MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ ZAHRADNICKÁ FAKULTA DIPLOMOVÁ PRÁCE. Využití antivirotik v procesu ozdravování rostlin. Vedoucí diplomové práce

MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ ZAHRADNICKÁ FAKULTA DIPLOMOVÁ PRÁCE Využití antivirotik v procesu ozdravování rostlin Vedoucí diplomové práce Ing. Břetislav Křižan, Ph.D. Vypracovala Lenka Hájková LEDNICE 2010

Prohlášení Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma: Využití antivirotik v procesu ozdravování rostlin vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém soupisu literatury. Souhlasím, aby práce byla uložena v knihovně Zahradnické fakulty Mendelovy univerzity v Brně a zpřístupněna ke studijním účelům. V Brně, dne 11. 4. 2010 Lenka Hájková 2

Poděkování Děkuji vedoucímu práce Ing. Břetislavu Křižanovi, Ph.D. za odborné vedení, ochotné konzultace a připomínky k mé diplomové práci. Dále bych ráda poděkovala Ing. Evě Ondrušikové, CSc. za pomoc při zakládání a v průběhu ozdravování rostlinného materiálu. Lenka Hájková 3

Obsah 1. ÚVOD 6 2. SOUČASNÝ STAV ŘEŠENÉ PROBLEMATIKY.. 7 2.1 Chemoterapie...7 2.2 Ribavirin 7 2.3 Metoda ELISA..8 2.4 Provedené pokusy s chemoterapií u ovocných dřevin a révy vinné 9 3. CÍL PRÁCE.. 20 4. MATERIÁL A METODY 21 4.1 Odrůdy broskvoní a meruněk použité v procesu ozdravování 21 4.2 Viry a fytoplazmy přítomné u ozdravovaných rostlin..25 4.3 Jednotlivé fáze léčby...29 5. VÝSLEDKY 32 6. DISKUZE 38 7. ZÁVĚR 42 8. RESUME 44 9. SEZNAM LITERATURY.45 4

10. PŘÍLOHY... 48 10.1 Seznam obrázků...48 10.2 Obrazová příloha některé klony po 1. aplikaci ribavirinu (foceno 6. 11. 2009)..49 10.3 Obrazová příloha některé klony po 2. aplikaci ribavirinu (foceno 12. 1. 2010)..52 5

1. ÚVOD Mezi rozšířená virová onemocnění napadající rod Prunus patří např. vir chlorotické skvrnitosti jabloně, vir nekrotické kroužkovitosti třešně, vir zakrslosti slivoně, etc. Způsobují vážná onemocnění ovocných stromů. Boj proti virovým chorobám je velice obtížný. Proto se při výsadbách preferují odolné či tolerantní odrůdy. Pro systémy certifikace a k zachování genetické informace existujících kultivarů ovocných dřevin je třeba získat viruprosté matečné rostliny. Jako standardní léčebný prostředek se využívá termoterapie. Termoterapie se zpravidla využívá k získání viruprostých rostlin z nakažených kultivarů. Úspěšnost eliminace viru závisí na typu viru, hostující rostlině a kombinaci virů při smíšené infekci. Termoterapie probíhá při vysokých teplotách 34 až 39 C. Tyto vysoké teploty řada rostlin nepřežije. Jako další léčebný prostředek se začíná využívat chemoterapie in vitro kultur. Během termoterapie dochází k úhynu velkého množství rostlin, proto se chemoterapie jeví jako přínosná metoda. Jedná se o aplikaci chemických preparátů s virostatickými účinky. Oproti termoterapii odpadá potřeba technicky náročného a drahého zařízení pro přesnou a dlouhodobou regulaci vysoké teploty. Nejčastěji používanou látkou s virostatickými účinky je ribavirin, starším názvem Virazol. Při chemoterapii se používá v různých koncetracích od 10 mg/l až po 100 mg/l. Příliš vysoké koncetrace ribavirinu však mohou působit fytotoxicky a může dojít k rozvoji nejrůznějších chloróz. Na základě provedených pokusů se jeví jako nejpřínosnější koncetrace 25 50 mg/l. Samozřejmě účinnost antivirotika závisí na druhu rostliny a na typu viru. Chemoterapie ribavirinem byla s pozitivními výsledky použita při eliminaci viru chlorotické skvrnitosti jabloně v in vitro kulturách u jabloně a hrušně. Dále při eliminaci viru žlábkovitosti kmene jabloně u in vitro kultur tabáku a jabloně. Také vedla k eliminaci hospodářsky závažných virů slivoně, etc. 6

2. SOUČASNÝ STAV ŘEŠENÉ PROBLEMATIKY 2.1 Chemoterapie Jednou z účinných metod ozdravování rostlinného materiálu je aplikace chemických preparátů s virostatickými účinky. Oproti bežně používaným metodám termoterapie není při použití chemoterapie potřeba technicky náročné a drahé zařízení pro přesnou a dlouhodobou regulaci vysoké teploty 34 39 C. Chemickou látku s virostatickými účinky lze přidat do používaných kultivačních in vitro médií pomocí antibakteriálních mikrofiltrů po autoklávování. Ozdravovaný rostlinný materiál je pak následně kultivován na médiu s virostatikem při obvyklé pěstební teplotě 22 26 C v běžné kultivační místnosti. Nejčastěji používanou antivirovou látkou při ozdravování rostlinného materíálu je syntetický analog guanosinu ribavirin, známý též pod starším názvem Virazol. (Paprštejn et al., 2007) 2.2 Ribavirin Ribavirin, také znám jako Virazol, je syntetická chemikálie. Chemicky se jedná o 1beta-D-ribofuranosyl-1-2-4-triazole-carboxamid. Poprvé byla chemikálie syntetizována v roce 1970 chemikem Joseph T. Witkowski. Z hlediska fyzikálního je ribavirin podobný cukru D-ribosa, ze kterého je odvozený. Je volně rozpustný ve vodě. Přídavek ribavirinu do kultivačních médií byl úspěšně využit pro eliminaci různých virů u bramboru a tabáku. Chemoterapie ribavirinem byla také s pozitivními výsledky použita při eliminaci viru ACLSV (Apple chlorotic leafspot virus) v in vitro kulturách jabloně a hrušně a při eliminaci viru ASGV (Apple stem grooving virus) u in vitro kultur tabáku. 7

Je aktivní proti řadě DNA a RNA virů. Zasahuje do duplikace genetického materiálu viru. (en.wikipedia.org, 7.4.2010) 2.3 Metoda ELISA ELISA, z angličtiny Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, někdy také označovaná jako EIA, z angličtiny Enzyme Immunoassay, je jednou z nejpoužívanějších imunologických metod sloužících k detekci protilátek. Metoda funguje na bázi imunoenzymatické reakce a lze s ní rovněž detekovat i antigen. ELISA využívá dvou základních vlastností imunoglobulinů. Za prvé je to schopnost proteinů (tedy imunoglobulinů) vázat se na povrch umělých hmot (např. polystyrenu) a v druhé řadě pak schopnost vázat enzymy na Fc fragmenty imunoglobulinových molekul. Pro průkaz specifických protilátek i antigenů existuje široké spektrum různých modifikací ELISA testu: Přímá ELISA - pro detekci antigenu. Nepřímá ELISA - pro deteci specifických protilátek. Přímá sendvičová ELISA - pro detekci antigenu. Nepřímá sendvičová ELISA - pro deteci specifických protilátek. Základní složky ELISA testu 1. Antigen o o 2. Protilátka o o detekovaný v testovaném vzorku známý, komerčně připravovaný detekovaná v testovaném séru známá, komernčně připravovaná 8

3. Konjugát o 4. Substrát o jedná se opět o protilátku proti protilátce (konkrétně proti druhově specifickým imunoglobulinům příslušného izotypu (proti IgG, IgM, IgA, viz protilátka), na kterou je navázaný enzym (konjugovaná enzymem) je chemická látka, která reaguje s enzymem a tím změní svou barvu Metody ELISA se využívají k diagnostice infekčních nemocí člověka a zvířat. Stanovují se buď protilátky proti konkrétnímu patogenu nebo se detekují přímo prionové, virové, bakteriální, parazitární antigeny. Dále se použivají k detekci některých toxinů, hormonů, celé řady proteinů, případně dalších bioaktivních látek. Vědci pracují i na vývoji metod ELISA pro kosmický výzkum, například k detekci forem života na Marsu. (cs.wikipedia.org, 7. 4. 2010) 2.4 Provedené pokusy s chemoterapií u ovocných dřevin a révy vinné Eliminace viru ACLSV z hrušně použitím in vitro termoterapie a chemoterapie In vitro množené výhonky hrušně Pierre Corneille, které byly infikovány ACLSV, byly vystaveny termoterapii při 36 C a/nebo chemoterapii s užitím Ribavirinu (Virazole) pro eliminaci viru. Přítomnost viru v regenerovaných částech rostlin byly zhodnoceny metodou ELISA během jednoho roku po terapii. Většina léčených výhonků hrušně zachránila termoterapie. Efekt chemoterapie závisel na koncentraci Virazolu. Výhonky, které byly léčeny 50 nebo 100 mg/l Virazolu vykazovaly chlorózy a nekrózy. Nejvyšší koncentrace této směsi, tedy 100 mg/l, se ukázala být fytotoxická pro většinu hrušňových výhonků. Téměř většina výhonků, které byly léčeny vysokou teplotou a zároveň 100 mg/l Virazolu uhynuly. Termoterapie umožnila vyhubit ACLSV z 22 % klíčních rostlin. ELISA testy neukázaly přítomnost ACLSV u 78 % a 88 % léčených 9

