Ovlivnění obsahu akrylamidu v medovém pečivu úpravou technologického postupu

Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav zoologie, rybářství, hydrobiologie a včelařství Ovlivnění obsahu akrylamidu v medovém pečivu úpravou technologického postupu Vedoucí práce: doc. Ing. Antonín Přidal, Ph.D. Vypracovala: Bc. Kristýna Hadravová Brno 2016

Čestné prohlášení Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma Ovlivnění obsahu akrylamidu v medovém pečivu úpravou technologického postupu vypracovala samostatně a veškeré použité parametry a informace uvádím v přiloženém seznamu literatury. Souhlasím, aby moje práce byla zveřejněna v souladu s 47b zákona č. 111/1998 Sb., o vysokých školách ve znění pozdějších předpisů a v souladu s platnou Směrnicí o zveřejňování vysokoškolských závěrečných prací. Jsem si vědoma, že se na moji práci vztahuje zákon č. 121/2000 Sb., autorský zákon, a že Mendelova univerzita v Brně má právo na uzavření licenční smlouvy a užití této práce jako školního díla podle 60 odst. 1 autorského zákona. Dále se zavazuji, že před sepsáním licenční smlouvy o využití díla jinou osobou (subjektem) si vyžádám písemné stanovisko univerzity, že předmětná licenční smlouva není v rozporu s oprávněnými zájmy univerzity, a zavazuji se uhradit případný příspěvek na úhradu nákladů spojených se vznikem díla, a to až do jejich skutečné výše. V Brně dne:.... podpis

Poděkování Tímto bych chtěla poděkovat doc. Ing. Antonínu Přidalovi, Ph.D. za konzultace, věcné připomínky, odborné vedení a poskytování cenných rad při vypracování této diplomové práce. Dále prof. MVDr. Ing. Tomáši Komprdovi, CSc. za spolupráci. Také děkuji své rodině za podporu a trpělivost.

Ovlivnění obsahu akrylamidu v medovém pečivu úpravou technologického postupu Abstrakt Diplomová práce zpracovává přehled problematiky vzniku a eliminace akrylamidu v potravinách. Experimentálně řeší optimalizaci receptury vedoucí ke snížení obsahu akrylamidu v perníku při současném zachování jeho senzorických vlastností. Byl ověřován vliv tří různých aditiv (soda, chlorid vápenatý a kys. citronová) na vznik akrylamidu v porovnání s originální recepturou, kde se tradičně používá kypřící prostředek uhličitan amonný, který vznik akrylamidu podporuje. Kombinací všech tří testovaných látek se podařilo snížit obsah akrylamidu pod detekční limit (25 µg kg -1 ) a současně docílení přijatelných senzorických vlastností. Otázky související s některými nežádoucími efekty v zamítnutých variantách kombinací testovaných aditiv jsou diskutovány. Klíčová slova: akrylamid, eliminace akrylamidu, aditiva, perník, senzorická analýza Influencing the acrylamide content in honey pastries by modification of the technological process Abstract The thesis process the issue of formation and elimination of acrylamide in foods. Experimentally solves optimization recipe to reduce the content of acrylamide in gingerbread while maintaining the sensory properties. It was verified the effect of three different additives (soda, calcium chloride and citric acid) on acrylamide formation in comparison with the original recipe, which is traditionally used leavening agent ammonium carbonate, which promotes the formation of acrylamide. Combination of all three tested compounds is able to reduce the acrylamide content below the detection limit (25 µg kg-1) and simultaneously achieve an acceptable sensory properties. Questions related to some undesirable effects in the rejected variants in tested combinations of additives are discussed. Key words: acrylamide, elimination of acrylamide, additives, gingerbread, sensory analysis

OBSAH 1 ÚVOD... 8 2 LITERÁRNÍ PŘEHLED... 9 2.1 Akrylamid... 9 2.1.1 Charakteristika akrylamidu... 9 2.1.2 Vznik akrylamidu... 10 2.1.3 Přítomnost akrylamidu... 13 2.1.4 Obsah akrylamidu v potravinách... 14 2.1.5 Eliminace akrylamidu v pečivu... 15 2.1.6 Akrylamid v perníku... 18 2.1.7 Vliv aditiv na obsah akrylamidu... 19 2.1.7.1 Kypřící látky... 19 2.1.7.2 Ionty... 19 2.1.7.3 Kyseliny... 20 2.1.8 Metody stanovení akrylamidu... 20 3 CÍL... 22 4 MATERIÁL A METODIKA... 23 4.1. Příprava vzorků... 23 4.2 Postup hodnocení perníku... 26 4.2.1 Stanovení obsahu akrylamidu... 26 4.2.2 Senzorická analýza... 27 4.2.3 Stanovení fyzikálních parametrů perníku... 29 5 VÝSLEDKY... 30 5.1 Obsah akrylamidu... 30 5.1.1 Vliv jednotlivých aditiv... 30 5.2 Senzorické hodnocení perníku... 32 5.2.1 Vyhodnocení dotazníku... 32 5.2.2 Fyzikální parametry... 34 6 DISKUSE... 36

6.1 Obsah akrylamidu... 36 6.1.1 Vliv jednotlivých aditiv... 36 6.2 Senzorické hodnocení perníku... 38 6.2.1 Vyhodnocení dotazníku... 39 6.2.2 Fyzikální parametry... 39 7 ZÁVĚR... 42 8 POUŽITÁ LITERATURA... 43 9 SEZNAM OBRÁZKŮ... 48 10 SEZNAM TABULEK... 49

1 ÚVOD Obsah akrylamidu v potravinách je stále aktuálnější téma výzkumu. Vzhledem k neustále se zvyšujícím nárokům na kvalitu a bezpečnost potravin dochází k stále většímu povědomí veřejnosti o této problematice. Tím dochází ke zvyšování tlaku k nalezení vhodných metod pro jeho účinnou eliminaci. Neustále vznikají nové výzkumy zabývající se možnostmi eliminace této látky v různých druzích potravin, především v pečivu a výrobcích z brambor, pomocí působení nejrůznějších faktorů. Kromě eliminace pomocí aditiv je možnost volit vhodnější suroviny nebo jejich kombinace. Vhodné je eliminovat prekurzory vzniku akrylamidu jako asparagin a redukující cukry. Akrylamid má mnoho toxických účinků a nachází se ve velmi širokém portfoliu produktů. Především jde o pečivo, chipsy, bramborové hranolky nebo kávu. Eliminací akrylamidu se od roku 2002, kdy byla poprvé detekována jeho přítomnost v potravinách, zabývalo již mnoho studií a jejich výsledky dochází k účinnému snížení akrylamidu v nejrůznějších výrobcích. Neustále se však provádí studie další, zabývající se vlivem kombinací aditiv a docílení výrobku s co nejnižším množstvím akrylamidu při současném zachování senzorických parametrů, což se ukázalo být poměrně problematickým faktorem. Hlavní metody eliminace jsou změna kypřidla, přídavek kyseliny nebo kationtů či snížení teploty a času přípravy potraviny. 8

