy nezbytné pro pyrosekvenaèní reakci. Pikotitraèní destièka obsahuje na ploše 6x6 cm až 3 200 000 jamek. Všechny tyto kroky nahrazují pracné klonování jednotlivých DNA molekul nezbytné pøi klasickém sekvenování. Výhodou je i to, že se eliminují možné chyby vzniklé klonováním, kdy se v baktériích nìkteré fragmenty replikují výraznì lépe než jiné. Naplnìná pikotitraèní destièka se potom vloží do pøístroje, který øídí prùtoky deoxynukleotidù nad jejím povrchem. Pøitom dochází v každé jamce k prodlužování øetìzce komplementárního k templátové DNA, k tvorbì ATP a následnì k produkci svìtla. Øídící poèítaè zaznamenává tyto svìtelné signály každé jamky a zpracovává tento primární signál na tzv. flowgramy V souèasné dobì pøístroj Genome Sequencer LX dokáže v jednom sekvenaèním bìhu za 10 hodin získat sekvence cca 400-600 miliónù bází. Délka jednotlivých sekvenovaných úsekù je cca 500 bází (modální hodnota). Délkou ètení DNA sekvence pomocí Genome Sequencer (GS- LX) se zcela zásadnì odlišuje od ostatních tzv. next-generation sequencing pøístrojù, kde délka ètení nepøekraèuje reálnì 50-75 bází. Pøedpokládá se, že v prùbìhu pøíštího roku se délka sekvenovaných úsekù zvýší až na 1000 bází, èímž se pøekoná i prùmìrná délka ètení pøi klasickém Sangerovì sekvenování. Jeden sekvenaèní bìh pak osekvenuje asi 1 miliardu bází. Délka ètených úsekù je velmi dùležitá, protože zcela zásadnì ovlivòuje praktickou použitelnost sekvenaèních pøístrojù pro øadu sekvenaèních aplikací. Kombinace dlouhých sekvenovaných úsekù a obrovského poètu osekvenovaných bazí v jednom bìhu dovoluje uživatelùm pøístroje GS- LX sekvenovat dnes už jakékoliv vzorky, takže umožòuje napøíklad: l celogenomové de novo sekvenování a BAC sekvenování: Pøi de novo sekvenování se doposud neznámý genom (není k dispozici referenèní sekvence) nebo èást genomu sekvenuje a skládá do vìtších souvislých oblastí. V urèitých pøípadech se de novo pøístup používá i tehdy, když k dispozici referenèní sekvence je, protože se tak dají získat lepší výsledky. Pøi tradièním Sangerovì sekvenování se vìtšina sekvenaèních projektù nemohla uskuteènit díky finanèní a technické nároènosti tìchto projektù. Pouze velká sekvenaèní centra provádìla sekvenování vybraných (zpravidla modelových) organismù. S pøístrojem Genome Sequencer LX mùžou i malé laboratoøe sekvenovat v podstatì jakékoliv organismy. GS- LX umožòuje sekvenování genomù nejrùznìjších organismù, napøíklad baktérií, kvasinek, hub a virù a dále tøeba umìlých bakteriálních chromozómù (BAC) a fosmidù apod. De novo sekvenování genomu E. coli o velikosti 4,6 Mb se mùže 28 Labor Aktuell 03/09
Jeden fragment - jedna DNA kulièka - jedno ètení Pøíprava vzorku Vzorky jako genomová DNA nebo BAC knihovny jsou fragmentovány na menší fragmenty o délce cca 500-800 bp. Pøi sekvenování kratších vzorkù, jako napø. malých nekódujících RNA nebo PCR produktù (amplifikovaných pomocí tzv. fùzních primerù) není fragmentace nutná - mùžou se použít pro imobilizaci na DNA kulièky pøímo, jak je vidìt na obrázku jeden fragment - jedna kulièka. Pøíprava knihovny S využitím bìžných molekulárnì biologických technik se ke každému fragmentu DNA pøidají krátké adaptory (A a B) specifické jak pro 3' tak pro 5' konec. Tyto adaptory se využívají v dalším postupu pøi purifikaèních a amplifikaèních krocích a pøi vlastní sekvenaci. Knihovnou (se kterou se pracuje dále) se rozumí jednoøetìzcové fragmenty sekvenované DNA s A a B adaptory na obou koncích. Jeden fragment - jedna DNA kulièka Jednoøetìzcová