výhonků s použitím Virazolu v koncentracích 25 respektive 50 mg/l. Kombinace termoterapie a chemoterapie neposkytla lepší výsledky než chemoterapie samostatně. Termoterapie a chemoterapie in vitro jsou známy jako nejlepší nástroje pro eliminaci virů z různých odrůd ovocných stromů. Efekt obou metod silně závisí na odrůdě léčeného ovocného stromu a na druhu viru. ACLSV je nejsnáze eliminovatelný z jabloní termoterapií a chemoterapií. Hrušeň Pierre Corneille byla infikována virem ACLSV. Rostoucí výhonky byly oplachovány vodovodní vodou po několik hodin a následně sterilovány 70 % ethanolem po dobu jedné minuty, 0,1 % chloridem rtuťnatým po dobu 90 sec a potom proplachovány v destilované vodě. Laterální pupeny byly izolovány a umístěny do zkumavek obsahujících 10 ml media Murashige Skoog (dále jen MS) s přídavkem 0,05 mg/l kyseliny indoly-3-máselné (dále jen IBA), 0,5 mg/l 6 -benzylaminopurinu (dále jen BA), 30 g/l sacharózy a 7 g/l agaru. Pro lepší růst výhonků bylo médium MS obohaceno přídavkem 0,1 mg/l IBA a 0,5 1 mg/l BA. Médium bylo nastaveno na ph 5,6. Kultura byla pěstována v kontrolovaném prostředí s denní/noční teplotou 24/21 C a fotoperiodou 16 hod pod osvětlením 2 klux. Termoterapie Hrušňové výhonky byly ve stádiu bujení přemístěny do růstové komory, kde byla zvýšena teplota na 36 C a zde byly udržovány po dobu 3 týdnů. Neléčené výhonky byly pěstovány při denní/noční teplotě 24/21 C. Po ukončení termoterapie byly výhonky, které přežily, přemístěny, dány na čerstvé médium a dále udržovány v růstové komoře při teplotě denní/noční 24/21 C. Po 5 týdnech byly výhonky samostatně přemístěny na kořenující médium s přídavkem 2 mg/l IBA. Po zakořenění byly vysázeny a umístěny do skleníku. 10

Chemoterapie Chemoterapie byla provedena s použitím ribavirinu. Hrušňové výhonky byly odstraněny z proliferujích prýtů a přemístěny do léčivého média s přídavkem 10, 25, 50 nebo 100 mg/l ribavirinu. Výhonky rostly na tomto médiu 3 týdny. Po chemoterapii, výhonky dlouhé 1 cm, byly přemístěny na médium bez ribavirinu. Výhonky, které přežily, byly umístěny do sklenic s kořenujícím médiem. Došlo k zakořenění a následně byly vysázeny ve skleníku. Termoterapie a chemoterapie byly také kombinovány. Během pokusu byly pozorovány množství výhonků, které přežily. Experiment byl proveden třikrát. Detekce viru Přítomnost viru byla zhodnocena metodou ELISA 1 měsíc po léčbě a následně každé 2 měsíce po dobu 1 roku. Výsledky Většinu léčených výhonků zachránila termoterapie. Vliv ribavirinu záležel především na koncentraci použité směsi. Klíční rostliny léčené 50-100 mg/l ribavirinu vykazovaly chlorózy a nekrózy. Kombinací obou terapií se snížilo množství přeživších výhonků. Nejvyšší koncentrace ribavirinu, tzn. 100 mg/l, se ukázala být fytotoxická a vedla ke smrti téměř všech léčených rostlin, které byly současně léčeny termoterapií. Jako efektivní metoda pro odstranění ACLSV z hrušňových výhonků se jeví chemoterapie. Ribavirin v koncentracích 25-50 mg/l umožnil eliminovat ACLSV z většiny léčených rostlin. Kombinace chemoterapie a termoterapie neposkytla lepší výsledky než chemoterapie samostatně, spíše vedla k nižšímu množství přeživších rostlin. (Cieslinska, 2002) 11

Dlouhodobé zhodnocení efektu in vitro chemoterapie jako nástroje pro eliminaci žlábkovitosti kmene jabloně (dále jen ASGV). Výhonky Malus domestica byly infikovány ASGV a následně léčeny in vitro kombinací quercetinu a ribavirinu. Bylo použito 10 µg každého a léčba probíhala 9-12 týdnů. Následně byly testovány metodou polymerázové řetězové reakce v tzv. reálném čase (dále jen RT PCR). Kultury vykazující negativní přítomnost viru byly následně klonovány za účelem vysazení rostlin na poli. Po 3 letech od ukončení léčby a s pravidelnou kontrolou RT-PCR byl ASGV stále nepřítomen u vysazených rostlin. Pokus o eliminaci ASGV termoterapií byl neúspěšný. Léčené a neléčené výhonky Malus domestica, které byly infikovány ASGV, byly udržovány in vitro. Po chemoterapii s použitím antivirotik quercetinu a ribavirinu se neobjevily žádné nepříznivé fenotypové změny. Také nebyly prokázány žádné morfologické změny, proto se tato metoda léčby jeví jako užitečná při běžné léčbě rodu Malus pro eliminaci ASGV. (James, 2001) Aplikace termoterapie a chemoterapie in vitro za účelem eliminace některých virů napadajících ovocné stromy rodu Prunus sp. Termoterapie a chemoterapie in vitro byly použity k eliminaci ACLSV a k eliminaci viru PNRSV u myrobalánu, Prunus cerasifera var. divaricata Borgh. Dále byly využity k eliminaci PNRSV u švestky, Prunus domestica L. a viru PDV u třešně, Cerasus avium L. Moench. 12

ELISA testy provedené 1 rok po terapii ukázaly, že termoterapie in vitro byla velmi efektivní pro eliminaci PNRSV a ACLSV, ale nebyla to efektivní metoda pro eliminaci PDV u třešně. Ribavirin v koncentracích 25 100 mg/l byl účinný proti ACLSV u myrobalánu a PNRSV u švestky, ale neměl přínos pro eliminaci PNRSV u myrobalánu a PDV u třešně. Kombinací termoterapie a chemoterapie s užitím ribavirinu v koncentracích 50 100 mg/l došlo k eliminaci PDV u většiny léčených třešní a PNRSV u myrobalánu a švestky. Vyšší koncentrace ribavirinu byla fytotoxická, zejména u švestky. Ačkoli se termoterapie zpravidla využívá k získání viruprostých rostlin (dále jen VF) z nakažených kultivarů, několik vědců se také zabývalo použitím antivirové směsi pro tento účel. Byly porovnávány účinky termoterapie při teplotách 38/28 C po dobu 28 dnů, chemoterapie s použitím 20 mg/l ribavirinu a kombinace termo- a chemoterapie pro eliminaci PNRSV u švestky in vitro. Nejvíce efektivní se zdála být kombinace terapií. Úspěšná termoterapie in vitro byla zjištěna pro eliminaci PNRSV, PDV, ACLSV a viru PPV u některých peckovin. Aktivně rostoucí výhonky byly odděleny od infikovaných rostlin. Do zkumavek byly umístěny izolované laterální pupeny. Zkumavky obsahovaly 10 ml média MS s přídavkem IBA, BA, sacharózy a agaru. ph bylo nastaveno na 5,6. Kultury byly udržovány v růstové komoře při denní/noční teplotě 24/21 C a fotoperiodě 16 hod. Světelná intenzita byla 2 klux. Ribavirin byl použit jako protivirová směs během chemoterapie. Bylo využito koncentrací 10, 25, 50 a 100 mg/l. Přítomnost viru byla hodnocena metodou ELISA. Ať už před začátek léčby, tak 2 měsíce a následně 1 rok po léčbě. Koncentrace 10-25 mg/l ribavirinu neměla žádné znatelné výsledky. Vyšší koncentrace, tzn. 50 100 mg/l se jevila jako fytotoxická, zejména pro švestky. Výhonky vykazovaly chlorózy a nekrózy a většina jich během chemoterapie zahynula. Myrobalán a třešně vykazovaly větší toleranci k vyšším koncentracím ribavirinu. 13

