KVANTITATIVNÍ ANALYTICKÉ METODY

KVANTITATIVNÍ ANALYTICKÉ METODY 1. absolutní (bezkalibrační) odměrná analýza (většina metod) vážková analýza (většina metod) coulometrie technika isotopového zřeďování detekce aktivity radionuklidu ID-MS 2. srovnávací (kalibrační) ostatní metody Srovnávací (kalibrační) metody Analytický signál Kalibrace Kalibrační funkce, citlivost Mez detekce, mez stanovitelnosti Analytická funkce 1

METODY ZALOŽENÉ NA INTERAKCI HMOTY A ELEKTOMAGNETICKÉHO ZÁŘENÍ Základní klasifikace 1. metody založené na interakci, při níž nedochází k výměně energie polarimetrie refraktometrie 2. metody založené na interakci s výměnou energie (spektrometrické metody) Elektromagnetické záření Vlnová délka λ [m], [µm], [nm] Vlnočet ν ν = 1/λ [m -1 ] λ [nm], ν = 10 7 /λ [cm -1 ] Kmitočet (frekvence) ν ν = c/λ [Hz] = [s -1 ] [khz], [MHz] c rychlost světla ve vakuu, c = (2,99792458 ±0,00000001).10 8 m s -1 Energie záření energie fotonu: E = h. ν = h. c/λ [J] h je Planckova konstanta, h = (6,626176±0,00000036).10-34 J s jednotka energie elektronvolt (ev): 1eV = 1,6021.10-19 J 2

Spektrální oblasti elektromagnetického záření Oblast spektra λ ν [cm -1 ] ν [Hz] E Metoda γ-záření 10-4 -10-2 nm 3.10 20-3.10 18 gama-spektrometrie rentgenová oblast <20 nm > 1,5.10 17 >60eV rentgenová absorpční a fluorescenční spektrometrie, ESCA, elektronová tvrdé záření <0,1 nm >12 kev mikroanalýza, PIXE měkké rtg. záření >0,1 nm ultrafialová (UV) 20-380 nm 5.10 5-26300 > 0,8.10 15 ultrafialová (UV) spektrometrie, vzdálená (vakuová) 20-190 nm 5.10 5 fluorimetrie, atomová absorpční (AAS), -52600 >1,5.10 15 emisní (AES) a fluorescenční (AFS) blízká 190-380 nm 52600-26300 spektrometrie viditelná (VIS) infračervená (IR) blízká střední vzdálená 400-800 nm (380-780) 0,8-1000 µm 0,8-2,5 µm 2,5-25 µm 25-1000 µm 25000-12500 26300-12820 12500-10 12500-4000 4000-400 400-10 >0,38.10 15 molekulová absorpční spektrometrie ve viditelné oblasti, kolorimetrie, AAS, AES Ramanova spektrometrie > 3.10 11 infračervená a Ramanova spektrometrie mikrovlnná oblast 1-100 mm 3.10 11-3.10 9 elektronová paramagnetická (spinová) resonanční (EPR, ESR) spektrometrie radiofrekvenční oblast desetiny až jednotky m 10 8 nukleární magnetická resonanční (NMR) spektrometrie 3

POLARIMETRIE je analytická metoda založená na měření optické otáčivosti opticky aktivních látek a jejich roztoků. Optická otáčivost je schopnost opticky aktivních látek otáčet rovinu lineárně polarizovaného světla o určitý úhel α vpravo (+) nebo vlevo (-). Optickou aktivitu vykazují látky s asymetrickou molekulou. Některé látky existují jako pravotočivé i levotočivé isomery. Základní vztah α = [α] λ t. l. c w [ <] t [α] λ je měrná otáčivost (specifická rotace) při teplotě t a vlnové délce λ l je délka měrné kyvety přístroje [dm] c w je hmotnostní koncentrace opticky aktivní látky [g/ml] Měrná otáčivost závisí na vlnové délce světla na teplotě (většinou mírně klesá s rostoucí teplotou) pro sacharosu platí v intervalu 5-30 C: [α] D t = +66,525-0,0144. (t-20) na koncentraci (mírně) pro roztoky sacharosy platí v intervalu 0,005-0,65 g/ml [α] D 20 = +66,435 + 0,87. c w - 2,35.10-2. c w 2 4

Obvyklé podmínky měření dublet spektrálních čar sodíkové výbojky (589,0 a 589,6 nm, označení D) teplota 20 C Za těchto podmínek se měrná otáčivost označení [α] D 20 a platí vztah α = [α] D 20. l. c w [ <]. Pravidlo o aditivitě otáčivosti Roztok dvou opticky aktivních látek A a B o hmotnostních koncentracích c wa a c wb vykazuje otáčivost, která je dána součtem příspěvků obou opticky aktivních složek: α = l. ([α] D 20 (A). c wa + [α] D 20 (B). c wb ) Měřící přístroje polarimetry sacharimetry schema polarimetru 5