Ovlivnění obsahu akrylamidu v medovém pečivu úpravou technologického postupu 2 LITERÁRNÍ PŘEHLED 2.1 Akrylamid 2.1.1 Charakteristika akrylamidu Akrylamid je krystalická, bezbarvá, pevná látka bez zápachu. Teplota tání je 84,5 C (Jin a kol., 2013). Je to nežádoucí látka, která může vznikat při pečení či smažení. Jeho přítomnost v potravinách byla poprvé odhalena v roce 2002 (Anese a kol., 2009). Vzniká jako přirazený produkt při tepelné úpravě Maillardovou reakcí. Je to potenciálně rakovinotvorná látka, u které není stanoven žádný limit pro její obsah (Šucman a Veselá, 2012). Hodnoty akrylamidu v potravinách je proto vhodné udržovat na co nejnižší úrovni. Je prokázáno, že má neurotoxické a mutagenní účinky. Tyto na zdraví negativní účinky jsou však prokázány pouze u laboratorních zvířat (Keramat a kol., 2011). Potvrzený je zvýšený výskyt plicních nádorů u myší (Thomas a Thomas, 2004). Působením na člověka se řadí do skupiny potenciálních karcinogenů (Matthäus a Haase, 2014). Doposud nebyl potvrzen zvýšený výskyt rakoviny u člověka v závislosti na vysokém příjmu akrylamidu (Pedreschi a kol., 2014). Akrylamid má více toxických účinků, jako jsou neurotoxicita, karcinogenita, mutagenita, teratogenita nebo genotoxicita (Cwiková, 2014). Akrylamid může být do těla vstřebán přes kůži, inhalací a gastrointestinálním traktem. Při perorálním podání je velmi rychle absorbován především ve střevech, kde je transportován do buněk pasivní difúzí. Následně je rozdistribuován do tkání, především tkáně svalové, tkáně trávicího traktu, plic, kůže a kostní dřeně. 9

Zdroj: https://upload.wikimedia.org/wikipedia/ commons/thumb/c/c3/acrylamid.svg/ 400px-Acrylamid.svg.png Obrázek 1: Akrylamid 2.1.2 Vznik akrylamidu Akrylamid je látka přirozeně se tvořící při tepelné úpravě potravin. Hlavním mechanismem je tvorba Maillardovou reakcí (Šucman a Veselá, 2012). Existuje i několik dalších mechanismů pro jeho tvorbu. Může vznikat z akroleinu a kyseliny akrylové po dehydrataci glycerolu zahříváním v přítomnosti tuků. Tvoří se také společně s amoniakem při degradaci aminokyselin (Claus a kol., 2008). Maillardova reakce, nejčastější způsob vzniku akrylamidu, je reakce neenzymatického hnědnutí. Je to nejrozšířenější chemická reakce probíhající během skladování a zpracování potravin mezi redukujícími sacharidy a aminosloučeninami. Rakce probíhá ve třech fázích, viz obr. 2: A a B značí počáteční fázi reakce, konkrétně tvorbu glykosylaminu následovanou Amadoriho přesmykem C, D a E znázorňují fázi střední, která zahrnuje dehydrataci a fragmentaci sacharidů a Streckerovu degradaci aminokyselin F a G je fáze závěrečná, kde dochází k reakci meziproduktů, která vede k tvorbě heterocyklických sloučenin a pigmentů melanoidinů, které jsou nositeli hnědého zbarvení 10

Obrázek č. 2: Schematické znázornění Maillardovy reakce podle Hodge (Velíšek a Hajšlová, 2009) První krok reakce dává vznik Schiffově bázi. Následuje vznik produktu Amadoriho přesmykem. Dále jsou vzniklé produkty podrobeny Streckerově degradaci aminokyselin, což vede ke vzniku karbonylové sloučeniny, oxidu uhličitého a amoniaku. Navíc se tímto krokem utváří chuť a barva dané potraviny (Marková, 2013). V průběhu reakce vznikají i další látky - senzoricky aktivní sloučeniny, jako ketony, pyraziny, pyridiny, furany nebo tiazoly. Kromě formace akrylamidu vzniká Maillardovou reakcí také meziprodukt 5-hydroxymethylfurfural (HMF). Ten je tvořen rozkladem cukrů při vysokých teplotách a používá se jako indikátor pro vyhodnocení tepelných účinků při výrobě produktů z obilovin (Keramat a kol., 2011). Kromě toho má genotoxické a mutagenní účinky a rovněž jako akrylamid se nachází ve velkém portfoliu potravin (Ciesarová a kol., 2009). Jeho tvorba je silně podpořena přítomností fruktózy, která je ve velké míře obsažena v medu (Ciesarová a kol., 2009). HMF lze považovat za prekurzor tvorby akrylamidu a indikátor hnědnutí u pekařských výrobků, které se vyznačuje lineární korelací s obsahem akrylamidu (Keramat a kol., 2011). 11

Maillardova reakce podle Velíška a Hajšlové (2009) způsobuje: hnědé zbarvení, jako nežádoucí projev reakcí; vznik aromatických látek a látek s nežádoucími organoleptickými vlastnostmi; ovlivnění výživového a fyziologického aspektu reakcí (snížení nutriční hodnoty); toxicitu některých produktů a antioxidační vlastnosti reakčních produktů. Nejdůležitějším faktorem pro uskutečnění tvorby akrylamidu během této reakce je přítomnost prekurzorů v surovině. Jsou to redukující cukry, jako glukóza a fruktóza, aminokyselina asparagin ve volné formě a vhodná kombinace teploty a času. Teplota potřebná k jeho tvorbě je 120 C. Během reakce dochází k reakci karbonylové skupiny přítomné v redukujícím sacharidu, která reaguje s aminoskupinou, přítomnou v asparaginu během procesu pečení a smažení (Macháčková, 2008). Velmi malé množství akrylamidu vzniká i při záhřevu samotného asparaginu. V přítomnosti karbonylové skupiny dochází k urychlení reakce a vzniku většího množství této látky (Jin a kol., 2013). Asparagin však není nejreaktivnější aminokyselinou přítomnou v potravinách. Vliv dalších aminokyselin, jako glutaminu, argininu nebo lyzinu při tvorbě prekurzorů potřebných pro obecnou dráhu aminokyselin, je značný. Tím mohou tyto aminokyseliny hrát významnou roli při formaci akrylamidu. Akrylamid může vznikat i reakcí asparaginu s lipidy nebo může být tvořen z 3-aminopropionamidu viz obr. 3 (Marková, 2013). Vznik akrylamidu může být také ovlivněn geneticky či podmínkami prostředí (Pedreschi a kol., 2014). Již při teplotě 100 C dochází k tvorbě N-glykosidu, který je následně rozštěpen mezi vazbou C-N což vede k přeměně na akrylamid (Macháčková, 2008). 12