DNA knihovna se hybridizací pøichytí ke speciálnì navržené DNA kulièce. Hybridizaèní podmínky se nastaví tak, aby se podpoøilo navázání jednoho jednoøetìzcového fragmentu na jednu DNA kulièku. empcr (emulzní PCR) Každý jednotlivý fragment knihovny pøichycený na DNA kulièku je amplifikován v oddìleném mikroreaktoru, vytvoøeném v olejové emulzi. Mikroreaktory obsahují nezbytné složky pro normální PCR reakci. Po skonèení empcr reakce je ke kulièce pøihybridizováno v prùmìru 10 miliónù identických kopií pùvodní jednoøetìzcové DNA, které zùstanou pøichycené k DNA kulièce i po jejím uvolnìní z olejové emulze. Jedna DNA kulièka - jedno ètení DNA kulièky jsou pak vpraveny do jamek speciální optické destièky, tzv. pikotitraèní destièky (PTP). Do jedné jamky PTP se vejde vždy jen jedna DNA kulièka. Používají se i další kulièky, na které jsou pøichycené enzymy nezbytné pro pyrosekvenaèní reakci. Pøi vlastním sekvenování proudí nad otevøenou stranou PTP jamek jednotlivé nukleotidy v pevném poøadí. Pøidání nukleotidu (nukleotidù) komplementárního sekvenovanému fragmentu dá vzniknout chemiluminiscenènímu signálu, který zaznamenává CCD kamera pøístroje. Analýza dat Kombinace intenzity signálu a pozice na PTP destièce umožní softwaru urèit paralelnì sekvenci více než 1 000 000 individuálních fragmentù (ètení) bìhem asi 10ti hodinového bìhu. Labor Aktuell 03/09 29
provést v jednom sekvenaèním bìhu pøístroje (a to až ètyøi rùzné vzorky, napøíklad kmeny v jednom bìhu) a jeden èlovìk zvládne vše za nìkolik dní. S použitím externích softwarových nástrojù pro analýzu dat je pak možné de novo sekvenovat i složitìjší organismy (rostliny, živoèichy). Jako poslední byl pouze pøístrojem GS- LX (tedy bez pomoci klasického Sangerova sekvenování) napøíklad sekvenován genom olejové palmy. De novo sekvenování využívá dvou základních metod - shot gun sekvenování, tedy sekvenování náhodnì fragmentovaných úsekù genomové DNA a tzv. paired-end (párového) sekvenování, tedy ètení úsekù pùvodnì od sebe vzdálených 3 kb, 8 kb nebo 20 kb (nebo jejich kombinací) - viz vložená informace. l Resekvenování: Pøi resekvenování je èást genomu nebo kompletní genom porovnán s existující obdobnou již známou sekvencí. Cílem je zjistit rozdíly nové sekvence oproti referenèní sekvenci. Resekvenují se stejné organismy jako pøi de novo sekvenování, tedy rostliny, živoèichové, baktérie, kvasinky, houby, viry atd. Pøístrojem byl resekvenován napø. kompletní genom dr. Jamese Watsona. Pomocí resekvenování (pøípadnì tzv. ultra hlubokého resekvenování PCR amplikonù) se dají zkoumat a detekovat genomické pøestavby, oblasti spojené s výskytem nìkterých chorob (detekce SNP, delecí a inzercí), detekovat nové SNP, detekovat øídce se vyskytující somatické mutace, tedy zmìny, které mohou hrát klíèovou roli v onkologických onemocnìních. l Analýza transkriptomù: S pøístrojem GS- LX je možná komplexní sekvenaèní analýza transkriptomù. Velká délka sekvenovaných úsekù umožòuje použití øady metod, zejména pak analýzu cdna plné délky, dùležitou napøíklad pro detekci zatím neznámých sestøihových variant. l Analýza regulace genù: Pøístroj se hojnì využívá napøíklad k identifikaci nekódujících malých RNA (snc RNA), identifikaci vazebných míst pro transkripèní faktory (CHIP-Sequencing) atp. l Analýza epigenetických zmìn: analýza zmìn DNA metylací, analýza modifikací nukleozómù atp. l Metagenomika a bakteriální diverzita: velmi se rozšiøující oblast, kde se s úspìchem používá právì pøístroj GS- LX, který umožòuje díky