Analytické využití polarimetrie Měrné otáčivosti běžných sacharidů Látka 20 [α] D Látka 20 [α] D dextrin +194,8 maltosa +137,5 D-fruktosa -93,78 rafinosa +123,01 D-galaktosa +80,47 sacharosa +66,53 D-glukosa +52,74 škrob +196,4 invertní cukr -20,59 xylosa +18,8 laktosa +55,3 Některá stanovení měření koncentrace jedné opticky aktivní látky v roztoku stanovení sacharosy ve směsi s invertním cukrem ve směsi s monosacharidem ve směsi s jiným oligosacharidem 6

REFRAKTOMETRIE je metoda založená na měření indexu lomu. Absolutní index lomu je poměr rychlosti světla ve vakuu k rychlosti v měřeném prostředí (vzorku) N = c/v λ Relativní index lomu je poměr rychlostí světla (vlnové délky λ) v prostředí 1 (vzduch) a 2 (vzorek) n = v λ1 / v λ2 = sin α/sin β α je úhel dopadu paprsku na fázové rozhraní β je úhel lomu paprsku N = 1,0000028. n Index lomu závisí na teplotě (u tuhých látek se n mění s teplotou jen málo) na tlaku (prakticky jen u plynů) na vlnové délce světla (n je přímo úměrný kmitočtu) na hustotě prostředí (koncentraci) Refraktometry: Pulfrichův Abbeův ponorný 7

Obvyklé podmínky měření teplota 20 C světlo wolframové žárovky nebo sodíkový dublet Analytické využití refraktometrie ověření čistoty látek (rozpouštědla, krystalické látky) měření koncentrace roztoků (směs EtOH + voda, vodný roztok sacharosy) refraktometrické stanovení sušiny Index lomu vodných roztoků sacharosy 1,52 1,5 1,48 1,46 1,44 n 1,42 1,4 1,38 1,36 1,34 1,32 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 % sacharosy univerzální detekce látek v kapalinové chromatografii (při použití isokratické eluce) 8

MOLEKULOVÁ ABSORPČNÍ SPEKTROMETRIE VE VIDITELNÉ A ULTRAFIALOVÉ OBLASTI (UV/VIS SPEKTROFOTOMETRIE) Synonymum: spektrometrie v oblasti elektronových spekter Podstata metody absorpce zářivé energie molekulami analytu při průchodu paprsku vzorkem valenční elektrony přechází na vyšší energetickou hladinu (přechod elektronu z vazebného orbitalu π nebo σ nebo z nevazebného orbitalu n do antivazebných orbitalů π* nebo σ*) absorpce je dána přítomností chromoforu v molekule Využívané spektrální oblasti blízká ultrafialová 190-380 nm viditelná 380-780 nm (některé přístroje 190-1100 nm) Absorpce v UV oblasti chromofory např. CH=CH CH=CH CH=CH >C=O >C=N N=N (nad 250 nm), aromatická jádra nasycené sloučeniny absorbují jen ve vakuové oblasti Absorpce ve viditelné oblasti sloučeniny chromofory: N=N, C=S, N=O v konjugaci s C=C a (heterocyklickými) aromatickými jádry vícejaderné aromatické a heterocyklické sloučeniny 9

Barevnost, komplementarita barev Vlnová délka světla Barva světla Barva roztoku 400-435 nm fialová žlutozelená 435-480 nm modrá žlutá-žlutooranžová 480-490 nm zelenomodrá oranžová 490-500 nm modrozelená červenooranžová 500-560 nm zelená červená-purpurová 560-580 nm zelenožlutá fialová 580-595 nm žlutooranžová modrá 595-610 nm červenooranžová zelenomodrá 620-760 nm červená modrozelená Uspořádání experimentu Veličiny v absorpční spektrometrii Transmitance τ = Φ/Φ 0 Absorbance A= -log τ = log (Φ 0 /Φ) Základní vztah Φ = Φ 0. 10 -εbc log Φ = log Φ 0 - ε λ. b. c log Φ 0 - log Φ = ε λ. b. c Lambertův-Beerův zákon A λ = log (Φ0/Φ) = ε λ. b. c A λ = log (Φ0/Φ) = a λ. b. c w ε λ [l.mol -1.cm -1 ] molární absorpční koeficient a λ [l.g -1.cm -1 ] (hmotnostní) absorpční koeficient 10