Obrázek č. 3: Tvorba akrylamidu reakcí mezi asparaginem a dikarbonylovou sloučeninou Zdroj:http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/7/79/Acrylamide_production. png 2.1.3 Přítomnost akrylamidu Akrylamid se vyskytuje zejména v potravinách, které prošly tepelnou úpravou smažením, fritováním, pražením nebo pečením za teploty nad 120 C. Nejčastější je jeho přítomnost v tepelně opracovaných potravinách rostlinného původu s vysokým obsahem redukujících sacharidů a nízkým obsahem proteinů, jako jsou brambory a obiloviny. Naopak potraviny živočišného původu vykazují pouze nízký nebo zanedbatelný obsah akrylamidu (Macháčková, 2008). Mezi nejčastější potraviny s obsahem akrylamidu se řadí bramborové hranolky, chipsy, pražená káva, snídaňové cereálie a pečivo (Anese a kol., 2009). 13

2.1.4 Obsah akrylamidu v potravinách Podle EFSA, který prováděl monitoring obsahu akrylamidu v potravinách ve 20 státech EU a v Norsku, bylo zjištěno, že obsah akrylamidu v potravinách je proměnlivý. Studie probíhala po dobu 3 let, od roku 2007 do roku 2009. Mezi potraviny s klesajícím obsahem akrylamidu se řadí perník, krekry nebo dětské sušenky. Jiné potraviny naopak disponují stále vyšším obsahem akrylamidu. Jsou to například chléb nebo instantní káva. Pro Evropu byla odhadnuta hodnota příjmu akrylamidu v rozmezí 0,31 až 1,1 µg kg -1 tělesné hmotnosti za den pro dospělého člověk (nad 18 let), 0,43 až 1,4 µg kg -1 tělesné hmotnosti za den pro dospívajícího člověka (11 17 let) a mezi 0,70 až 2,05 µg kg -1 tělesné hmotnosti za den pro děti od 3 do 10 let (www.efsa.europa.eu, 2011). Podle další studie prováděné se zaměřením na příjem akrylamidu v potravinách se zjistilo, že největší množství akrylamidu přijímá člověk konzumací chleba, krekrů, kávy a brambor (Freisling a kol., 2013). Na základě výsledků monitoringu obsahu akrylamidu v potravinách, stanovil EFSA směrné hodnoty akrylamidu ve vybraných potravinách viz tab. 1 (www.eur-lex.europa.eu, 2013). 14

Tabulka 1: Směrné hodnoty akrylamidu na základě údajů EFSA z monitorování v letech 2007 2012 Potravina Směrná hodnota (µg kg -1 ) Hranolky k přímé spotřebě 600 Bramborové lupínky z čerstvých brambor a z bramborového těsta Bramborové krekry Měkký chléb 1000 a) pšeničný chléb 80 b) měkký chléb jiný než pšeničný 150 Snídaňové cereálie (kromě ovesné kaše) - výrobky z otrub a celozrnné cereálie, pufované zrní (vztahuje se na pufované, pouze pokud je vyznačeno) 400 - pšeničné a žitné výrobky 300 - výrobky z kukuřice, ovsa, pšenice špaldy, ječmene a rýže 200 Sušenky a oplatky 500 Krekry s výjimkou bramborových krekrů 500 Křupavý chléb 450 Perník 1000 Výrobky podobné ostatním výrobkům této kategorie Sušenky a suchary pro kojence a malé děti Obilné příkrmy pro kojence a malé děti kromě sušenek a sucharů 500 200 50 2.1.5 Eliminace akrylamidu v pečivu Důležitou roli při snižování obsahu akrylamidu v potravinách hrají čtyři faktory ovlivňující Maillardovu reakci. Jsou to přítomnost prekurzorů, teplota, vodní aktivita a ph hodnota (Pedreschi a kol., 2014). Akrylamid není tvořen před poklesem aktivity 15

vody na 0,8 a nejvíce ho vzniká při aktivitě vody 0,4 (Keramat a kol., 2011). Snížení obsahu akrylamidu dosáhneme minimalizací či eliminací prekurzorů. Například použitím mouky s nižším obsahem asparaginu. Asparagin je hlavní aminokyselinou mouky pšeničné (14 16 %) a mouky žitné (18 26 %). Kromě snižování obsahu asparaginu lze předcházet vzniku akrylamidu v tepelně upravovaných potravinách redukcí obsahu sacharidů. Tuto metodu je vhodné aplikovat pro dosažení lepších výsledků při výrobě produktů z brambor. Výběr vhodné odrůdy, sklizeň zralých hlíz nebo skladování jsou v tomto ohledu důležité. U cereálních výrobků je možné snížení obsahu akrylamidu předúpravou obilovin, která spočívá v zahřívání zrn při nízké teplotě s následným pomletím na mouku. Touto metodou se sníží obsah vody. Hodnoty cukrů a asparaginu zůstanou nezměněny. Výsledkem je zkrácená doba pečení při zachování stejné teploty a tedy nižší tvorba akrylamidu (Marková, 2013). Nejúčinnějším způsobem eliminace akrylamidu je zásah do mechanizmu jeho tvorby nebo vhodnou úpravou technologického procesu zpracování potravin (Amrein a kol., 2006). Účinná eliminace obsahu akrylamidu v potravinách pomocí úpravy technologického postupu výroby je zajištěna přidáním aditiv do těsta. Podstatný význam má snižování nebo úplná náhrada kypřících látek nebo přídavek látek jiných. Jedná se o náhradu běžného pečícího přípravku uhličitanu amonného, přidání organických kyselin nebo pomocí enzymů či antioxidantů. Další možnost je použití enzymu L-asparaginázy. L-asparagináza neboli L-asparagin-aminohydroláza je enzym, který hydrolyzuje asparagin na asparagovou kyselinu a amoniak (Krishnakumar a Visvanatha., 2014). Nachází se v tkáních živočichů, bakterií a rostlin (Macháčková, 2008). Přidáním L-asparaginázy do těsta lze dosáhnout až 40% snížení obsahu akrylamidu. Výsledný účinek asparaginázy může být až 75 95 % v závislosti na použitém množství a teplotě uležení těsta (Ciesarová a kol., 2010). Přídavek L-asparaginázy je vhodný, protože nemá nežádoucí vliv na senzorické parametry výrobku (Ciesarová a kol., 2009). Nižšího množství asparaginu dosáhneme i použitím mouky s jeho nízkým obsahem (Krishnakumar a Visvanathan, 2014). Uhličitan amonný ((NH 4 ) 2 CO 3 ) neboli amonium je běžně používaný kypřící přípravek při výrobě pečiva. Pro dosažení eliminace akrylamidu se nahrazuje hydrogenuhličitanem sodným (NaHCO 3 ) neboli sodou. Pozitivní výsledky těchto postupů potvrzují mnohé studie. Použitím NaHCO 3 jako pečícího přípravku namísto (NH 4 ) 2 CO 3 se snižuje 16

