CLP ANALYSIS OF MOLECULAR MARKERS AFLP ANALYSIS CZECH VERSION

CLP ANALYSIS OF MOLECULAR MARKERS AFLP ANALYSIS CZECH VERSION

AFLP ANALÝZA *** Technika AFLP (Amplification Fragment Lenght Polymorphism - polymorfismus délky amplifikovaných fragmentů) je modifikací RFLP, která pro konečné zviditelnění fragmentu používá PCR. Dochází tak ke kombinaci specifičnosti restrikčního štěpení se snadností PCR. Tato metoda spočívá v selektivní amplifikaci sub-souboru restrikčních fragmentů po štěpení celkové genomové DNA restrikčními enzymy. Polymorfismus se zjišťuje na základě rozdílů ve velikosti amplifikovaných fragmentů po separaci na PAGE. Oproti metodám RFPL a RAPD má řadu výhod, mezi nejdůležitější patří generování velkého množství markerů. Kromě využití pro identifikaci genotypů kulturních rostlin je cílena zejména pro účely mapování významných kvalitativních a kvantitativních znaků. Tato metoda nachází uplatnění také při studiu biodiverzity a přípravě markerů. AFLP generuje dominantní markery a představuje velký počet signálů v jedné reakci. 25

AFLP protokol Pozn. Označení STOP krok znamená, že v tomto kroku je možné sled reakcí přerušit. Polymeráza není součástí kitu. 1. Restikční štěpení genomické DNA komponenty kontrola μl vzorky μl 5X reakční pufr 5 5 kontrolní DNA rajčete (100ng/μl) 2,5 - DNA vzorku (250ng v 18μl) - 18 EcoR I/Mse I 2 2 destilovaná voda 15,5 doplnit 25 celkový objem μl 25 25 Všechny komponenty smícháme v 1,5 ml eppendorfce a krátce centrifugujeme. Vzorky necháme inkubovat 2 h při 37 C. Po inkubaci zahřejeme vzorky na 15 min. na 70 C, aby došlo k inaktivaci restrikčních enzymů. Vzorky dáme na led a po té krátce centrifugujeme. 2. Ligace adaptorů Ke vzorkům po restikčním stěpení přidáme: komponenty objem μl adapter ligation solution 24 T4 DNA ligase 1 Vzorky promícháme při pokojové teplotě, krátce centrifugujeme a potom inkubujeme 2 h při 20 C. Ředění 1:10 Ze vzorků po ligaci odebereme 10μl reakční směsi a přidáme 90μl TE pufru, dobře promícháme. Zředěné i nezředěné vzorky uchováváme při 20 C pro další použití. STOP krok 26

3. Preamplifikační reakce komponenty objem μl zředěný templát DNA 5 pre-amp primer mix 40 10X PCR pufr plus Mg 5 Taq DNA polymeráza (5U/μl) 1 celkový objem μl 51 Vzorky promícháme, krátce centrifugujeme a dáme preamplifikovat (program AFLP 1). Reakční cyklus: 20 cyklů: 94 C 30s 56 C 60s 72 C 60s Ředění 1:50 Ze vzorků po preamplifikaci odebereme 3μl reakční směsi a přidáme 147μl TE pufru, dobře promícháme. Zředěné i nezředěné vzorky uchováváme při 20 C pro další použití. STOP krok 4. Selektivní AFLP amplifikace Pozn. Pro neradioaktivní detekci nepoužíváme značení primerů radioaktivním fosforem 32 P nebo 33 P, ale ředíme primer EcoR I. Ředění primeru EcoR I: odebereme 18μl primeru a přidáme 32μl destilované vody. Mix 1 (na 10 vzorků) komponenty objem μl ředěný primer EcoR I 5 Mse I primer 45 celkový objem μl 50 Mix 2 (na 10 vzorků) komponenty objem μl destilovaná voda 79 10X PCR pufr plus Mg 20 Taq DNA polymeráza (5U/μl) 1 celkový objem μl 100 27