dlouhé délce ètených úsekù jednoznaènì pøiøadit sekvenované fragmenty DNA jednotlivým (mikro) organizmùm. Cílem metagenomických studií je vìtšinou analýza mikrobiálních genomù z rùzných vzorkù pro zjištìní mikrobiální pestrosti, množství a rozšíøení mikroorganismù. l Paleogenomika: sekvenování DNA z vymøelých organismù. Úspìšnì byl sekvenován genom mamuta, neandrtálce a dalších organizmù. K dnešnímu datu (srpen 2009) byl pøístroj GS- LX využit pøi pøípravì asi 500 tzv. peer review prací v renomovaných èasopisech. To svìdèí asi nejlépe o tom, že jde o vyzrálý a spolehlivý systém, který poskytuje kvalitní výsledky. Systém GS- LX umožòuje také stanovení sekvence obou protilehlých koncù fragmentù DNA (tzv. párové ètení) vzdálených od sebe ve zkoumaném genomu pùvodnì cca 3000 bází, 8000 bází nebo 20 000 bází, pøièemž prùmìrná délka každého èteného fragmentu je asi 150 bází. Tato metoda nevyžaduje žádné klonování a celková doba pro získání výsledkù je pøitom kratší než 4 dny. Metoda je využitelná nejenom pro orientaci a zjištìní relativní pozice tzv. kontigù získaných pøi de novo shot gun sekvenování, ale také pro identifikaci strukturálních variací a jim pøíslušejících zlomù. Strukturálními variacemi genomu zde rozumíme velké delece, duplikace, inzerce, inverze a komplexní kombinace pøestaveb, které jsou hojné v napø. v lidském genomu a o kterých se pøedpokládá, že jsou zodpovìdné za znaèné množství fenotypových variací. Pøíkladù použití je mnoho, staèí si v pøíslušných databázích (nebo na firemních webových stránkách) zadat do vyhledavaèe napøíklad heslo 454. Uveïme alespoò jeden zajímavý pøíklad metagenomické studie, která byla publikována v èasopise Nature. Autoøi v ní zjiš ovali vzájemný vztah mezi støevní mikroflórou a obezitou (An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest. Turnbaugh1, P. J., et al., Nature, 2006 Dec 21; 444(7122):1027-31). Lidský metagenom se skládá z genù Homo sapiens a genù triliónù mikrobù, které osídlily naše tìla. Pøedpokládá se, že mikrobiální geny pøevyšují ty lidské co do poètu o nìkolik øádù. Náš mikrobiální genom (mikrobiom) má zakódované metabolické schopnosti, které jsme si sami nevyvinuli, napøíklad rozklad jinak nestravitelných èástí naší potravy. Obdobná situace je i u myší. 30 Labor Aktuell 03/09
Porovnáním støevní mikroflory obézních myší a jejich štíhlých protìjškù (a také lidských dobrovolníkù) se zjistilo, že obezitu doprovází zmìna relativní èetnosti dvou dominantních kmenù, Bacterioides a irmicutes. Mikrobiom obézních myší má zvýšenou schopnost využít energii z potravy. Zajímavé je i to, že tato vlastnost je pøenositelná - pøi osídlení bezmikrobních myší obézním mikrobiomem došlo k výraznému nárùstu celkového tìlního tuku než pøi osídlení pùvodnì bezmikrobních myší mikrobiomem štíhlých myší. První pøeètení (tedy osekvenování) úplné genetické informace èlovìka stálo øádovì stovky milionù dolarù. Pøedpokládá se, že když cena za sekvenaci jednoho lidského genomu klesne pod 1000 dolarù, zaène se sekvenování postupnì rutinnì používat pro medicínské úèely. Pokrok v metodách masivního paralelního sekvenování již dnes pøibližuje myšlenku osekvenování lidského genomu za 1000 dolarù realitì. V souèasné dobì klinické sekvenování znamená sekvenování v malém rozsahu zamìøené na analýzu jednotlivých genù/ mutací. Next-generation sekvenování se používá v medicínì pøedevším pro výzkumné úèely - buï pro rychlé celogenomové sekvenování, nebo pro resekvenování urèitých zájmových oblastí. Zatím se neobjevují