obsah akrylamidu až o 60 % (Amrein a kol., 2006). Stejně jako u akrylamidu, uhličitan amonný napomáhá formování také HMF (Ciesarová a kol., 2009). Největší důležitost se však přisuzuje tepelnému účinku na potravinu. Doporučuje se používat nižší teplota a delší doba úpravy (Cwiková, 2014). Jeden ze způsobů může být okamžité zchlazení po vysokoteplotním smažení produktu. Dále použití vodní páry v závěru pečení nebo infračervený ohřev či ohřev dielektrický. Metoda dielektrického ohřevu potraviny je vhodná pro pekařské výrobky s docílením udržení nízkého obsahu akrylamidu při zachování požadované barvy a chuti (Marková, 2013). Akrylamid může být také snižován přidáním organické kyseliny (Amrein a kol., 2004). Nejčastěji používanými kyselinami jsou kyselina vinná a citronová. Použití kyselin má však jistá omezení. Můžou způsobovat nakyslou chuť, příliš rychle se vyvíjející těsto a v neposlední řadě můžou způsobit nedostatečné zhnědnutí produktu (Jackson a Al-Taher, 2005). To se ve výsledku projevuje jako výrobek nedostatečně propečený. Důležitým faktorem jsou také dvojmocné kationty. Ty mají vliv na tvorbu Schiffovy báze a následně tvorbu akrylamidu (Ciesarová a kol., 2010). Dalším způsobem, kterým lze působit proti formování akrylamidu, je použití antioxidantů. Za významné antioxidanty jsou považovány mono- a polyhydroxylové fenolické látky (Marková, 2013). Bylo zjištěno, že použití pepře jako antioxidantu způsobuje snížení obsahu akrylamidu ve finálním výrobku o přibližně 50 % (Ciesarová a kol., 2008). Podle Markové (2013) došlo při použití bílého pepře jako antioxidantu ke snížení obsahu akrylamidu v pernících. U perníků připravených s pohankovou světlou moukou o 9 % a s moukou z pražené pohanky o 16 %. Nejlépe na snížení obsahu akrylamidu v pernících působil muškátový oříšek. Každá strategie vedoucí k eliminaci akrylamidu v potravinách přináší i jisté limitující faktory. Ty jsou závislé na vnějším prostředí a druhu výrobku. Vhodná metoda by měla být zvolena tak, aby byla kompatibilní pro více faktorů uplatňujících se při výrobě potraviny. Výrobní proces a recepturu, senzorické vlastnosti nebo nutriční vlastnosti výrobku. Jednou z možností eliminace je odstranění akrylamidu z již finalizovaných potravin, z praktičtějšího hlediska je však vhodnější předcházení jeho vzniku (Marková, 2013). V dokumentu CIAA (Acrylamide Toolbox, 2011) je uvedeno 14 možných parametrů ovlivňujících obsah akrylamidu v potravinách. Tyto parametry jsou rozděleny do 4 skupin podle toho, na které úrovni je lze během procesu zpracování potraviny použít. 17

Jsou to následující parametry: a) agronomický (redukující sacharidy, asparagin) b) receptura (kypřící látky, další vedlejší přísady, ph, zředění prekurzorů a velikost výrobku, přepracování meziproduktů, fermentace) c) zpracování (asparagináza, teplota/čas a kontrola obsahu vody, předběžná úprava, konečná barva produktu, struktura/chuť) d) finální úprava (rady spotřebitelům) 2.1.6 Akrylamid v perníku Perník je typickým zástupce medového pečiva. Jeho základní recepturu tvoří především mouka a med, dále pak cukr a kypřící prostředky. Med je důležitou složkou těsta, protože dodává výrobku specifické aroma a chuť, navíc je pozitivní z hlediska obsahu mikroorganismů, které působí příznivě při odležení těsta (Půlpánová, 2013). Nové postupy nahrazují med ve velkém měřítku cukrem (Červenka a kol, 2008). Zmíněné suroviny společně s vysokou teplotou a přidanými aditivy vytváří vhodné podmínky pro vznik akrylamidu. Aminokyselina asparagin je součástí bílkovin obsažených v mouce. Hlavním zdrojem redukujících cukrů fruktózy a glukózy je med a invertovaný cukerný sirup (Amrein a kol., 2006). Z těchto cukrů je na teplo citlivější fruktóza (Crane, 1982). Při přípravě medového těsta se používají také kypřidla. Častým typem kypřidla je (NH 4 ) 2 CO 3, které podporuje výšku korpusu a NaHCO 3, která působí na jeho šířku. Množství přidaného kypřidla se řídí podle velikosti pečených výrobků. Další důležitou složkou těsta jsou kyseliny. Používají se kyseliny organické, které nejsou agresivní vůči lidskému organismu (Půlpánová, 2013). Kyseliny se běžně přidávají do těsta s použitím NaHCO 3 pro lepší vývin těsta (Graf a kol., 2006). Kyseliny narušují cukr v těstě, čímž dochází k hnědnutí. Kyseliny se následně neutralizují přidáním NaHCO 3. Tímto mechanismem dochází v těstě ke vzniku chloridu sodného, vody a oxidu uhličitého. Bez neutralizace dochází k rozrušování invertního cukru a tím ke snížení vláčnosti perníku (Půlpánová, 2013). Vznik akrylamidu za již zmíněné teploty podporuje nedostatečná vlhkost nebo úplná absence vody při výrobě potraviny (Schaper, 2005). Velmi významnou roli při formování akrylamidu představuje špatný technologický postup výroby perníku. Koncentrace akrylamidu se stejně jako intenzita zbarvení produktu zvyšuje s délkou pečení (Jackson a Al-Taher, 2005). Zvýšený obsah akrylamidu se může projevovat změnou 18