Z DNA, kterou jsme po preamplifikaci naředili 1:50, Mix 1 a Mix 2 připravíme reakční směs pro selektivní amplifikaci. komponenty objem μl DNA ředěná po preamplifikaci 1:50 a/nebo 5 kontrolní preamplifikavaná DNA rajčete (součást kitu) Mix 1 (primery/dntp) 5 Mix 2 (Taq DNA polymeráza/pufr) 10 celkový objem μl 20 Vzorky promícháme, krátce centrifugujeme a dáme amplifikovat (program AFLP 2). Reakční cyklus: 1 cyklus: 94 C 30s 65 C 30s 72 C 60s 12 cyklů: při, kterých během annealingu v každém kroku klesne teplota o 0,7 C, tzn. cyklus 2. 94 C 30s 64,3 C 30s 72 C 60s atd. 23 cyklů: 94 C 30s 56 C 30s 72 C 60s STOP krok Separace amplifikovaných produktů na sekvenační elektorforéze Po PCR přidáme ke vzorku (20μl) 16μl 98% formamidu a 4μl Loading buffer. Před nanášením na gel necháme vzorky denaturovat 3 min při 90 C (denaturaci opakujeme vždy před další separací na gelu). Po denaturaci vzorky zchladíme na ledu. 28

Příprava sekvenační elektroforézy Roztoky: Bind silane: 4 ml bind silane rozmícháme v 1 l ultračisté vody (lze opakovaně použít) Pozn. Při přípravě sekvenační elektroforézy a PAGE pracujeme pouze s ultračistou vodou (UHP water) Obě skla, která se používají pro sekvenační elektroforézu, spacery a hřeben důkladně umyjeme detergentem a pečlivě odstraníme případné zbytky gelu. Po osušení skel, spacerů a hřebenu, vše opláchneme v ultračisté vodě a po té ve 100% ethanolu. Spodní sklo (to, na kterém po ELFO zůstává gel) vložíme na 1 h do roztoku bind silane a necháme ho silanizovat tzn. že na skle se vytvoří vrstva, která po té váže gel. Sklo opláchneme ultračistou vodou a potom 100% ethanolem. Na vrchní sklo (to, které odpuzuje gel) nalijeme cca 5 ml repel silane, dobře rozetřeme po skle, tak aby po celé ploše vznikla tenká vrstva a necháme 15 min působit. Sklo opláchneme ultračistou vodou. Sestavení skel pro sekvenační elektroforézu Na spodní bind sklo položíme k dlouhým okrajům spacery a přiložíme vrchní repel sklo tou vrstvou, kterou jsme potřeli repel silane. Soupravu pečlivě urovnáme a spojíme svorkami na jedné z dlouhých a jedné z krátkých stran. Tu stranu, na které není žádná ze svorek důkladně zalepíme přes hranu izolepou, tak aby skla zůstala pevně spojena. Svorky přendáme a postup opakujeme na druhé nezalepené straně. Když jsou obě dlouhé strany zalepené, zalepíme spodní stranu skel. Dbáme na to, aby tato strana byla velmi pečlivě zalepená, jinak gel bude vytékat. Spodní rohy skel zalepíme dvakrát popřípadě třikrát. Příprava denaturačního PAGE DNA gelu Chemikálie: 10% persíran amonný: 0,1g do 1ml vody (připravujeme čerstvý před každou ELFO) 100ml gelu připravíme podle tabulky, vše smícháme, zahříváme ve vodní lázni při 55 C (pozor ochlazuje se) po dobu 3 min, objem doplníme do 100ml. 6% 8% 10% AC/BIS 30% ml 20 26,6 33,3 5X TBE ml 20 20 20 voda ml 24,7 18,1 11,4 močovina g 42 42 42 29

