Mgr. Eva Flodrová FN Brno,Oddělení lékařské genetiky Laboratoř molekulární diagnostiky eflodrova@fnbrno.cz
enzymy katalyzující oxidativní metabolické reakce xenobiotik provádějí redukci C-, N-, S-, hydroxylaci, dealkylaci, dehalogenaci a deaminaci molekul substrátů jsou zahrnuty v oxidativním metabolismu exogenních i endogenních molekul v první fázi je oxidací přeměňují na elektrofilní meziprodukty, které jsou dále enzymy druhé fáze konjugovány na hydrofilní deriváty vylučované močí jsou zapojeny v detoxikačních procesech hlavně v játrech, ale i jiných orgánech u člověka se jich náchází více jak 57 druhů
enzym debrisoquin 4-hydroxyláza patří mezi nejvíce studované biotransformační enzymy aktivita enzymu se mezi jednotlivci liší rozdíly v aktivitě CYP2D6 vedou k individuálním rozdílům v terapeutické účinnosti léčiv zahrnut v metabolismu asi 100 léčiv antidepresiva, antipsychotika, beta blokátory, antiarytmika
Betablokátory: Trimepranol, Karvedilol, Timolol.. Antidepresiva: Paroxetin, Citalopram, Amitriptylin, Sertralin.. Antipsychotika: Haloperidol, Zotepin, Risperidon.. Inhibitory protonové pumpy: Omeprazol,Lansoprazol.. Antiepileptika: Fenobarbital, Fenytoin.. Cytostatika: Tamoxifen, Paklitaxel, Vinblastin, Cyklofosfamid.. Antihypertenziva: Chinidin, Propafenon, Kaptopril.. Ostatní: Indometacin, Kodein, Tramadol, Lidokain, Oxykodon..
45 kb u člověka na dlouhém raménku chromozomu 22 (22q13.1) skládá se ze tří homologních genů - CYP2D8P, CYP2D7P, CYP2D6 CYP2D8P - pravý pseudogen delece, inzerce, terminační kodony, nemá otevřený čtecí rámec CYP2D7P - sekvenční homologie je 97% s CYP2D6, obsahuje pouze jednu inaktivující mutaci, inzerci T138 v exonu 1 mění čtecí rámec předčasnou terminaci translace 9 exonů a 8 intronů 4 378 bp mrna 1655 bp
Zanger, Raimundo a Eichelbaum, 4 hlavní skupiny - PM- pomalí metabolizátoři žádná enzymová aktivita - IM- intermedierní metabolizátoři - snížená enzymová aktivita - EM - efektivní metabolizátoři - normální enzymová aktivita - UM - ultrarychlí metabolizátoři -extrémně zvýšená enzymová aktivita UM 3-5%, EM 70-80%, IM 10-15%, PM 7-10%
rozdílná metabolická aktivita enzymu mezi jedinci je dána polymorfismem v genu cyp2d6 doposud popsáno více jak 100 alel alely se stejnou klíčovou mutací se označují číslem (např. *6) písmeny se rozlišují další varianty alel se stejnou klíčovou mutací, ale různými doplňkovými mutacemi s minoritním funkčním významem (např. *6A, *6B, *6C, *6D) nejčastější jsou alely *1, *2, *4, *5, *10, *17 a *41 CYP2D6*1 je alela se standardní sekvencí genu stejně jako další alely (*2, *33, *35) kóduje protein s normální enzymatickou funkcí gen CYP2D6 má značnou interetnickou variabilitu
Nulové alely CYP2D6*0 - kódují nefunkční protein - v homozygotním stavu způsobují fenotyp pomalého metabolizátora bodové mutace (alely *3, *4, *6, *8, *11, *15, *19, *20, *38, *40, *42) velké chromozomové delece (alely *5, *13, *16) mutace vedoucí ke ztrátě f-ce proteinu, ale délka zachována (alely *7, *12, *14, *18) - alela *4 (12-21%) v kavkazské populaci nejčastější nulová alela - 1846G>A - alela *5 (2-7%) dochází ke ztrátě celého genu CYP2D6 - alely *13 a *16-5 -CYP2D7P/CYP2D6-3 hybridní geny, vznik delecí různých částí lokusu CYP2D