senzorických vlastností. Má vliv na barvu, chuť, vůni a další. Během Maillardovy reakce dochází ke vzniku hnědých pigmentů, melanoidinů, které se začínají tvořit již při zahřátí nad 100 C (Low a kol., 2006). Melanoidiny vznikají z různých produktů rozkladu cukru a vyznačují se různými fyzikálně-chemickými vlastnostmi, jako je rozpustnost, antioxidační aktivita, aj. (Velíšek a Hajšlová, 2009). Pro vznik akrylamidu v pečivu je podstatnější množství asparaginu než obsah redukujících cukrů, u hranolek a bramborových lupínků je tomu naopak. Výsledek studie potvrzuje, že přítomnost asparaginu velmi výražně zvyšuje množství akrylamidu v pečivu, vliv redukujících cukrů je zde negativní (Bråthen a Knutsen, 2005). Největší množství akrylamidu se tvoří v kůrce produktu. Důležitým faktorem je poměr povrchu a objemu výrobku. Snížení obsahu akrylamidu v konečném produktu podpoří zmenšení plochy povrchu oproti objemu výrobku (Marková, 2013). 2.1.7 Vliv aditiv na obsah akrylamidu 2.1.7.1 Kypřící látky Pečící přípravek uhličitan amonný podporuje formování akrylamidu v pečivu. Pekařské výrobky připravované s použitím tohoto kypřidla mohou obsahovat až 1000 µg akrylamidu na kilogram výrobku (Amrein a kol., 2007). Podle mnohých studií je prokázané, že náhradou uhličitanu amonného za hydrogenuhličitan sodný v procesu výroby pečiva lze významně snížit formování akrylamidu. Konkrétně u perníku se jeho obsah snížil o více než 60 % oproti použití amonia. Při pokusu, kde se k použitému uhličitanu sodnému přidala navíc i kyselina, v tomto případě byla použita kyselina vinná, výsledky stanovily až 90 % snížení akrylamidu (Amrein a kol., 2007). 2.1.7.2 Ionty Podle studie, která zkoumala vliv jedno a dvojmocných kationtů na tvorbu akrylamidu, bylo zjištěno, že dvojmocný vápník Ca 2+ působí jako úplná prevence tvorby akrylamidu. Na rozdíl od jednomocných kationtů, jako Na +, které snižují jeho množství pouze o přibližně polovinu. Konkrétně působí kationty jako prevence vzniku Schiffovy báze a tudíž i akrylamidu během zahřívání (Gokmen a Senyuva, 2007). Studie se dále zabývala vznikem akrylamidu u hranolků, kde výsledky rovněž potvrdily, že dvojmocné kationty jsou odpovědné za inhibici akrylamidu. Například při pokusu s hranolky, kde se používaly Ca 2+ a Na + kationty, se zjistilo, že dvojmocné kati- 19

onty v CaCl 2 (0,1 M) snižují vznik akrylamidu až o 95 % oproti jednomocným v NaCl (0,1 M), kde došlo k inhibici 58 % a při pokusu s běžnou vodou bez přídavku kationtů šlo pouze o 17% inhibici při smažení po dobu 60 minut (Gokmen a Senyuva, 2007). Při použití NaCl dochází ke snížení obsahu akrylamidu, snížení však nemá lineární průběh v závislosti na použitém množství (Šimon a kol., 2006). 2.1.7.3 Kyseliny Přídavek kyselin do těsta způsobuje úbytek akrylamidu již při nízkém množství pod 5 g kg -1. Je vhodný zejména pro redukci akrylamidu v perníku, protože zároveň ovlivňuje výslednou barevnost, kynutí a chuť (Amrein a kol., 2004). Se zvyšujícím se množstvím kyseliny se množství akrylamidu téměř lineárně snižuje (Keramat a kol., 2011). 2.1.8 Metody stanovení akrylamidu Nejčastější metoda používaná pro stanovení akrylamidu v potravinách je pomocí plynové chromatografie. Vhodné detektory pro použití této metody jsou hmotnostní spektrometry (Oracz a kol., 2001). Aby bylo dosaženo vyšší selektivity a nižších detekčních limitů, je nezbytná derivatizace analyzované látky. Účel derivatizace analytu spočívá v redukci polarity akrylamidu, zlepšení retenčního času a zisku symetrických píků (Marková, 2013). Proces derivatizace je poměrně pracný a časové náročný, je však vykompenzován vysokou přesností testů. V případě akrylamidu se velice často provádí bromace. Bromace spočívá v přídavku bezvodého bromidu draselného, kyseliny bromovodíkové a nasyceného roztoku bromu, přičemž vzniká 2,3-dibrompropanamid (Mikulíková a Sobotová, 2007). Tento amid byl identifikován jako nestabilní a vhodná je tedy jeho přeměna na stabilnější 2-brompropenamid (Geng a kol., 2011). Stabilnějšího 2-bromprepenamidu se dosáhne snadno přidáním triethylaminu ke konečnému extraktu před nástřikem. Bromaci lze provádět i další metodou přidání bromičnanu draselného (KBrO 3 ) a bromidu draselného (KBr) (Pittet a kol., 2004). Derivatizace se může provádět i silylací. Dále lze použít plamenově-ionizační detektor či detektor elektronového záchytu. Další možnost stanovení akrylamidu v potravinách je pomocí kapalinové chromatografie. Výhodou této techniky je její vysoká citlivost, a to i s absencí derivatizace (Zhang a kol., 2005). Při kvantitativním i kvalitativním stanovení akrylamidu se jako nejvhodnější jeví spojení vysokotlaké kapalinové chromatografie s hmotnostním spekt- 20

rometrem. Vhodná je také vysokotlaká kapalinová chromatografie (NP-HPLC) na normálních fázích s UV detekcí, která byla vyvinuta cíleně pro stanovení akrylamidu (Thomas a Thomas, 2004). Další metoda, jak lze akrylamid stanovit, je pomocí kapilární elektroforézy. Jde o separační techniku, sloužící k vyhodnocení kvantitativní analýzy akrylamidu. Lze použít kapilární zónovou elektroforézu nebo micelární elektrokinetickou chromatografii. Kapilární zónová elektroforéza vyžaduje derivatizaci. Při této technice dochází k oddělování sloučenin na základě rozdílné migrační rychlosti elektricky nabitých částic v elektrickém poli. Micelární elektrokinetická chromatografie umožňuje separaci elektricky nabitých i neutrálních látek na základě rozdílné interakce s micelami. Dále lze využít bioanalytických metod jako ELISA test, tzn. imunoenzymatický test. Test je založen na velmi specifické reakci mezi antigenem a protilátkou. Tato metoda může také požadovat derivatizaci. Uskutečnění testu nevyžaduje speciální vybavení nebo složitou přípravu vzorku, na rozdíl od chromatografické či elektroforetické metody (Oracz a kol., 2011). 21