Z takto připraveného gelu odebereme 10ml přidáme 60μl 10% persíranu amonného a 5μl TEMEDU. Gel ihned nanášíme pipetou mezi skla, tak aby nevznikly žádné bubliny. Tato vrstva gelu má po ztuhnutí zabránit vytékaní zbývajícího gelu. Když spodní vrstva dobře ztuhne přidáme ke zbývajícím 90ml gelu 540μl 10% persíranu amonného a 45μl TEMEDU a pomocí střičky gel naneseme mezi skla, tak aby nevznikly žádné bubliny. Gel naneseme přesně k okraji vyříznutí vrchního skla, přebytečný gel odstraníme a přesah spodního skla očistíme, aby ne něm neulpívaly zbytky gelu. Hřeben zasuneme mezi skla asi 4mm hluboko tou stranou, na které nejsou zuby. Gel necháme ztuhnout. Trubičku ze střičky ihned umyjeme, aby v ní gel neztuhnul a neucpal ji. Pre-run sekvenační elektroforézy Když je gel dobře ztuhlý odstraníme izolepu ze spodní části, skla vložíme do vany a připevníme je k vaně pomocí svorek. Do vany nalijeme 1X TBE pufr a prázdný gel necháme cca 15 20 min běžet při 1800V. Vlastní elektroforéza Po pre-run vypneme proud, vyndáme hřeben a do štěrbiny, kterou hřeben v gelu vytvořil, naneseme Loading buffer, po té vsuneme zpátky hřeben tou stranou, na které jsou zuby, tak hluboko, aby hřeben vytvořil mezi skly sloty pro vzorky. Do slotů naneseme vzorky (které jsme těsně před tím denaturovali) cca 3-4μl a necháme ELFO běžet při 1800V (cca 1 h). Po doběhnutí ELFO vypneme proud, odpojíme zdroj (!!!) a vyndáme skla. Odstraníme izolepu, vyndáme spacery a opatrně od sebe odlepíme skla. Na spodním bind skle by měl zůstat gel. Barvení stříbrem Roztoky: Fix/stop solution (10 % kyselina octová): 100 ml kyseliny octové přimícháme do 900ml ultračisté vody Staining solution: 1 l ultračisté vody, 1 g AgNO 3, 1 ml formaldehydu Developing solution (vývojka): 30 g NaCO 3, 1 l ultračisté vody, těsně před použitím přidáme 1,5 ml formaldehydu a 200 μl 1 % thiosulfátu sodného 1% thiosulfát sodný: 0,01 g do 1 ml vody (připravujeme čerstvý před každou ELFO) 30

Spodní sklo, na kterém zůstal gel vložíme do fix/stop solution a 20 min oplachujeme a třepeme. V tomto roztoku může gel zůstat přes noc bez třepání. STOP krok Gel přeneseme do nové misky a 3krát 5 min dobře oplachujeme ultračistou vodou za současného třepání. Gel ponoříme do staining solution a 30 min barvíme a třepeme. Po barvení gel 15 s oplachujeme ultračistou vodou a po té ho vložíme do vychlazeného developing solution, ke kterému jsme přidali 1,5 ml formaldehydu a 200 μl 1 % thiosulfátu sodného. 6 7 min omýváme, dokud nejsou proužky dobře viditelné. Po zviditelnění proužků přeneseme gel zpět do fix/stop solution a 3 min necháme působit, aby došlo k ukončení vyvíjecí reakce. Gel 2krát 5 min omyjeme ve vodě. Gel překryjeme celofánem, necháme uschnout a po té oscanujeme. Získaný elektroforeogram je takto připraven k hodnocení. Všechny pomůcky důkladně umyjeme. 31