Ribavirin v koncentracích 25 100 mg/l byl efektivní pro eliminaci ACLSV u myrobalánu a PNRSV u švestky. Avšak, nezávisle na použité koncentraci, bylo nemožné eliminovat PNRSV u myrobalánu a PDV u třešně. Kombinací termoterapie a chemoterapie s užitím 50 100 mg/l ribavirinu došlo k eliminaci PDV u třešní. Také kombinací terapií bylo umožněno eliminovat PNRSV u myrobalánu a švestky. Během tohoto experimentu došlo k úspěšné eliminaci ACLSV u myrobalánu a PNRSV u švestky s použitím ribavirinu v koncentracích 10-100 mg/l. Avšak, použití této směsi samostatně nevedlo k získání VF rostlin myrobalánu po infikaci PNRSV a PDV. Ribavirin v koncentracích 25, 50 a 100 mg/l byl efektivní v eliminaci ACLSV u 50-100 % Prunus mahaleb. Lepších výsledků bylo dosaženo kombinací termoterapie a chemoterapie. Kombinace termoterapie s ribavirinem v koncentraci 10 mg/l nebyla příliš úspěšná. Jako nejlepší kombinace se jevila termoterapie a 25 mg/l ribavirinu. Avšak výsledek závisí na hostující rostlině a dalších již zmíněných faktorech. Vyšší koncentrace ribavirinu způsobily u většiny rostlin chlorózy a byly fytotoxické. (Cieslinska, 2007) Regenerace VF rostlin Vitis vinifera cv. Zalema in vitro chemoterapií po infekci virem roncetu révy vinné (dále jen GFLV) In vitro chemoterapie s využitím ribavirinu nebo acycloviru byla využita k eliminaci GFLV u Vitis vinifera cv. Zalema. Ribavirin v dávce 20 mg/l eliminoval virus u 94 % in vitro množených výhonků a umožnil získat VF rostliny. Léčba ribavirinem neovlivnila růst rostlin, kořenící schopnost, počet kořenů a nezpůsobila chlorózy. Acyclovir ve stejné koncentraci byl neefektivní pro získání VF rostlin. Tradičním způsobem léčby je termoterapie. Dalším způsobem léčby pro získání VF rostlin z infikovaných je přidání antivirotik do růstového média. Pro chemoterapii byl použit ribavirin a acyclovir. Na základě vizuálních symptomů bylo vybráno několik výhonků révy infikovaných GFLV. 14

Přítomnost infekce byla následně potvrzena metodou ELISA. Explantáty z infikovaných výhonků o délce cca 10 15 mm byly desinfikovány ponořením do 70 % etanolu a následně do 12 % chlornanu sodného. Explantáty byly poté samostatně umístěny do sterilních zkumavek s 10 ml média VID a uzavřeny. Následně byly umístěny do růstové komory s teplotou 23 C, fotoperiodou 16 hod a zde ponechány do doby utváření nových výhonků (cca 45 dnů). Výsledky ukázaly rozdílný vliv antivirotik na infikované rostliny. Léčba pomocí acycloviru neposkytla žádné VF rostliny. Naopak použitím ribavirinu došlo k získání 94 % VF rostlin. Při použití ribavirinu nebyly zřejmé žádné negativní důsledky na rostlinu, ale použití acycloviru mělo negativní efekt na růst rostlin, na délku kořenového vlášení a počet kořenů. Léčba acyclovirem způsobila u rostlin více apikálních nekróz, ale kupodivu méně chloróz než při použití ribavirinu. Závěrem lze říci, že ribavirin v dávce 20 mg/l, se ukázal být jako vhodné antivirotikum pro získání VF rostlin. (Weiland et al., 2004) Termoterapie, chemoterapie a hydroponické kultury pro získání VF rostlin třešně Termoterapie se běžně využívá pro léčbu infikovaných rostlin třešně. Růst rostlin a procento přežití významně vzrostlo, jakmile byly rostliny pěstovány hydroponicky. Tato kultura umožnila prodloužit dobu působení termoterapie. Efektivita termoterapie byla následně zvýšena přidáním antivirotik do hydroponické směsi. Experimentálně došlo k vytvoření vhodných podmínek pro růst třešní v hydroponii. Snahou bylo dopravit směs antivirotik přes kořenový systém po přidání do nutriční směsi. 15

Rok staré semenáče Prunus mahaleb a Prunus avium byly pěstovány v plastových nádobách obsahující perlit a následně byly očkovány dormantními pupeny třešně Prunus avium cv. Bing, která byla infikována PDV a PNRSV. Tyto rostliny byly udržovány v komoře při stanovené teplotě a osvětlení. Kořeny byly přerušovaně omývány vyživovacím roztokem obsahující makro- i mikroprvky. Bylo využito různých teplot, doby působení a dávky antivirotika. V prvním případě byla udržována konstantní teplota 25 C. Ve druhém případě byla udržována konstantní teplota 25 C a do nutriční směsi byla přidána antivirotika. V dalším případě teplota kolísala v časových intervalech, konkrétně každé 4 hodiny mezi 40 32 C. A v posledním případě také došlo ke kolísání teplot a do nutriční směsi bylo přidáno antivirotikum. Jako antivirotika ve výše zmíněných způsobech léčby byla použita ribavirin a dihydrotestosteron (dále jen DHT). Byly použity v koncentracích 100, respektive 400 ppm. Očkovance rostly velmi dobře ve všech výše uvedených případech. U některých rostlin, které byly udržovány při vyšších teplotách, se vyskytly chlorózy. Zvláště pak u rostlin, u kterých bylo do nutriční směsi přidáno antivirotikum. (Howell et al., 2001) Ozdravování slivoně od viru PPV pomocí in vitro kultur Pro léčbu chemoterapií byl použit strom slivoně Bluefree, který byl napaden PPV. Cílem bylo získat VF jedince pro šlechtitelský proces nebo uchování matečné rostliny této slivoně. V první fázi bylo potřeba adaptovat slivoň na in vitro prostředí a vypěstovat dostatečné množství klonů, protože v průběhu terapie může dojít ke ztrátám. Ve druhé fázi bylo třeba pěstovat připravené klony na médiu s přídavkem virostatika (ribavirinu). Ve třetí fázi, po ukončení chemoterapie, bylo třeba nechat rostliny, aby vytvořily základy kořenů a v poslední fázi byly převedeny z in vitro prostředí do substrátu. 16

Jednotlivé fáze: 1. adaptace na in vitro prostředí a příprava klonů pro terapii Pro slivoně bylo vhodné základní MS médium doplněné o fytohormony, sacharózu, vitamíny a zpevňující látku agar. Připravené médium bylo rozlito po 25 ml do erlenmayerových baněk, které byly uzavřeny hliníkovou fólií a sterilovaly se autoklávováním. 2. chemoterapie Bylo třeba připravit médium s obsahem virostatika (ribavirin). Čím více ribavirinu, tím kratší doba ozdravování. Od cca 40 mg/l se stává ribavirin pro rostliny fytotoxický. V pokusech došlo k testování tří různých koncentrací ribavirinu a lze konstatovat, že 10 mg/l média bylo 100 % účinné při délce terapie 13 týdnů. Ribavirin byl přidán přímo při přípravě média do roztoku. Chemoterapie byla ukončena pasážováním rostlin do média bez přídavku ribavirinu. Po chemoterapii bylo třeba provést testování rostlinných vzorků sérologicky ELISA testem a molekulárně RT-PCR. VF rostliny se musely převést z in vitro prostředí do substrátu. 3. tvorba kořenů Nyní bylo potřeba přimět rostliny v in vitro prostředí, aby začaly tvořit kořenový systém. Bylo třeba připravit nové médium. Opět bylo použito MS médium, ale zásadně bylo třeba změnit poměr auxinů a cytokininů, vitamínů a chelátu železa. Ochota tvořit základy kořenů je sezónní záležitost, především na jaře a na podzim. 4. převod do substrátu Ve třetí fázi došlo k vytvoření základů kořenů. Nyní bylo potřeba přimět šetrně rostliny k tomu, aby si začaly obstarávat ze substrátu živiny samy a některé látky dokonce syntetizovaly. 17

Celý proces chemoterapie může trvat až tři roky, přičemž výsledkem je 15 20 cm vysoký šlechtěnec a v této době není započítán čas, který je potřeba věnovat optimalizaci celé metody pro určitý kultivar či druh ovocné dřeviny. Chemoterapie ovocných dřevin je vhodnou metodou pro eliminaci virů a získání VF materiálu. Jak ukazují dosažené výsledky, tato metoda byť může být efektivní, ale je časově náročná. VF materiál může být využit pro biotechnologické postupy v rámci systému certifikace VF výsadbového materiálu ovocných dřevin. (Hauptmannová, 2009) Předběžné výsledky ozdravování jabloně a hrušně metodou chemoterapie in vitro Pro aplikaci in vitro chemoterapie byly vybrány dvě odrůdy jabloně ( Idared, Šampion ) a dvě odrůdy hrušně ( Lucasova, Max Red Barlett ). Testováním metodami ELISA a RT-PCR bylo zjištěno, že vybrané výchozí stromy jabloně jsou infikovány virem ACLSV a virem vrásčitosti kmene jabloně (dále jen ASPV). Odrůda Šampion byla navíc infikována virem ASGV. Ve stromech hrušně byla zjištěna přítomnost ASPV. Pomocí in vitro chemoterapie s využitím ribavirinu v dávce 20 mg/l, se podařilo získat u všech čtyř zkoumaných odrůd ozdravené klony od virů. Úspěšnost chemoterapie se přitom pohybovala mezi 68,4 % u viru ASPV u odrůdy hrušně a 100 % u viru ACLSV u odrůdy jabloně. Ze zkoumaných odrůd byla zaznamenána fytotoxicita použité koncetrace 20 mg/l ribavirinu u jabloně Šampion. Dosažené výsledky jsou předběžné. V průběhu let 2004 2005 byly z vybraných výchozích stromů založeny in vitro kultury. Během roku v intervalech 4 6 týdnů probíhalo pasážování a kultivace založených výchozích in vitro kultur na modifikovaných pevných agarových médiích typu MS s přídavkem 30 g/l sacharózy a 1,5 mg/l cytokininu BAP pro indukci multiplikace. In vitro kultury byly pěstovány v Erlenmayerových baňkách o objemu 100 ml s 25 ml růstového média. Během kultivace byly kultury umístěny v kultivační místnosti se standartním světelným a tepelným režimem 16 hodin světlo, 8 hodin tma, teplota 21 C. 18