3 CÍL PRÁCE Cílem práce bylo zvolit perník, v jehož původní receptuře je předepsáno kypřidlo uhličitan amonný se záměrem upravit technologii tohoto perníku s pomocí finančně i technologicky snadno dostupných metod i aditiv tak, aby výsledný produkt obsahoval podstatně minimalizované množství akrylamidu a jeho senzorické parametry zůstaly bez negativního ovlivnění. 22

4 MATERIÁL A METODIKA 4.1 Příprava vzorků Všechny ingredience na přípravu vzorků pepřového perníku byly obstarány v běžném supermarketu. Použité suroviny a jejich množství je uvedeno v tabulce 2. Použitý med byl směsí medů květovo-medovicového a lipového, pocházejícího z roku 2014, o elektrické vodivosti 75 ms m -1 a obsahu vody 18,5 %. Vejce pocházela z polského klecového chovu. Tabulka 2: Seznam použitých ingrediencí Ingredience Množství [g] Značka Hladká pšeničná mouka 335 Ramill Med 220 Vejce 50 Mletá skořice 2,2 Gurmeko Mletý hřebíček 0,75 Gurmeko Mletý muškátový oříšek 0,2 Avokádo Mletý zázvor 0,2 Benkor Mletý kardamom 0,2 Benkor Mletý koriandr 0,15 Benkor Mleté nové koření 0,15 Benkor Mletý bílý pepř 0,95 Benkor Sůl 0,15 Benkor Jako aditivum byl použit uhličitan amonný ((NH 4 ) 2 CO 3 ), běžně využívaný k přípravě perníkového těsta, rozpuštěný v 5 g vody. Dále hydrogenuhličitan sodný (NaHNO 3 ) jako náhradní kypřidlo, chlorid vápenatý (CaCl 2 ) bezvodý rozpuštěný v 5 g vody a kyselina citronová (C 6 H 8 O 7 ) bezvodá. Zkoušená aditiva viz tab. 3, byla použita v množství mmol na kilogram těsta. 23

Tabulka 3: Seznam a množství použitých aditiv Aditivum Množství [mmol kg -1 ] Značka (NH 4 ) 2 CO 3 84 Promix NaHCO 3 154 Dr. Oetker C 6 H 8 O 7 38 CaCl 2 83 Příprava vzorků byla prováděna běžným způsobem. Všechny suroviny se smísily podle receptury a byly vytvořeny jednotlivé varianty perníků, které se lišily obsahem a kombinací různých aditiv. Bylo upečeno celkem 8 variant perníků, viz obr. 8 15. Příprava vzorků probíhala v domácích podmínkách následovně: Nejdříve bylo potřeba pomocí zahřátí medu do 30 C snížit jeho viskozitu pro dokonalou homogenizaci s vejcem a kořením. Následně se přidala ¼ dávky mouky a kypřidlo, konkrétně (NH 4 ) 2 CO 3, který byl předtím rozpuštěný v 5 g vody nebo NaHCO 3 bez rozpuštění přidána přímo do těsta. Dále pak bylo přidáno testované aditivum. Konkrétně CaCl 2 ve formě anhydridu, který byl před použitím rozpuštěný v 5 g vody a kyselina citronová, která byla přidána přímo do těsta. Následovalo dodání zbytku mouky, tj. zbývající ¾ dávky následována okamžitým zpracováním těsta. Těsto se zpracovalo do válečků o šířce 1,5 2,0 cm a porcovalo se k výrobě jednotlivých perníků po 1 cm. Porce se následně zpracovaly do tvaru kuličky a kladly se na pečící folii. Pečení probíhalo při 180 C v elektrické troubě se spodním a horním pečením současně. Perníky se na pečící folii přetáhly najednou na předehřátý pečící plech, který byl ihned vložen do trouby. Trouba byla nastavena na horní i spodní pečení současně, při teplotě 180 C. Délka pečení byla 7 minut a 25 sekund. Po 3 minutách a 50 sekundách došlo k otočení plechu v troubě pro rovnoměrné působení teploty. Po ukončení doby pečení byl plech z trouby vytažen a spolu s pečící folií byly perníky ihned přemístěny na mramorovou desku k vychladnutí, což způsobilo okamžité přerušení pečící teploty. Po vychladnutí byly perníky z folie sesypány do vzorkovnic po 50 kusech. Syrové těsto na jednu dávku bez aditiv vážilo 610 g. Po přidání aditiv to bylo rozpětí od 614,5 do 620,7 g. Po upečení vážila tatáž dávka 560 575 g. 24

Těchto osm variant receptur perníku, kde byla vzájemně kombinována testovaná aditiva, bylo testováno. Každá varianta byla upečena ve čtyřech opakováních. Kontrolní varianta byla připravena podle původní receptury, tj. pouze s použitím uhličitanu amonného jako originálního kypřidla bez použití dalších testovaných aditiv. Analyzováno bylo tedy celkem 8 vzorků ve 4 opakováních, tj. 32 vzorků a každý byl analyzován ve dvou opakováních, tj. celkem 64 analýz. Seznam variant receptur je znázorněn v tabulce 4. Tabulka 4: Seznam testovaných variant receptur a jejich označení zkratkou Kypřící přípravek Přísady Kation Okyselující přípravek Uhličitan amonný (A) Hydrogenuhličita n sodný (S) Chlorid vápenatý (Ca) Kyselina citronová (C) Označení vzorku (NH 4 ) 2 CO 3 NaHCO 3 CaCl 2 C 6 H 8 O 7 + - - - A přítomnost ve vzorku + - - + AC - + - - S - + - + SC + - + - ACa + - + + ACaC - + + - SCa - + + + SCaC 25