Nulové alely Alely spojené se sníženou enzymovou funkcí kódují enzym s redukovanou aktivitou v homozygotním stavu nebo spolu s nulovou alelou v heterozygotním stavu způsobují fenotyp IM např. CYP2D6*9, *10, *17, *36, *41 *10 (50-70% asiaté, 1-5% kavkazská populace) 100C>T (naruší místo nezbytné pro sbalení proteinu enzym je velmi nestabilní a má sníženou afinitu k substrátu) Alely spojené se zvýšenou enzymovou funkcí
Nulové alely CYP2D6*0 Alely spojené se sníženou enzymovou funkcí Alely spojené se zvýšenou enzymovou funkcí - zvýšený počet aktivních genových kopií - alely *1, 2*,35* - frekvence genové duplikace je v kavkazské populaci 1-5%
in vivo - metabolické schopnosti jedince se zjišťují po podání testovací látky (substráty pro CYP2D6 dextrometorfan, spartein) na základě tzv. metabolického poměru (MR) - v ČR se MR definuje jako poměr koncentrace podaného léku (dextrometorfan) ke koncentraci jeho metabolitů (dextrorfan), které se objeví v moči během určité doby od podání testovací látky - koncentrace se stanovuje pomocí chromatografických metod
molekulárně genetická detekce alel cyp2d6 - metody analýzy délky restrikčních fragmentů (Skoda, 1988) - vyhledávací metody jednovláknového konformačního polymorfismu (Broly, 1995) - alelově specifická polymerázová řetězová reakce (Daly, 1995) - syntéza dlouhých úseků - long-pcr (Sachse, Daly,Løvlie, Panserat ) - real-time PCR (Stamer, 2002) - kvantitativní metody s TaqManovými sondami (Bodin, Beaune, Loriot ) -přímá sekvenace (James, 2004) - SNaPshot (Sistonen, 2005) - AmpliChip CYP450 (Roche, Affymetrix, 2004)
variabilita v aktivitě CYP2D6 vede k individuálním rozdílům v terapeutické účinnosti léčiv PM nejsou schopni metabolizovat substráty CYP2D6 při běžně podávané dávce mají ve srovnání s EM vyšší koncentrace léku vplasmě zvýšené riziko předávkování výskyt vedlejších efektů. UM je koncentrace léku v plasmě mnohem nižší než je terapeuticky účinná koncentrace nedochází k žádné terapeutické odpovědi klinický význam polymorfismu pro konkrétní léky není vždy jasný a závisí na několika faktorech
Psychiatrie - 50% běžně užívaných antipsychotik - 50% antidepresiv vedlejší účinky u PM - schizofrenie Léčba rakoviny - tamoxifen N-desmethyltamoxifen endoxifen (antiestrogenní aktivita) Molekulární epidemiologie - PM jsou delší dobu vystaveni toxickým efektům přijatých sloučenin než EM náchylnější ke vzniku rakoviny - naopak při metabolické aktivaci prokarcinogenů jsou většímu riziku vystaveni EM a UM Kardiovaskulární onemocnění
dlouhodobá mezioborová spolupráce optimalizace stávajících metod detekce mutací - zavedení metody Real-Time PCR pro rychlou detekci PM - kvantifikace CYP2D6 genu detekce delecí a duplikací (Müller, Zöpf, 2003) výzkumné účely vyšetření při neadekvátní odpovědi na léčbu (nedostatečná odpověď UM, špatná snášenlivost PM) => individuální dávkování léčiv??
Frekvence 7-10% v kavkazské populaci Žádná nebo velmi nízká aktivita enzymu p450 zvýšené riziko předávkování výskyt vedlejších efektů *3, *4, *6, *8, *11, *15, *19, *20, *38, *40, *42, *44, *5, *13, *16, *7, *12, *14, *18
Frekvence 7-10% v kavkazské populaci Žádná nebo velmi nízká aktivita enzymu p450 zvýšené riziko předávkování výskyt vedlejších efektů *3, *4, *6, *8, *11, *15, *19, *20, *38, *40, *42, *44, *5, *13, *16, *7, *12, *14, *18 4*1846 A>G 6*T1707del 8*1758G>T 3* A2549del 7*2935 A>C
T1707del 1758G>T 1846 A>G
*6 *4 *8
Filtr F2 4*wt Tm=52.0 C 6*wt Tm=71.5 C 4*1846G>A Tm=61.2 C 6*T1707de Tm=65.4 C
Filtr F3 8*wt Tm=55.0 C 8*1875G>T Tm=63.0 C