Příprava sekvenační elektroforézy - Piešťany Roztoky: Při přípravě sekvenační elektroforézy a PAGE pracujeme pouze s ultračistou vodou (UHP water) Obě skla, která se používají pro sekvenační elektroforézu, spacery a hřeben důkladně umyjeme detergentem a pečlivě odstraníme případné zbytky gelu. Po osušení skel, spacerů a hřebenu, vše opláchneme v ultračisté vodě a po té ve 100% ethanolu. Spodní sklo (to, na kterém po ELFO zůstává gel) potřeme roztokem Bind silane a necháme ho silanizovat tzn. že na skle se vytvoří vrstva, která po té váže gel. Roztok 3 ml vody + 40 µl led. kys. octové + 40 µl Bind Silane. Roztok naneseme pipetou na sklo, rozetřeme, po zaschnutí přetřít 100% ethanolem. Na vrchní sklo (to, které odpuzuje gel) nalijeme cca 2-3 ml Repel silane, dobře rozetřeme po skle, tak aby po celé ploše vznikla tenká vrstva, po zaschnutí přetřít 100% ethanolem. Sestavení skel pro sekvenační elektroforézu Na spodní bind sklo položíme k dlouhým okrajům spacery a přiložíme vrchní repel sklo tou vrstvou, kterou jsme potřeli repel silane. Soupravu pečlivě urovnáme a spojíme svorkami, zalepí se pouze horní okraje skel u uší. Příprava denaturačního PAGE DNA gelu Chemikálie: 6% 8% 10% AC/BIS 30% ml 20 26,6 33,3 5X TBE ml 20 20 20 voda ml 24,7 18,1 11,4 močovina g 42 42 42 Smíchat vodu, AC/BIS, TBE, nalít horký roztok močoviny (močovinu rozehřát v mikrovlnce), nechat vychladit v mrazáku, jinak moc rychle tuhne. k vychlazenému roztoku na 100 ml přidat 500 µl 10 % PSA + 150 µl TEMED. 10% persíran amonný: 0,1g do 1ml vody (připravujeme čerstvý před každou ELFO) Roztok nalijeme do mírně šikmých skel (2-3 cm šikmina), po nalití se položí do roviny, snad to ztuhne a nevyteče. Přes noc na skla položit vlhký filtrák, vatu a alobal. 32

Hřeben zasuneme mezi skla asi 4mm hluboko tou stranou, na které nejsou zuby. Gel necháme ztuhnout. Pre-run sekvenační elektroforézy Když je gel dobře ztuhlý odstraníme izolepu ze spodní části, skla vložíme do vany a připevníme je k vaně pomocí svorek. Do vany nalijeme 1X TBE pufr a prázdný gel necháme cca 15 20 min běžet při 1000V. Vlastní elektroforéza Vsuneme hřeben tou stranou, na které jsou zuby, tak hluboko, aby hřeben vytvořil mezi skly sloty pro vzorky. Do slotů naneseme vzorky (které jsme těsně před tím denaturovali) cca 3-4μl a necháme ELFO běžet při 1000V, 39 ma a 38 W. Nanášecí pufr LB: 4.8 g močovina, 10 ml voda, 0,05 g BPB, 10 µl 10 M NaOH, důkladně rozmíchat, min. 30 min., trvanlivost 2 týdny. LB se smíchá se vzorkem v poměru 1 : 1. Po doběhnutí ELFO vypneme proud, odpojíme zdroj (!!!) a vyndáme skla. Odstraníme izolepu, vyndáme spacery a opatrně od sebe odlepíme skla. Na spodním bind skle by měl zůstat gel. Barvení stříbrem Roztoky: Fix/stop solution (10 % kyselina octová): 200 ml kyseliny octové přimícháme do 1800ml ultračisté vody, vychlazené Staining solution: 2 l ultračisté vody, vychlazená, 2 g AgNO 3, 3 ml formaldehydu Developing solution (vývojka): 50 g NaCO 3, 2 l ultračisté vody, těsně před použitím přidáme 3 ml formaldehydu a 400 μl thiosulfátu sodného (10 mg/ml), vychlazený roztok, 6 min. před použitím do mrazáku 1% thiosulfát sodný: 0,01 g do 1 ml vody (připravujeme čerstvý před každou ELFO) Spodní sklo, na kterém zůstal gel vložíme do fix/stop solution a 25 min** třepeme. Gel přeneseme do nové misky a 2x 5 min** dobře oplachujeme vychlazenou ultračistou vodou (1 l). Gel ponoříme do staining solution a 25 min** barvíme a třepeme. Po barvení gel 10-15 s oplachujeme vychlazenou ultračistou vodou (2 l), velmi intenzivně se protřepává a po té ho vložíme do vychlazeného developing solution, ke kterému jsme přidali 3 ml formaldehydu a 400 μl thiosulfátu sodného. 5-6 min velmi intenzivně 33

protřepáváme, v chlaďáku, ve tmě, při červeném fotosvětle. Barvit do objevení se skvrn, pak fixovat fix/stop solution, 30 min, pak sušit. Všechny pomůcky důkladně umyjeme. ** velmi intenzivní třepání s velkou amplitudou Všechny pomůcky důkladně umyjeme. 34