4.2 Postup hodnocení perníku 4.2.1 Stanovení obsahu akrylamidu Jednotlivé vzorky byly připraveny dle popsaného postupu v kapitole 4.1 a jejich stanovení probíhalo plynovou chromatografií na chromatografu Trace GC Ultra Finnigen s DB WAX kapilární kolonou o rozměrech 30 m 0,25 mm 0,25 µm (J & W Scientific, USA). Plynová chromatografie dále využívala hmotnostním selektivním detektor (MSD) Trace DSQ Thermo Finnigan (Arcade, NY, USA). Jednotlivý vzorek, tzn. jeden perník o hmotnosti přibližně 10 g, se umístil do odměrné baňky o objemu 50 ml. Do baňky se přidalo 10 µl standardu akrylamidu ( 13 C 3 ) a zbylý objem byl doplněn po rysku baňky destilovanou vodou zahřátou na 60 C. Následně byly použity ultrazvukové vlny sloužící k destrukci buněk prostřednictvím ultrazvukové lázně, kde vzorek setrval po dobu 20 minut. Poté byl homogenit kvantitativně převeden do centrifugační zkumavky a centrifugován odstředivou silou 5000 g po dobu 30 minut. Následně se provedla bromace vzorku. Odstředěná tekutina v množství 5 ml se smíchala v baňce se 2 g bromidu draselného a kyselinou bromovodíkovou, která sloužila k dosažení optimální ph hodnoty vzorku 0 1. Poté následovalo chlazení vzorku. Do zchlazeného vzorku byly přidány 2 ml bromové vody. Celý obsah baňky se promíchal a byl umístěn do nádoby s drceným ledem do chladničky, kde byl ponechán po dobu 10 hodin. Po bromaci se nadbytek bromu titroval thiosíranem sodným (1 M) do odbarvení roztoku, čímž byla celá derivatizace ukončena. Obsah baňky byl následně převeden do teflonové odstředivé zkumavky a společně s 5 ml ethylacetátu se nechal protřepat po dobu 3 minut. Následovalo opět odstřeďování na centrifuze odstředivou silou 2000 g po dobu 5 minut. Po centrifugaci byl obsah zkumavky přenesen do skleněné kolony a následně byl stanoven obsahu akrylamidu pomocí GC/MSD. Každá z osmi variant perníku byla analyzována 8. Injekční teplota PTV vstřikovače byla udržována na 200 C. Teplotní program kolony byl 50 C udržován 1 minutu a poté následovalo zvyšování po 15 C za minutu až do 150 C s konečným časem zdržení 5 minut. GC/MSD teplota transferové linie byla udržována na teplotě 200 C. Kvantifikace byla provedena v selektivním iontovém módu na principu ionizace nárazem elektronů. Nosným plynem bylo hélium s rychlostí průtoku 1,5 ml za minutu. Byla provedena derivatizace analyzované látky, konkrétně bromace akrylamidu až na 2-brompropenamid. Za těchto podmínek byl retenční čas bromovaného akrylamidu a derivátů akrylamidu ( 13 C 3 ) 14,8 minut. 26

Akrylamid byl identifikován na základě retenčního času a ze získaného hmotnostního spektra 2-brompropenamidu byly zvoleny pro kvantifikaci ionty 149 m/z [C 3 H 79 4 BrNO] + a 151 m/z [C 3 H 81 4 BrNO] +. Kvantifikace byla provedena pomocí kalibrační křivky. Jako standard byl použit izotop akrylamidu ( 13 C 3 ). Rozdíly mezi variantami perníku a vliv přísad na variabilitu obsahu akrylamidu v perníku byly hodnoceny za použití jednocestné analýzy variance ANOVA, včetně post-hoc Tukeyova testu. Testy včetně korelační analýzy byly prováděny za použití programu STATISTICA 12 (StatSoft, Tulsa, OK, USA). Rozdíl byl považován za průkazný od 5% hladiny významnosti (p <0,05). 4.2.2 Senzorická analýza U vzorků pepřových perníků byla provedena senzorická analýza. Senzorické hodnocení probíhalo v prostorách Mendelovy univerzity. Místnost byla k tomuto účelu zcela přizpůsobená a splňovala požadavky normy ISO 8589. Hodnocení probíhalo v dopoledních hodinách. Panel posuzovatelů byl poskládán ze zkušených hodnotitelů. Hodnocení se účastnili muži i ženy různých věkových kategorií. Vzorky byly předloženy hodnotitelům najednou na bílém talíři, kde byly jednotlivé vzorky popsány čísly od jedné do osmi, viz obr. 4. Jako neutralizátor chuti byla použita voda. V rámci hodnocení byly posuzovány následující deskriptory: o tvar o barva o povrch o vůně (intenzita) o pórovitost o pevnost o chuť po koření o celková chuť o celkový dojem Hodnotitelé opakovali senzorické hodnocení celkem 3, a to ve třech po sobě jdoucích týdnech. Výsledky jsou pak zprůměrovány ze všech hodnocení. Zaznamenávání výsledků hodnotiteli se provádělo pomocí intenzivní nestrukturované grafické stupnice 27

se slovním popisem krajních bodů. Pro naše hodnocení byla zvolena úsečka o délce 100 mm. Formulář senzorického hodnocení perníků, který byl předložen hodnotitelům, obsahoval již zmíněné deskriptory s popisem. Barva perníku: světlá tmavá, tvar perníku: pravidelný nepravidelný, povrch perníku: celistvý vrásčitý, vůně (intenzita) perníku: výrazná nevýrazná, pórovitost perníku: pórovitý nepórovitý, tvrdost perníku: měkký, vláčný tvrdý, chuť po koření: výrazná nevýrazná, celková chuť: velmi dobrá, typická mdlá, s cizí příchutí a celkový dojem: vynikající špatný. Zpracování výsledků U vyplněných formulářů se pomocí pravítka změřila vzdálenost mezi hodnotitelem zaznamenaného bodu a počátkem přímky, který znázorňoval nulu. Ta odpovídala hodnotě v mm, kterým daný hodnotitel přiřadil vybranému parametru. Hodnoty byly zaznamenány do tabulky a pomocí programu Microsoft Office Excel 2007 se vytvořilo grafické znázornění. Rozdíly jednotlivých vzorků perníku byly hodnoceny za použití analýzy variance jednoduchého třídění ANOVA a následně druhým krokem analýzy rozptylu post-hoc testem, konkrétně byl použit Tukeyův test. Všechny analýzy byly provedeny v programu STATISTICA 12. Obrázek 4: Vzorky perníku při senzorickém hodnocení 28

4.2.3 Stanovení fyzikálních parametrů perníku Pro měření fyzikálních parametrů perníku byly použity vzorky připravené podle postupu uvedeného v kapitole 4.1. U všech osmi testovaných variant se provedlo stanovení fyzikálních parametrů. Pomocí analytických přístrojů se stanovovala barva a pevnost vzorků. Barva vzorků perníku byla stanovena podle souřadnic barvového prostoru L* a* b* na spektrofotometru CM-3500d (Konica Minolta, Osaka, Japonsko). Přístroj dokáže proměřit celou oblast viditelného spektra. Optický systém používá difuzní osvětlení a odrážené světlo je měřeno v 10 úhlu. Režim osvětlení přístroje byl D65. Pro stanovení barvy se použily výseky z horní plochy, spodní plochy a ze středu příčného řezu perníku. Analýza byla tedy použita na tři vzorky každé varianty perníku a opakovala se celkem 2. Pevnost byla měřena pomocí přístroje pro měření fyzikálních vlastností TIRATEST 27025 (TIRA Maschinenbau GmbH, Německo). U vzorků se testovala pevnost neboli tuhost materiálu. Měření každé varianty perníku se provádělo 8. Zkouška byla provedena penetrační válcovou sondou o průměru 3 mm při rychlosti 50 mm s -1. 29