Absorpční spektrum A vs. λ ε vs. λ (nebo A resp. ε vs. ν) τ vs. λ (nebo τ vs. ν) Výběr podmínek pro spektrofotometrické měření přístroj (jedno a dvoupaprskový, λ= konst. nebo scan λ) vlnová délka (délky) druh kyvety šířka štěrbiny koncentrace absorbující látky a tloušťka kyvety druh rozpouštědla Kvantifikace výsledků měření 1) přímý výpočet koncentrace z absorbance a známé hodnoty absorpčního koeficientu: c = A/(b. ε λ ) [mol/l] 2) kalibrace a odečet z kalibrační křivky (výpočet z analytické funkce) 3) výpočet koncentrací z hodnot absorbancí a absorpčních koeficientů na základě aditivity absorbancí (multikomponentní analýza) 11

Základní součásti absorpčního spektrofotometru zdroj záření (180-360 nm deuteriová výbojka, nad 360 nm wolframová lampa) dispersní systém (monochromátor) kyveta se vzorkem (srovnávací kyveta) detektor (fotonásobič nebo DAD) 12

Analytické aplikace UV/VIS spektrofotometrie spektrální charakterizace neznámých látek fotometrická indikace při titracích s barevným indikátorem stanovení barevných látek přírodní barviva (anthokyany, chlorofyly ) syntetická barviva stanovení látek absorbujících v UV oblasti bílkoviny (aromatické aminokyseliny) nukleotidy a nukleové kyseliny některé vitaminy, kofaktory enzymů fenolové látky aromatické uhlovodíky heterocyklické sloučeniny (alkaloidy) stanovení neabsorbujících látek po jejich konverzi na látky absorbující substituční reakce: příprava 2,4-dinitrofenylderivátů aminokyselin (lysin) kondenzační reakce aminokyseliny + ninhydrin barevné produkty produkty dehydratace cukrů v kyselém prostředí + aromatická činidla (1-naftol, orcinol, anthron) barevné látky cholesterol + acetanhydrid + H 2 SO 4 modrozelené zbarvení nenasycené aldehydy + aromatický amin (p-anisidin) žluté zbarvení formaldehyd + acetylaceton + NH 3 žlutý diacetyldihydrolutidin 13

redoxní reakce vznik NADH+H + nebo NADPH+H + při dehydrogenaci substrátů pyridinovými dehydrogenasami redukce molybdatofosforečné kyseliny na molybdenovou modř (stanovení fosforu) komplexotvorné reakce stanovení kovů po reakci s chelatačními činidly (Fe 3+ +SCN - červené zbarvení Fe 2+ + 2,2 -bipyridyl červené zbarvení Cu 2+ + NaDDC žluté zbarvení ) stanovení bílkovin biuretovou metodou selektivní detekce v kapalinové chromatografii Poznámky automatizace spektrofotometrického měření využití spektrofotometrie pro studium chemických reakcí (rovnováhy, kinetika, stechiometrie) 14

MOLEKULOVÁ FLUORESCENČNÍ SPEKTROMETRIE patří mezi metody luminiscenční analýzy Luminiscenční jevy fluorescence fosforescence metody fluorimetrie a spektrofluorimetrie fosforimetrie Podstata fluorescence a fosforescence molekula absorbuje zářivou energii ze zdroje (vlnová délka λ 1 ) a dostává se do excitovaného stavu. Z excitovaného stavu do základního přechází vyzářením (emisí) fluorescenčního záření (vlnová délka λ 2 ) (Rozdíly: fluorescence: dosvit 10-9 -10-6 s fosforescence: dosvit 10-3 -10-2 s) Látky vykazující fluorescenci kondenzované vícejaderné aromatické a heterocyklické sloučeniny komplexy kovů s některými organickými ligandy Experimentální uspořádání schema spektrofluorimetru 15

Spektrum excitační emisní Kvantitativní vztahy Φ F = k. Φ abs = k. (Φ 0 -Φ) = k. Φ 0. (1-10 -εbc ) Φ F k. Φ 0. c (koeficient k v sobě zahrnuje také molární absorpční koeficient ε látky při vlnové délce excitačního záření a délku absorpční dráhy b) Analytické vlastnosti fluorimetrie vysoká selektivita vysoká citlivost omezený koncentrační rozsah horší robustnost Analytické aplikace fluorimetrie stanovení stopových množství PAH, vitaminů (riboflavin, thiamin ), porfyrinů, mykotoxinů, hormonů velmi selektivní a citlivá detekce těchto látek v kapalinové chromatografii 16

ATOMOVÁ ABSORPČNÍ SPEKTROMETRIE (AAS) je metoda prvkové analýzy založená na absorpci záření resonanční spektrální čáry prvku volnými atomy daného prvku. Měřená absorbance je funkcí koncentrace volných atomů v atomizovaném vzorku. Využívaná spektrální oblast: blízká ultrafialová až viditelná (čára As 193,7 nm, čára K 766,5 nm) Experimentální uspořádání a součásti spektrometru zdroj záření (výbojka s dutou katodou) optické prvky (zrcadla) absorpční prostředí (plamen, elektrotermický atomizátor) monochromátor zařízení pro korekci nespecifické absorpce detektor záření (fotonásobič) vyhodnocovací a řídící zařízení Schema dvoupaprskového AA spektrometru 17