Vlastní chemoterapie probíhala na stejném MS médiu, jaké bylo použíto pro indukci multiplikace. Termolabilní antivirotikum ribavirin bylo do média přidáno v koncetraci 20 mg/l po autoklávování v parním tlakovém sterilizátoru přes mikrofiltry. Explantáty určené pro chemoterapii byly odebrány ve formě růstových vrcholů o délce 5 10 mm z ustavených aktivně rostoucích in vitro kultur na multiplikačním médiu. Po jednom měsíci kultivace na médiu s ribavirinem bylo z ošetřovaných in vitro kultur odebráno 20 růstových vrcholů o délce 2 4 mm od každé použité odrůdy. Růstové vrcholy byly přeneseny na multiplikační MS médium s 1,5 mg/l BAP a umístěny do kultivační místnosti. Po jednom měsíci kultivace po chemoterapii bylo zaznamenáno přežití odebraných vrcholů. U odrůdy Šampion byl zaznamenán jeden odumřelý vrchol. U této odrůdy byl také zaznamenán největší počet slabě rostoucích, rostlin s příznaky nekróz a žlutooranžovým zabarvením listů, které nemohly být namnoženy a testovány RT PCR. Naopak u odrůdy Idared všechny vrcholy rostly a nebyly u nich pozorovány žádné negativní morfologické změny. U obou odrůd hrušně byl zaznamenán po chemoterapii pouze jeden vrchol, který se nepodařilo namnožit. U odrůdy Idared se podařilo chemoterapií pomocí ribavirinu odstranit viry ACLSV a ASPV u 19 z celkem 20 testovaných klonů. Jeden klon zůstal infikován virem ASPV. U odrůdy Šampion se podařilo chemoterapií odstranit viry ACLSV, ASPV a ASGV u 6 z celkem 8 testovaných klonů. U odrůdy hrušně Lucasova byl chemoterapií úspěšně odtraněn virus ASPV u 15 z 19 testovaných klonů. U odrůdy Max Red Bartlett se podařilo odstranit virus ASPV u 13 z 19 testovaných klonů. (Paprštejn et al., 2007) 19

3. CÍL PRÁCE Cílem práce je studium problematiky eliminace virů pomocí ribavirinu. Práce přináší zhodnocení účinků ribavirinu na jednotlivé druhy rostlin, u nichž již byla aplikace provedena. V praktické části, práce přináší výsledky ozdravování metodou chemoterapie u jednotlivých odrůd meruněk a broskvoní, u nichž byla testováním zjištěna přítomnost viru. Dále práce srovnává použité koncetrace ribavirinu. Práce rovněž shrnuje stav rostlin během ozdravování a procento přežití rostlin. 20

4. MATERIÁL A METODY 4.1 Odrůdy broskvoní a meruněk použité v procesu ozdravování Broskvoně Suncrest Obr. 1 Odrůda Suncrest (převzato z arbia.colweb.cz, 7.4.2010) Vznikla v USA křížením odrůd Alamar a Gold Dust, u nás registrována v roce 2004. Růst je střední. Plod je velký, atraktivní, karmínově červený, s pevnou žlutou dužninou, která je dobře oddělitelná od pecky. Chuť je sladká, aromatická, výborná. Je to velmi pozdní odrůda (zraje kolem 15. září). Odolnost proti nízkým teplotám je vysoká. Plodnost brzká, vysoká, pravidelná. Cresthaven Obr. 2 Odrůda Cresthaven (převzato z arbia.colweb.cz, 7.4.2010) 21

Původem je z USA, u nás registrována od roku 1988. Růst má bujný s hustou korunou. Plod je velký, kulatý, zářivě červené barvy. Dužnina je rozplývavá, šťavnatá, sladká, dobře oddělitelná od pecky. Má výbornou chuť. Jedná se o velmi pozdní odrůdu zrající kolem 20. září. Odolnost vůči nízkým teplotám je vysoká, plodnost velká a pravidelná. Redhaven Obr. 3 Odrůda Redhaven (převzato z arbia.colweb.cz, 7.4.2010) Vznikla v USA křížením odrůd Halehaven a Kalhaven, u nás byla registrována v roce 1963. Růst má bujný se širokou korunou. Plody jsou střední, kulaté, jemně ojíněné, karmínově červené. Dužnina je žlutá, oddělitelná od pecky, s chutí sladkou, aromatickou. Jedná se o středně raná odrůdu, zraje 5. -10. srpna. Odolnost proti nízkým teplotám v době květu je vysoká. Plodnost je brzká, velká, pravidelná, je to nejvíce rozšířená odrůda. Broskvoň - Prunus persica odrůda vzorek číslo infikace Cresthaven 115 PNRSV/PPV Cresthaven 119 PNRSV/PPV Cresthaven 118 PNRSV/PPV Redhaven 125 PNRSV Redhaven 141 PPV Redhaven 124 PNRSV Suncrest 78 ACLSV Tab. 1 Viry, kterými byly infikovány odrůdy broskvoní 22

Meruňky Bergeron Obr. 4 Odrůda Berberon (převzato z arbia.colweb.cz, 7.4.2010) Původem je z Francie, u nás se pěstuje klon vyselektovaný v Lednici na Moravě. Růst je slabý až středně silný, koruna je kulovitá. Plody jsou střední velikosti, kulovitě oválné. Barva je oranžově žlutá se světle červeným líčkem. Dužnina je sytě oranžová, pevná, chuť sladce navinulá, aromatická. Pecka je dobře odlučitelná od dužniny. Doba zrání je 8 až 10 dní po odrůdě Velkopavlovické. Odrůda nijak zvlášť netrpí chorobami ani škůdci. Ceníme si u ní odolnosti vůči nízkým teplotám ve dřevě i v květu. Velkopavlovická Obr. 5 Odrůda Velkopavlovická (převzato z arbia.colweb.cz, 7.4.2010) Původem je z České republiky. Jedná se o nahodilý semenáč, který byl povolen v roce 1954. Růst je bujný, koruna velká, větve velmi dobře obrůstají. Plody jsou velké, pravidelné, kulovitě oválné, barvy oranžové s růžovým až načervenalým líčkem. Dužnina je sytě oranžová, pevná, rozplývavá, velmi šťavnatá. Chuť je sladce navinulá, velmi dobrá. Pecka je dobře odlučitelná od dužniny. Doba zrání se pohybuje kolem 20. až 25. července. Odrůda je samosprašná a hodí se do všech meruňkářských oblastí. 23

Marlen Obr. 6 Odrůda Marlen (převzato z www.hruska-skolky-cz, 7.4.2010) Jedná se o středně ranou odrůdu. Doba začátku je kvetení střední. Vzrůstnost je středně silná až silná, habitus stromu je otevřený. Plod má středně velký, z bočního i čelního pohledu trojúhelníkovitý. Podle švu převážně nesouměrný, povrch je slabě hrbolkovitý. Slupka je slabě plstnatá, její základní barva je oranžová s malým až středně velkým středně červeným líčkem. Dužnina je oranžová, středně tuhá, středně šťavnatá. Pecka je obdélníkovitá, pouze velmi slabě až slabě přilnavá k dužnině. Jádro je sladké. (Nesrsta et al, 2005) Meruňka - Prunus armeniaca odrůda vzorek číslo infikace Marlen 48 PDV+ESFY Marlen 49 PDV+ESFY Leskora 22 PNRSV/PPV Bergeron 27 PNRSV/PPV Velkopavlovická 61 ACLSV Velkopavlovická 56 ACLSV Tab. 2 Patogeny, kterými byly infikovány odrůdy meruněk 24

4.2 Viry a fytoplazmy přítomné u ozdravovaných rostlin ACLSV z ang. Apple chlorotic leafspot virus, vir chlorotické skvrnitosti listů jabloně (dále jen ACLSV). K přenosu viru dochází vegetativním množením (roub, očko, vegetativní podnož). Trvale latentní onemocnění jabloně je většinou bez příznaků. Výjimečně se může vyskytnout rzivost slupky plodů, dále na listech světlezelené skvrny, kresby a mírné deformace listů. Na listech hrušně se vyskytují světlezelené, později žlutozelené nepravidelné kroužky, skvrny a kresby. Dochází k nekrotizaci napadených míst, deformaci listů, okraje mají zvlněné a často se trhají K napadení virem může dojít u jabloňe a hrušně. Dále může být napadena kdouloň, slivoň, meruňka, broskvoň, třešeň, višeň. PNRSV z ang. Prunus necrotic ringspot virus, vir nekrotické kroužkovitosti třešně (dále jen PNRSV). K přenosu viru dochází vegetativním množením, semeny a pylem. Na čepelích listů se nacházejí chlorotické ohraničené skvrny a kroužky. Postižená pletiva postupně nekrotizují a vypadávají. Vyskytuje se u třešně, višně, broskvoně, meruňky, slivoně. PDV z ang. Prunus dwarf virus, vir zakrslosti slivoně (dále jen PDV). Virus je jedním z ekonomicky nejzávažnějších virů peckovin obzvláště broskvoní, třešní, višní a mandlovníku, ale napadá i meruňky, slivoně, trnky a myrobalámy. Velmi často se vyskytuje ve směsných infekcích s viry mu příbuznými, jako například virem nekrotické kroužkovitosti slivoně, virem mozaiky jabloně, ale i s viry nepříbuznými, jako je virus šarky švestky, etc. 25