hlasy požadující celogenomové sekvenování pro diagnostické úèely. Výhledovì je ale jisté rozsáhlé sekvenování genù biochemických drah úèastnících se vzniku a vývoje onemocnìní (zejména u komplexních chorob). Je také možné pøedstavit si napøíklad rozsáhlé sekvenování stovek genù, majících vliv na metabolismus lékù, jako cestu k next generation farmakogenetickému testování. Je možné spekulovat, že budeme pøed skuteènì celogenomovým sekvenováním sekvenovat stovky genù úèastnících se komplexních/multifaktoriálních onemocnìní, jako je hypertenze, ateroskleróza a další. V ještì vzdálenìjší budoucnosti je možné pøedpokládat, že lékaøské využití znalostí získaných celogenomovým sekvenováním pøeváží stávající cenu sekvenaèního procesu a že se tato metoda zaène rutinnì používat pro diagnostické úèely. V souèasné dobì ale schopnost interpretovat získaná data je daleko vìtší pøekážkou klinickému využití next generation sekvenování, než možnost získat nìco pøes tøi miliardy bází lidského genomu. Malý pøíklad. Nìkolik velkých genù s nejrùznìjšími mutacemi u jednotlivých pacientù bylo rozsáhle sekvenováno na úrovni genù. Nejvíce zøejmì geny BRCA1/BRCA2 a gen pro cystickou fibrózu. Tato úroveò sekvenování má opodstatnìní zejména u genù BRCA, protože dìdièné onkologické onemocnìní prsu/ vajeèníkù je dominantnì dìdìné a když se nepodaøí detekovat by i jen jednu jedinou vzácnou mutaci u ženy s rizikem vzniku choroby, mohla by se podcenit nezbytnost preventivních opatøení s pøíslušnými vážnými dopady. Zdá se ale, že se v genech BRCA1/BRCA2 vyskytuje témìø nekoneèná øada mutací, z nichž nìkteré jsou tak vzácné, že se vyskytují jen v jedné rodinì. V jedné referenèní laboratoøi (konkrétnì Myriad Genetics) byly oba geny sekvenovány u více jak 150 000 jedincù. V souèasnosti je identifikováno více než 10 000 jednak zhoubných mutací a dále neškodných mutací nebo mutací s neznámým klinickým dopadem. Pøesto jsou stále každý týden u 1 % až 2 % nyní testovaných pacientek nalézány nové (zpravidla neškodné) mutace, u kterých musí být ale peèlivì analyzován jejich klinický dopad. Tento malý pøíklad je dobré mít na pamìti pøed úvahami o klinickém sekvenování mnoha a mnoha genù nebo dokonce celého genomu. Mùžeme oèekávat nalezení tisícù a tisícù, možná miliónù nových variant jak u nemocných pacientù, tak u zdravých lidí. To nutnì povede k urèité nejistotì pøi vyhodnocování výsledkù. V této souvislosti se dokonce vyskytl nový termín, analog genomu, transkriptomu. Je to výraz incidentalome, v této souvislosti pro oznaèení všech náhodných variací genomu. V souèasné dobì bìží nìkolik projektù, které se snaží rozšíøit znalost o variabilitì mezi jednotlivci. Známý je napøíklad projekt 1000 genomù. Tyto projekty urèitì pøispìjí k pøedbìžné identifikaci neškodných variant, ale další úsilí pro pøesnou identifikaci tìch, které jsou dùležité pro zdraví pacientù, bude nezbytné. Více podrobností o pøístroji, o principech a technologiích, které využívá, mùžete najít na webových stránkách http://www.454.com. Zde také najdete seznam prací, které vznikly díky tomuto pøístroji vždy spoleènì s odkazy na databázi PubMed, kde lze v øadì pøípadù získat kopií dané publikace jako pdf soubor. Je možné použít pro vyhledávání i klíèová slova, takže si mùžete snadno ovìøit, jestli tøeba ve vašem oboru už nìkdo pøístroj GS- LX využil. V pøípadì, že budete chtít další informace - obra te se na nás, rádi vám je poskytneme. Pište, prosím, na e-mailovou adresu: petr.zak@roche.com. Labor Aktuell 03/09 31