Analytické aplikace AAS stanovení malých a stopových koncentrací kovů a některých polokovových a nekovových prvků (As, Se, Ge, Si, B) v roztocích. Vzorek se zpravidla převede do roztoku zředěné minerální kyseliny (HNO 3 nebo HCl) Pracovní techniky AAS plamenová AA spektrometrie (F AAS) AAS s elektrotermickou atomizací (ET AAS, GF AAS) technika generování hydridů (HG AAS) technika studených par (CV AAS) Plamenová AAS slouží k rychlému stanovení malých koncentrací prvků (setiny až desítky mg/l) citlivost charakteristická koncentrace roztok vzorku se kontinuálně nasává do zmlžovače a vytvořený aerosol se přivádí do plamene Plameny: C 2 H 2 -vzduch: stanovení alk. kovů, Mg, (Ca), (Cr), Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, Ga, Ru, Rh, Pd, Ag, Cd, In, Sb, Te, Ir, Pt, Au, (Hg), Tl, Pb, Bi C 2 H 2 -N 2 O: stanovení Be, Sr, Ba, Sc, Ti, Zr, V, Cr, Mo, W, Y, La, lanthanoidů, B, Al, Si, Ge, Sn, As, Se, Os, Re, U AAS s elektrotermickou atomizací slouží ke stanovení stopových a ultrastopových koncentrací prvků (setiny až stovky µg/l) jednorázová dávka vzorku (5-50 µl) odpaření rozpouštědla, termický rozklad a atomizace v grafitové kyvetě 18

INFRAČERVENÁ SPEKTROMETRIE založena na měření infračerveného (IR) záření absorbovaného vzorkem při průchodu paprsku vrstvou vzorku (transmisní měření, měřená veličiny transmitance, absorbance), nebo odraženého povrchem vzorku (reflexní měření, měřená veličina reflektance) měřené vzorky: tuhé (bez úpravy, KBr tablety), kapalné (filmy čistých látek, roztoky v CCl 4, CS 2, CHCl 3 ) absorpce IR záření změna vibračních a rotačních stavů molekul vibrace molekul valenční deformační Rozdělení oblastí IR záření a metod IR oblast λ = 0,8-1000 µm blízká infračervená oblast (NIR): λ = 0,8-2,5 µm střední infračervená oblast (MIR): λ = 2,5-25 µm (vlnočet 4000-400 cm -1 ) (vzdálená FIR: λ = 25-1000 µm) Aplikace IR spektrometrie poskytuje informace o molekulách obsažených ve vzorku (funkční skupiny, mezimolekulové interakce). NIR spektrometrie: kvantitativní nedestruktivní analýza hlavních složek vzorku (v potravinářské analýze: stanovení vody, bílkovin, tuků, sacharidů, vlákniny ) MIR spektrometrie: především identifikace organických látek; MIR spektrum látku charakterizuje, je možné z něj určit jaké funkční skupiny molekula obsahuje (oblast charakteristických vibrací 4000-1250 cm -1 ), příp. určit totožnost látky srovnáním s atlasem (knihovnou) spekter (porovnání také v tzv. oblasti otisku palce 1250-400 cm -1 ). V menší míře se MIR používá také ke kvantitativní analýze. 19

NUKLEÁRNÍ MAGNETICKÁ RESONANČNÍ SPEKTROMETRIE založena na absorpci vysokofrekvenčního elektromagnetického záření jádry určitých atomů vzorku umístěného v magnetickém poli nejčastěji využívaná jádra: nuklidy 1 H, 13 C, ( 19 F, 31 P, 35 Cl ) druhy NMR spekter podle nuklidu (fyzikálně rozlišeno nastavením frekvenční oblasti) 1 H-NMR: protonová (vodíková) spektra 13 C-NMR: uhlíková spektra 31 P-NMR podle rozlišení (vysoké, nízké rozlišení signálů ve spektru). NMR spektrum látky (intensita vs. chemický posun) charakterizuje příslušnou molekulu; obsahuje signály, jejichž počet, poloha (příp. štěpení signálu) a velikost (integrální hodnota) poskytují informace o počtu typů funkčních skupin, které obsahují atom daného druhu (nejčastěji atom 1 H) o konkrétním typu dané funkční skupiny o bezprostředním okolí dané funkční skupiny v molekule o počtu atomů daného druhu (např. 1 H) vázaných v molekule určitým způsobem resp. o množství látky. Aplikace NMR identifikace organických látek (doplňkový nástroj k infračervené a hmotnostní spektrometrii) kvantitativní analýza (např. stanovení vody, stanovení tuku, složení mastných kyselin, isotopové složení vzorků ). 20