Virus zakrslosti slivoně byl pojmenován svými objeviteli H. E. Thomasem a E. M. Hildebrandem z Marylandského Zemědělského Ústavu (USA) v roce 1936. Přestože výskyt viru je na slivoni mnohem méně běžný než na jiných druzích rodu Prunus, jeho pojmenování se používá dodnes. Nejčastěji se vyskytuje na višních a třešních. Tento virus, ať již samotný nebo v kombinaci s jinými viry, může snížit výnos, dozrávání plodů a růst stromů. Navíc, je kromě vegetativního přenosu, přenášen pylem a semenem, což napomáhá jeho rozšíření. V současnosti je v ČR rozšířen převážně na trnkách, třešni a myrobalámu. Trnky často slouží jako přirozený rezervoár, z nichž mohou být pylem infikovány další druhy rodu Prunus. Napadené listy jsou zkroucené, žlutozelené, zelené podél hlavních žil. Může docházet k opadávání listů. U broskvoní a slivoní je původcem zakrslosti. Symptomy mohou být omezeny jen na část stromu (ve spodních částech listoví, nebo ve skupinách, nebo jen na jedné větvi). U některých odrůd meruněk byla zaznamenána gumovitost kmene. Rostlina infikovaná virem se již nedá léčit, neboť látky, které by dokázaly množení viru v rostlině inhibovat či úplně zastavit, jsou téměř vždy i pro rostlinu toxické. Podstata ochrany tedy tkví pouze v prevenci. Základem ochrany je zdravý výsadbový materiál. (Jarošová, 2009) PPV z ang. Plum pox virus, virus šarky švestky (dále jen PPV). Virus šarky švestky je nejškodlivějším virem peckovin v České republice a patří k nejrozšířenějším a nejškodlivějším rostlinným virům. Šarka švestky, choroba, kterou tento virus způsobuje, byla na švestkách poprvé popsána v Bulharsku v roce 1917. V Československu jsou první výskyty choroby tradovány z Chrudimska ve 40. létech minulého století, dokladovaná první vědecká pozorování šarky jsou z roku 1952 a byla publikována Prof. J. Smolákem a Ing. J. B. Novákem v roce 1956. 26

Vedle geografického šíření viru šarky švestky probíhá a pokračuje i rozšiřování hostitelského okruhu viru. Šarka švestky byla poprvé popsána na švestkách, o čemž svědčí i název viru. Ve třicátých létech 20. století byl virus šarky švestky zjištěn v Jugoslávii i na stromech meruňky, v roce 1963 byl poprvé popsán v Maďarsku na broskvoni, v roce 1988 byl prokázán na višni v Moldávii a v devadesátých létech na třešni v Itálii. Pokud jde o další druhy rodu Prunus, vyskytuje se na myrobalánu a trnce, které slouží jako rezervoáry infekce. V České republice byl výskyt viru šarky švestky prokázán v přírodě i v ovocných sadech na všech druzích peckovin vyjma třešně a višně. Je široce rozšířen ve stromech švestky a myrobalánu i v některých výsadbách meruňky a broskvoně. Na listech stromů meruňky infikovaných PPV se koncem května objevují difuzní skvrny a kroužky, případně dubolistová mozaika. V případě náchylných odrůd tyto skvrny žloutnou a jsou výrazné až do konce vegetačního období. Na plodech stromů se zvýšenou rezistencí k viru se objevují nečetné mírné difuzní skvrny, případně kroužky a to jen na malé části plodů. Na plodech odrůd meruňky silně náchylných k šarce se objevují intenzivní difuzní skvrny, deformace a malformace. Malformované plody mohou opadávat a v případě deštivého období v době zrání získávají nemocné plody blátivou konzistenci a jsou nepoživatelné. Na peckách plodů z nemocných stromů se vytvářejí tmavé kroužky. Na listech stromů odrůd broskvoně se zvýšenou odolností k PPV jsou jen obtížně rozeznatelné příznaky. Mírné prosvětlení žilek se objevuje zpravidla jen na prvním listu rostoucího výhonu. Příznaky jsou pozorovatelné koncem května a počátkem června, později tyto listy opadávají a v červenci již nelze na listech zjistit žádné příznaky. Na listech náchylných odrůd broskvoně vzniká vedle žilkovitosti mozaika nebo dubolistová mozaika. Příznaky se vytvářejí na prvním až pátém, nejvýše šestém a sedmém listu rostoucího výhonu. Na dalších listech příznaky nevznikají. I v tomto případě listy s příznaky šarky v červnu žloutnou a opadávají. V červenci lze zjistit příznaky na malém počtu listů jen u nejnáchylnějších odrůd. 27

V případě broskvoní nebyla zjištěna žádná odrůda velmi rezistentní k šarce, ale pouze středně rezistentní odrůdy, kde je kvalita plodů jen minimálně ovlivněna. Mírné difuzní skvrny a kroužky vznikají jen na 10 15 % plodů, většina plodů je bez příznaků. Naproti tomu na plodech velmi náchylných odrůd broskvoně vznikají intenzivně zbarvené skvrny a kroužky. (Polák, 2008) ESFY z ang. European stone fruit yellows phytoplasma, fytoplasma evropské žloutenky peckovin (dále jen ESFY). Fytoplazma je prokaryotický mikroorganismus bez buněčné stěny, obalený pouze jednotkovou buněčnou membránou. Fytoplazmu je možné detekovat molekulárně genetickou metodou PCR a následně určit metodou RFLP. Rozmnožuje se pučením, dělením, fragmentací vláken a to jak ve floému rostlin, tak i ve vnitřních tkáních hmyzích vektorů. ESFY byla zatím prokázána u rodu Prunus a u Corylus avellana. Fytoplazma způsobuje v závislosti na hostiteli abnormální růstové změny, které jsou důsledkem odběru zásobních látek. Charakteristickým projevem poruch metabolismu je syntéza chlorofylu v okvětních lístcích květů, které jsou následkem toho zelené. Dalším symptomem jsou různé transformace květních orgánů v listy a abnormální prodloužení květní stopky. Hlavními symptomy jsou pak redukce listů, předčasné vadnutí a zejména žloutenka a svinutka listů. (Krška et al., 2006) 28

4.3 Jednotlivé fáze léčby adaptace na in vitro prostředí a příprava klonů pro terapii Z vypěstovaných rostlin, u kterých byla testováním zjištěna přítomnost alespoň jednoho z následujících virů: ACLSV, PNRSV, PDV, PPV a ApMV, byl odebrán rostlinný materiál. Odběr letorostů byl prováděn od dubna do června. Odebírány byly bylinné, aktivně rostoucí letorosty, dlouhé 80 300 mm. Při odběru byly zahradnické nůžky vždy u každé další rostliny dezinfikovány 70% etanolem, aby bylo zabráněno případnému přenosu patogenů a endogenních infekcí. Letorosty byly označeny čísly jednotlivých rostlin, aby nemohlo dojít k jejich záměně a bylo zřejmé, z které matečné rostliny pocházejí. Vždy došlo k odebrání cca 5 mladých letorostů i s listy od každé odrůdy. Následně byly v laboratoři z letorostů odstraněny listy (ponechány byly pouze cca. 10 mm dlouhé řapíky), a pro další zpracování byly použity jednotlivé nodální segmenty. Povrchová desinfekce rostlinného materiálu byla provedena 0,2 % chloridem rtuťnatým. Před pasážováním do boxu byl rostlinný materiál třikrát propláchnut sterilní destilovanou vodou. Po desinfekci byly segmenty výhonků upraveny na nodální explantáty. Řezné plochy segmentů byly poškozeny desinfekčním činidlem, proto byly odříznuty koncové části explantátu (cca 3-4 mm). Řapík byl rovněž zkrácen na 3-5 mm. Poté byly explantáty umístěny do kultivačních nádob. Nodální explantáty byly do živného média zapichovány tak, aby úžlabní meristém, krytý řapíkem, zůstal neponořen. Jako médium bylo použito Shenk & Hildebrandt (1972), (dále jen SH), doplněné o další složky. Připravené médium bylo rozlito po 3 ml do zkumavek, které byly uzavřeny hliníkovou fólií a které byly sterilovány autoklávováním. Další manipulace s médiem probíhala v laminárním boxu. Řádně označené zkumavky s rostlinami byly umístěny do kultivační komory, kde byla udržována teplota 24 o C, fotoperioda 16/8 a světelná intenzita 22 µmol m -2 s -1. 29

Vždy po cca 4 týdnech došlo k výměně média. V průběhu 2 měsíců došlo k získání potřebného množství klonů. To znamená cca 60 až 70 ks od každé léčené odrůdy. Množství získaných klonů je uvedeno v tabulce č. 5. mg/ l média mg/ l média 1. SH 3. sacharóza 30000 KNO 3 2500 4. BA 0,5 MgSO 4. 7H 2 O 400 5. GA3 0,5 NH 4 H 2 PO 4 300 6. NAA 0,01 CaCl 2. 2 H 2 O 200 7. FeSO 4. 7H 2 O 50 MnSO 4.4H 2 O 13,2 8. Na 2 EDTA.2H 2 O 55 ZnSO 4.7H 2 O 1 9. inozitol 100 H 3 BO 3 5 10. Z4 vitaminy KI 1 thiamin 1 CuSO 4.5H 2 O 0,2 pyridoxin 0,5 Na 2 MoO 4.2H 2 O 0,1 kys. askorbová 10 CoCl 2.6H 2 O 0,1 kys. nikotinová 0,5 glycin 2 2. agar 6000 kys. citrónová 10 Tab. 3 Chemické složení média (převzato z George et al, 1987) chemoterapie Po získání dostatečného množství klonů bylo připraveno médium s obsahem virostatika (ribavirin). Dostatečným množstvím klonů se rozumí průměrně 70 ks od každé léčené odrůdy. Jedná se o stejné základní SH médium s přidanými regulátory růstu BA 0,6 mg/l, NAA 0,01 mg/l. V pokusech došlo k testování tří různých koncentrací ribavirinu Ribavirin byl použit v koncentracích 10, 20 a 40 mg/l. Ribavirin byl přidán filtrací přímo do již sterilního média. Po dvou týdnech byly explantáty přeneseny na čerstvé médium. Léčba probíhala tři týdny. 30

Chemoterapie byla ukončena pasážováním rostlin do média bez přídavku ribavirinu. Po dobu 4 měsíců byly rostliny udržovány na médiu bez přídavku ribavirinu. Každé 3 týdny došlo k výměně média. Následně byla provedena druhá léčba na médiu s ribavirinem po dobu 1 měsíce. Po ukončení chemoterapie byly rostliny opět převedeny na médium bez přídavku ribavirinu. 31

5. VÝSLEDKY Následující tabulka ukazuje počty založených klonů od jednotlivých léčených odrůd meruněk a broskvoní. V tabulce je uvedeno číslo vzorku a také, které patogeny byly testovaním u jednotlivých rostlin zjištěny. Meruňka - Prunus armeniaca odrůda vzorek číslo infikace počet ks Marlen 48 PDV+ESFY 89 Marlen 49 PDV+ESFY 76 Leskora 22 PNRSV/PPV 70 Bergeron 27 PNRSV/PPV 93 Velkopavlovická 61 ACLSV 79 Velkopavlovická 56 ACLSV 77 Broskvoň - Prunus persica odrůda vzorek číslo infikace počet ks Cresthaven 115 PNRSV/PPV 49 Cresthaven 119 PNRSV/PPV 31 Cresthaven 118 PNRSV/PPV 40 Redhaven 125 PNRSV 39 Redhaven 141 PPV 33 Redhaven 124 PNRSV 40 Suncrest 78 ACLSV 36 Tab. 4 Stav rostlin k 11.5.2009 V průběhu růstu rostlinného materiálu na médiu SH došlo k úhynu některých rostlin, ať už v důsledku bakterióz či spálení vzrůstného vrcholu během sterilizace. Proto byly v červnu ještě dozaloženy další klony, aby bylo dosaženo dostatečného množství klonů pro následnou chemoterapii. 32

Počty dozaložených rostlin ukazuje následující tabulka, která zobrazuje množství rostlin před chemoterapií. Meruňka - Prunus armeniaca odrůda vzorek číslo infikace počet ks Marlen 48 PDV+ESFY 86 Marlen 49 PDV+ESFY 76 Leskora 22 PNRSV/PPV 67 Bergeron 27 PNRSV/PPV 90 Velkopavlovická 61 ACLSV 73 Velkopavlovická 56 ACLSV 77 Broskvoň - Prunus persica odrůda vzorek číslo infikace počet ks Cresthaven 115 PNRSV/PPV 51 Cresthaven 119 PNRSV/PPV 77 Cresthaven 118 PNRSV/PPV 69 Redhaven 125 PNRSV 52 Redhaven 141 PPV 63 Redhaven 124 PNRSV 71 Suncrest 78 ACLSV 54 Tab. 5 Stav rostlin k 23.6.2009 Léčba ribavirinem probíhala v období od 31.7.2009 17.8.2009. Rostliny jednotlivých odrůd byly umístěny na média s přídavkem ribavirinu. Ribavirin byl použit v koncentraci 10, 20 a 40 mg/l. Od každé odrůdy bylo použito vždy stejné množství rostlin pro koncentraci ribavirinu 10, 20 i 40 mg/l. Pro léčbu ribavirinem nebyly použity odrůdy Leskora (vzorek číslo 22) a Cresthaven (vzorek číslo 118), které neposkytly žádné použitelné rostliny. V průběhu růstu na médiu SH klony odrůd Cresthaven (vzorek číslo 118) a Leskora (vzorek číslo 22) uhynuly. 33

Tabulky ukazují stav rostlin po první léčbě ribavirinem. U jednotlivých odrůd jsou uvedeny počty rostlin, které přežily, a také procento přežití jednotlivých odrůd. Počty kusů resp. procento přežití jsou vždy vztaženy k použité koncentraci ribavirinu. Prunus armeniaca 1 2 3 4 5 odrůda Marlen Marlen Bergeron Velkopavlovická Velkopavlovická vzorek č. 48 49 27 61 56 počet ks po léčbě ribavirin [mg/l] 10 7 15 0 10 15 20 14 5 13 13 6 40 5 12 20 12 12 procento přežití [%] ribavirin [mg/l] 10 25 60 0 42 60 20 50 20 43 54 24 40 17 46 67 48 44 Tab. 6 Stav rostlin meruňky k 18.9.2009-1. léčba ribavirinem Prunus persica 1 2 3 4 5 6 odrůda Cresthaven Cresthaven Redhaven Redhaven Redhaven Suncrest vzorek č. 115 119 125 141 124 78 počet ks po léčbě ribavirin [mg/l] 10 11 11 4 13 5 10 20 6 0 5 12 23 21 40 0 4 5 11 25 12 procento přežití [%] ribavirin [mg/l] 10 65 44 24 62 22 56 20 35 0 29 57 100 100 40 0 15 29 52 100 80 Tab. 7 Stav rostlin broskvoně k 18.9.2009 1.léčba ribavirinem 34

Následující grafy ukazují procenta přežití jednotlivých klonů léčených odrůd meruněk a broskvoní po chemoterapii. Množství klonů je vždy vztaženo k použité koncentraci ribavirinu. Graf 1 Procenta přežití odrůd broskvoně po 1.léčbě ribavirinem. Jednotlivé odrůdy jsou označeny čísly 1 6 (viz. Tab. 7). Graf 2 Procenta přežití odrůd meruňky po 1.léčbě ribavirinem. Jednotlivé odrůdy jsou označeny čísly 1 5 (viz. Tab. 6). 35

Po absolvování první léčby ribavirinem byly rostliny opět přemístěny na médium bez ribavirinu, tedy základní SH médium. Zde byly ponechány až do doby druhé léčby ribavirinem. Druhá léčba ribavirinem proběhla od 16.12.2009 do 12.1.2010. Následující tabulka zobrazuje počet rostlin, které přežily druhou léčbu. Rovněž je zobrazeno procento přežití rostlin, opět vztaženo k příslušným koncentracím ribavirinu, který byl pro léčbu použit. Procento rostlin, které přežily, je vztaženo pouze k druhé léčbě ribavirinem. Prunus armeniaca odrůda Marlen Marlen Bergeron Velkopavlovická Velkopavlovická vzorek č. 48 49 27 61 56 počet ks před léčbou 86 76 90 73 77 počet ks po léčbě ribavirin [mg/l] 10 0 15 0 0 14 20 13 0 5 2 5 40 4 12 9 0 11 procento přežití [%] ribavirin [mg/l] 10 0 100 0 0 93 20 93 0 38 15 83 40 80 100 45 0 92 Tab. 8 Stav rostlin meruňky po absolvování obou chemoterapií ke dni 19.2.2010 Z hlediska přežití rostlin je pro odrůdu Marlen (vzorek č. 48) nejvhodnější koncentrace ribavirinu 20 mg/l. Pro odrůdu Marlen (vzorek č. 49) se jeví vhodnější koncentrace 10 mg/l. Odrůda Bergeron vykazovala nejvyšší procento přežití při použití koncentrace 40 mg/l. Pro odrůdu Velkopavlovická (vzorek č. 61) je vhodnější použít koncentraci 20 mg/l a pro odrůdu Velkopavlovická (vzorek č. 56) koncentraci 10 mg/l. 36

Prunus persica odrůda Cresthaven Cresthaven Redhaven Redhaven Redhaven Suncrest vzorek č. 115 119 125 141 124 78 počet ks před léčbou 51 77 52 63 71 54 počet ks po léčbě ribavirin [mg/l] 10 4 2 0 1 0 5 20 0 0 0 3 15 12 40 0 0 0 0 21 4 procento přežití [%] ribavirin [mg/l] 10 36 18 0 8 0 50 20 0 0 0 25 65 57 40 0 0 0 0 84 33 Tab. 9 Stav rostlin broskvoně po absolvování obou chemoterpií ke dni 19.2.2010 Na základě výsledků přežití jednotlivých odrůd je pro odrůdu Cresthaven (vzorek č. 115) vhodná koncentrace ribavirinu 10 mg/l. Pro odrůdu Cresthaven (vzorek č. 119) také 10 mg/l. U odrůdy Redhaven (vzorek č. 125) nedošlo k přežití ani jednoho klonu. Odrůda Redhaven (vzorek č.124) vykazovala nejvyšší procento přežití při koncentraci 40 mg/l a odrůda Suncrest při koncentraci 20 mg/l. 37

6. DISKUZE Ze zkoumaných odrůd meruněk se po obou aplikacích ribavirinu vyskytlo nejvyšší procento přežití léčených rostlin u odrůdy Velkopavlovická - 56, která byla infikována ACLSV, konkrétně 38,6 %. U broskvoní se nejvyšší procento přežití rostlin vyskytlo u odrůdy Redhaven - 124, která byla infikována PNRSV, a to 49 %. Procento přežití záleželo na použité koncentraci ribavirinu. Po 1. aplikaci ribavirinu se procento přežití rostlin pohybovalo u odrůd meruněk při použití koncentrace ribavirinu 10 mg/l od 25 60 %, průměrně 37,4 %. Při použití koncentrace 20 mg/l od 20 54 %, průměrně 38,2%. Použití koncentrace 40 mg/l vykazovalo výsledky přežití rostlin od 17 67 %, průměrně 44,4 %. Nejvyšší procento přežití vykazovala odrůda Velkopavlovická (vzorek č. 61). U odrůd broskvoní, při použití koncentrace 10 mg/l, bylo procento přežití od 22 65 %, průměrně 45,5 %. Při použití 20 mg/l byly výsledky přežití od 0 100 %, průměrně 53,5 % a při použití koncentrace ribavirinu 40 mg/l také od 0 100 %, průměrně 46 %. Nejvyšší procento přežití vykazovala po 1.aplikaci ribavirinu odrůda Redhaven (vzorek č. 124). Po 2. aplikaci ribavirinu se procenta přežití jednotlivých rostlin pohybovala u odrůd meruněk při použití koncentrace 10 mg/l průměrně 38,6%, u koncentrace 20 mg/l průměrně 45,8% a u koncentrace 40 mg/l průměrně 63,4%. Nejvyšší procento přežití vykazovala odrůda Velkopavlovická (vzorek č. 56). U odrůd broskvoní se procento přežití jednotlivých rostlin pohybovalo při použití koncentrace ribavirinu 10 mg/l průměrně 18,67%, u koncentrace 20 mg/l průměrně 24,5% a u koncentrace 40 mg/l průměrně 19,5%. Nejvyšší procento přežití druhé terapie vykazovala odrůda Redhaven (vzorek č. 124). Odrůdy meruněk vykazovaly po 1. aplikaci ribavirinu nižší procento přežití než odrůdy broskvoní. Ale po 2. aplikaci ribavirinu bylo vyšší procento přežití u odrůd meruněk. Může to souviset s viry a patogeny, kterými byly rostliny napadeny před chemoterapií. Můžeme se domnívat, že odrůdy broskvoní byly již viry natolik oslabeny, že druhou aplikaci ribavirinu nevydržely. 38

Jako druhá možnost se jeví, že odrůdy Cresthaven nesnáší vyšší koncentrace ribavirinu, neboť již od koncentrací 20 mg/l nevykazovaly žádné výsledky. Zajímavé je, že odrůda meruňky Bergeron, která byla infikována těmi stejnými viry, jako odrůda Cresthaven, přežila i koncentrace 40 mg/l. Je třeba také zmínit, že různých výsledků bylo dosaženo i u stejných odrůd. Např. odrůdy Marlen (vzorek č. 48 i vzorek č. 49) vykazovaly podobné výsledky v procentech přežití. Avšak odrůda Velkopavlovická (vzorek č. 56) oproti stejné odrůdě, ale vzorku č.61, vykazovala daleko vyšší procento přežití. Je to pravděpodobně způsobeno tím, že se jedná sice o stejnou odrůdu, ale odlišné klony. Také je zajímavé podívat se na odrůdu Marlen (vzorek č. 49), která při koncentracích 10 a 40 mg/l vykazovala vysoké procento přežití, ale při koncentraci 20 mg/l nepřežil žádný klon. Je možné, že tento úhyn nebyl způsoben ribavirinem, ale např. napadením plísní. Jako nejúčinnější koncentrace použitého antivirotika, tedy ribavirinu, se ukázala být u meruněk 40 mg/l a u broskvoní koncentrace 20 mg/l. Kromě odrůdy Cresthaven, která se chovala specificky a rostliny přežívaly pouze nejnižší použitou koncentraci ribavirinu. Úspěšnost chemoterapie byla nižší než u jiných provedených pokusů, avšak lze to připisovat dvojí aplikaci ribavirinu, kdy druhou aplikaci ribavirinu již většina rostlin nepřežila. Co se týká nejúčinnější koncentrace ribavirinu, tak bylo dosaženo podobných výsledků jako v zahraničí. Cieslinska (2002) obdržela 78 % a 88 % od viru ACLSV ozdravených in vitro výhonů hrušně při přídavku ribavirinu v koncentraci 25 a 50 mg/l do agarového MS média. Pro odstranění ACLSV z hrušňových výhonků se chemoterapie jeví jako efektivní metoda. Kombinace chemoterapie a termoterapie neposkytla lepší výsledky než chemoterapie samostatně, spíše vedla k nižsímu množství přeživších rostlin. 39

James (2001) úspěšně eliminoval pomocí ribavirinu virus ASGV z in vitro kultur jabloně Malus domestica. Po chemoterapii s použitím antivirotik quercitinu a ribavirinu se neobjevily žádné nepříznivé fenotypové změny. Také nebyly prokázány žádné morfologické změny, proto se tato metoda léčby jeví jako užitečná při běžné léčbě rodu Malus pro eliminaci ASGV. Weiland et al. (2004) obdržel při použití koncentrace 20 mg/l ribavirinu v růstovém médiu 94 % in vitro rostlin révy vinné odrůdy Zalema ozdravených od viru GFLV. Léčba ribavirinem neovlivnila růst rostlin, kořenící schopnost, počet kořenů a nezpůsobila chlorózy. Acyclovir v koncentraci 20 mg/l byl neefektivní pro uískání VF rostlin. Lze říci, že ribavirin v dávce 20 mg/l, se ukázal být jako vhodné antivirotikum pro získání VF rostlin. Cieslinska (2007) uvádí, že ribavirin v koncetracích 10-25 mg/l neměl žádné znatelné výsledky. Vyšší koncentrace, tzn. 50 100 mg/l se jevila jako fytotoxická, zejména pro švestky. Myrobalán a třešně vykazovaly větší toleranci k vyšším koncentracím ribavirinu. Ribavirin v koncentracích 25 100 mg/l byl efektivní pro eliminaci ACLSV u myrobalánu a PNRSV u švestky. Avšak, nezávisle na použité koncentraci, bylo nemožné eliminovat PNRSV u myrobalánu a PDV u třešně. Kombinací termoterapie a chemoterapie s užitím 50 100 mg/l ribavirinu došlo k eliminaci PDV u třešní. Také kombinací terapií bylo umožněno eliminovat PNRSV u myrobalánu a švestky. Během tohoto experimentu došlo k úspěšné eliminaci ACLSV u myrobalánu a PNRSV u švestky s použitím ribavirinu v koncentracích 10-100 mg/l. Paprštejn et al. (2007) získal pomocí in vitro chemoterapie s využitím ribavirinu v dávce 20 mg/l u všech čtyř zkoumaných odrůd ozdravené klony od virů. Úspěšnost chemoterapie se přitom pohybovala mezi 68,4 % u viru ASPV u odrůdy hrušně a 100 % u viru ACLSV u odrůdy jabloně. Ze zkoumaných odrůd byla zaznamenána fytotoxicita použité koncentrace 20 mg/l ribavirinu u jabloně Šampion. 40

Hauptmanová (2009) považuje chemoterapii ovocných dřevin za vhodnou metodou pro eliminaci virů a získání VF materiálu. Jak ukazují dosažené výsledky, tato metoda byť může být efektivní, ale je časově náročná. VF materiál může být využit pro biotechnologické postupy v rámci systému certifikace VF výsadbového materiálu ovocných dřevin. 41

7. ZÁVĚR Výsledky přežití jednotlivých odrůd po chemoterapii ribavirinem jsou uvedeny v následujícím grafu (viz Graf 3). Je zřejmé, že druhá aplikace ribavirinu byla pro většinu léčených rostlin smrtelná a ukázala se být jako neefektivní u většinu odrůd meruněk a broskvoní. Vyjímku tvoří odrůdy Redhaven - 124 a Suncrest, které i po druhé aplikaci ribavirinu vykazovaly růst. Procento přežití druhé aplikace ribavirinu se u těchto odrůd pohybovalo mezi 50 83 % v závislosti na použité koncentraci ribavirinu. U meruněk se ukázaly být vhodné odrůdy Marlen - 48, Marlen - 49 a Velkopavlovická - 56, které také vykazovaly vysoké procento přežití druhé chemoterapie. Účinnějším způsobem léčby z hlediska přežití rostlin se však jeví pouze jedna aplikace ribavirinu. Za nejefektivnější koncentraci ribavirinu lze považovat u odrůd meruněk 40 mg/l a u odrůd broskvoní 20 mg/l. Rozdíly v procentech rostlin, které přežily první chemoterapii, v závislosti na použité koncetraci ribavirinu však nejsou vysoké. Dalo by se říci, že koncentrace ribavirinu 10, 20 i 40 mg/l přinesla téměř stejné výsledky. Rozdíly v procentech přežití rostlin se vyskytly v závislosti na léčené odrůdě. Po první aplikaci ribavirinu vykazovaly nejvyšší procento přežití u meruněk odrůdy Velkopavlovická - 61 a Velkopavlovická - 56, u broskvoní odrůdy Redhaven - 124 a Suncrest - 78. Odrůdy Leskora a Cresthaven - 118 nepřežily již růst na základním SH médiu a pro chemoterapii tudíž nebyly použity. Závěrem lze říci, že po obou aplikacích ribavirinu, se jako nejúčinnější koncentrace ribavirinu jeví u meruněk 40 mg/l a u broskvoní 20 mg/l. Nejvyšší procento přežití po obou aplikacích ribavirinu vykazovala u meruněk odrůda Velkopavlovická - 56 a u broskvoní odrůda Redhaven - 124. Dosažené výsledky jsou zatím předběžné. 42

Rostliny budou dále pěstovány, převedeny do nesterilních podmínek a následně testovány na přítomnost patogenú přítomných před chemoterapií. Přežití rostlin jednotlivých odrůd se jeví jako dostatečné pro ozdravení rostlin, neboť by v extrémním případě postačovala i jedna přeživší rostlina k ozdravení odrůdy. Získané výsledky jsou součástí řešení grantového projektu NAZV QH 91153 s názvem: Využití in vitro kultur k ozdravení odrůd ovocných dřevin a révy vinné od virů, fytoplazem a karanténních patogenů pro systém certifikace výsadbového materiálu včetně ověřování kvality. Graf 3 Celkové procento přežití rostlin po obou aplikacích ribavirinu 43

8. RESUME Tato práce byla zpracována na oddělení Mendeleum Ústavu genetiky na Zahradnické fakultě v Lednici na Moravě, Mendelovy univerzity. Cílem práce bylo studium problematiky eliminace virů pomocí ribavirinu,a to jak u rostlin, u nichž byla aplikace již provedena, tak na základě výsledků vlastního pokusu u odrůd meruněk a broskvoní, kdy byl ribavirin aplikován do médií pro kultivaci rostlin. Chemoterapie ovocných dřevin je vhodnou metodou pro eliminaci virů a získání VF materiálu. Jako nejúčinnější koncentrace ribavirinu se jeví u odrůd meruněk 40 mg/l a u broskví 20 mg/l. Nejvyšší procento přežití vykazují odrůdy Velkopavlovická a Redhaven. klíčová slova: chemoterapie, ribavirin, meruňky, broskvoně Summary This thesis was written at the Department of Genetics Mendeleum (Lednice na Moravě) at the Horticulture Faculty of Mendel University. The objective of this thesis was study of questions about elimination viruses using ribavirin. The study was made on the plants, where the aplication of ribavirin was already done and also on the peach tree and apricot tree, where ribavirin was added to the media for plant cultivation. Chemotherapy of the fruit tree species is a suitable method for the elimination of viruses and also for obtaining VF plants. The most effectual concentracion of ribavirin was 40 mg/l by the apricot tree and 20 mg/l by the peach tree. The highest percentage of survival plants was by species Velkopavlovická and Redhaven. key words: chemotherapy, ribavirin, apricot tree, peach tre 44

9. SEZNAM LITERATURY CIESLINSKA, Miroslawa. 2002. Elimination of Apple Chlorotic Leaf Spot Virus (ACLSV) from Pear by in vitro Thermotherapy and Chemotherapy. In Acta Hort. 596, s 481-484, ISHS 2002 CIESLINKA, Miroslawa. 2007. Application of thermo- and chemotherapy in vitro for eliminating some viruses infecting Prunus sp. fruit trees. In Journal of Fruit and Ornamental Plant Research Vol. 15,2007, s 117-124 GEORGE E. F., PUTTOCK D. J. M., GEORGE H. 1987. Plant culture media, volume 1, Formulation and Uses. Vyd. Exegetics Limited, s 390. ISBN 0-95-09325-2-3 HAUPTMANOVÁ, Alena. Ozdravování slivoní od viru šarky švestky pomocí in vitro kultur. [online], [cit. 2010-04-07, akt. 2009-07-07]. Dostupný z WWW: <http://www.zahradaweb.cz/ozdravovani-slivoni-od-viru-sarky-svestky-pomoci-invitro-kultur s513x45043.html> HOWELL W. E., EASTWELL K. C., LI T. S. C. 2001. Heat treatment, chemo-therapy and hydroponic culture for obtaining virus- free of sweet cherry. In Acta Hort. 550, s 455 458, ISHS 2001 JAMES, D. 2001. Long term assessment of the effect of in vitro chemotherapy as a tool for apple stem grooving virus elimination. In Acta Hort. 550, s 459 462, ISHS 2001 JAROŠOVÁ, Jana. Virus zakrslosti slivoně a jeho detekce. [online], [cit. 2010-04-07, akt. 2009-06-08]. Dostupný z WWW: <http://www.zahradaweb.cz/virus-zakrslostislivone-a-jeho-detekce s513x45022.html> 45

KRŠKA B., NEČAS T. Candidatus phytoplasma prunorum (European stone fruit yellows phytoplasma) fytoplazma Evropské žloutenky peckovin ESFY. [online], [cit. 2010-04-07, akt. 2006]. Dostupný z WWW: <http://tilia.zf.mendelu.cz/ustavy/551/ustav_551/aplikace/choroby.htm> NESRSTA D., JAN T., DOKOUPIL L. 2005. Přehledy odrůd 2005 : ovoce, vyd. Ústřední kontrolní a zkušební ústav zemědělský v Brně. 90 s, ISBN 80-86548-72-4 PAPRŠTEJN F., SEDLÁK J., ZEMAN P., SVOBODOVÁ L., POLÁK J., HASSAN M. 2007. Předběžné výsledky ozdravování jabloně a hrušně metodou chemoterapie in vitro. In Inovace pěstování ovocných plodin, vyd. Výzkumný a šlechtitelský ústav ovocnářský Holovousy s.r.o., s 29 36. ISBN 978-80-87030-03-5 POLÁK, Jaroslav. Virus šarky švestky nejškodlivější virus peckovin v České republice I.díl. [online], [cit. 2010-04-07, akt. 2008-03-18]. Dostupný z WWW: <http://www.zahradaweb.cz/virus-sarky-svestky-%e2%80%93-nejskodlivejsi-viruspeckovin-v-ceske-republice-i.-dil s513x44696.html> WEILAND C. M., CANTOS M., TRONCOSO A., PEREZ-CAMACHO F. 2004. Regeneration of Virus- Free Plants by in Vitro Chemotherapy of GFLV (Grapevine Fanleaf Virus) Infected Explants of Vitis vinifera cv Zalema. In Acta Hort. 652, s 463-466, ISHS 2004 arbia.colweb.cz [online]. [cit. 2010a-04-07]. Dostupný z WWW: <http://arbia.colweb.cz/broskvone.php> arbia.colweb.cz [online]. [cit. 2010b-04-07]. Dostupný z WWW: <http://arbia.colweb.cz/merunky.php> cs.wikipedia.org [online]. [cit. 2010-04-07]. Dostupný z WWW: <http://cs.wikipedia.org/wiki/elisa> en.wikipedia.org [online]. [cit. 2010-04-07]. Dostupný z WWW: <http://en.wikipedia.org/wiki/ribavirin> 46

hruska.skolky.cz [online]. [cit. 2010-04-07]. Dostupný z WWW: <http://www.hruskaskolky.cz/prodejna-produkt/merunka-marlen> 47

10. PŘÍLOHY 10.1 Seznam obrázků Obr. 7 Obr. 8 Obr. 9 Obr. 10 Obr. 11 Obr. 12 Obr. 13 Obr. 14 Obr. 15 meruňka Velkopavlovická vzorek č. 61 20 mg/l ribavirinu meruňka Velkopavlovická - vzorek č. 56 40 mg/l ribavirinu meruňka Velkopavlovická - vzorek č. 56 10 mg/l ribavirinu broskvoň Redhaven - vzorek č. 124 40 mg/l ribavirinu broskvoň Suncrest - vzorek č. 78 20 mg/l ribavirinu broskvoň Cresthaven - vzorek č. 115 20 mg/l ribavirinu broskvoň Redhaven - vzorek č. 124 20 mg/l ribavirinu broskvoň Suncrest - vzorek č. 78 20 mg/l ribavirinu meruňka Marlen - vzorek č. 49 10 mg/l ribavirinu Autor fotografií Ing. Břetislav Křižan, Ph.D. 48

10.2 Obrazová příloha - některé klony po 1. aplikaci ribavirinu (foceno 6. 11. 2009) Obr. 7 meruňka Velkopavlovická vzorek č. 61 20 mg/l ribavirinu Obr. 8 meruňka Velkopavlovická - vzorek č. 56 40 mg/l ribavirinu 49