5 VÝSLEDKY 5.1 Obsah akrylamidu Množství akrylamidu ve vzorcích bylo stanoveno pomocí kalibrační křivky, která vykazovala hodnoty koncentrace akrylamidu 25 1540 µg kg -1 s korelačním koeficientem 0,9989. Směrodatná odchylka byla stanovena na 10 %. Mez detekce byla 10 µg kg -1 a mez stanovitelnosti 25 µg kg -1. Obsah akrylamidu v perníku vyrobeném dle původní receptury činil v průměru 187 µg kg -1 viz obr. 5, což je průkazně nejvyšší hodnota ze všech testovaných variant (p < 0,05). 5.1.1 Vliv jednotlivých aditiv Vliv aditiv na obsah akrylamidu ve vzorcích byl analyzován a výsledky byly graficky znázorněny pomocí obrázku 5. Podle obrázku je patrné, že podstatné snížení obsahu akrylamidu dosáhl vzorek připravený kombinací všech použitých aditiv, resp. s náhradním kypřidlem a aditivy kyselinou citronovou a chloridem vápenatým (SCaC). Tento vzorek disponoval obsahem akrylamidu pod detekovatelnou hranicí 25 µg kg -1, a proto nemohla být vyznačena průkaznost rozdílu. Pokles akrylamidu ve variantě SCaC byl tedy více jak 86% v porovnání se vzorkem A. Ostatní kombinace aditiv vykazují také značné snížení obsahu akrylamidu, zejména varianty SC a ACaC, lišící se vzájemně pouze nepatrně. Jejich hodnoty vykazují snížení minimálně o 70 % oproti vzorku A. Výjimkou je vzorek s původním kypřidlem a kationtem (ACa), jehož obsah akrylamidu klesl o jen 48 % a průkazně se liší jak od varianty A, tak i od dalších variant s testovanými aditivy. Působení aditiv jako samostatných faktorů je znázorněno na obrázku 6. Jako nejvýznamněji působící aditivum se projevila kyselina citronová. Její přídavek v těstě způsobil více než 75% snížení obsahu akrylamidu v perníku ve srovnání se vzorkem připraveným bez jejího přídavku. Rozdíl mezi použitím a absencí chloridu vápenatého je 41 %, kde na snížení akrylamidu působí přítomnost chloridu. Skutečnost, že kyselina citronová je v otázce snižování obsahu akrylamidu účinnější aditivum než chlorid vápenatý, je potvrzena výsledky společného působení aditiv. I přes nízkou účinnost vápenatých iontů samostatně, kde rozdíl v obsahu při jeho použití a vynechání není statisticky 30

průkazný p < 0,05, viz obr. 5, působí značně v kombinaci s dalšími aditivy, především s kyselinou. Použití náhradního kypřidla, hydrogenuhličitanu sodného, je o 58 % účinnější při snižování obsahu akrylamidu než použití kypřidla původního, uhličitanu amonného. Lze předpokládat synergický účinek kombinace aditiv, vyvozený ze závislosti obsahu akrylamidu v perníku, na rostoucím množství použitých aditiv podle regresní rovnice: y = 158,8 47,94 x, R 2 = 0,42, kde x značí počet použitých aditiv. akrylamid [µg kg -1 ] 220 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 D C B AB AB A A A ACa S AC SCa SC ACaC SCaC vzorky Obrázek 5: Obsah akrylamidu ve vzorcích perníku. A vzorek perníku s uhličitanem amonným (NH 4 ) 2 CO 3 ; AC vzorek perníku s uhličitanem amonným a kyselinou citronovou (C 6 H 8 O 7 ); S vzorek perníku s hydrogenuhličitanem sodným (NaHCO 3 ); SC vzorek perníku s hydrogenuhličitanem sodným a kyselinou citronovou, ACa vzorek perníku s uhličitanem amonným a chloridem vápenatým (CaCl 2 ); ACaC vzorek perníku s uhličitanem amonným, kyselinou citronovou a chloridem sodným, SCa vzorek perníku s hydrogenuhličitanem sodným a chloridem vápenatým; SCaC vzorek perníku s hydrogenuhličitanem sodným, kyselinou citronovou a chloridem vápenatým. A D: různá statistická průkaznost lišící se na hladině P < 0,05; jednocestná ANOVA, post-hoc Tukeyův test 31

110 100 90 B A B 80 akrylamid [25 µg kg -1 ] 70 60 50 40 30 A A A 20 10 0 uhličitan amonný hydrogenuhličitan sodný chlorid vápenatý bez chloridu vápenatého kys. citronová bez kys.citronové aditiva Obrázek 6: Účinek testovaných aditiv na obsah akrylamidu v pernících. Uhličitan amonný (NH 4 ) 2 CO 3 (84 mmol kg -1 ); hydrogenuhličitan sodný NaHCO3 (154 mmol kg -1 ); chlorid vápenatý CaCl2 (83 mmol kg -1 ); kyselina citronová C6H8O7 (38 mmol kg -1 ); A, B: různá statistická průkaznost lišící se na hladině P < 0,05; jednocestná ANOVA, post-hoc Tukeyův test 5.2 Senzorické hodnocení perníku 5.2.1 Vyhodnocení dotazníku Vzorky perníku byly připraveny podle výše popsané metody a předloženy hodnotitelům. Již po upečení byly na jednotlivých vzorcích patrny rozdílné senzorické odchylky, především barevné a tvarové, či rozdílná pórovitost. Senzorické hodnocení vzorků pepřového perníku se provádělo pomocí intenzivní nestrukturované grafické stupnice. Zjištěné hodnoty, resp. průměrné hodnoty všech měření, jsou uvedeny v tabulce 5. Jak vyplývá z výsledků, nejhoršího celkového hodnocení dosáhl vzorek připravený s původním kypřidlem a přídavkem kyseliny citronové (AC), který však není statisticky průkazný a vzorek s původním kypřidlem kyselinou a kationtem (ACaC). Nejlepším celkovým dojmem působil na hodnotitele vzorek s alternativním kypřidlem (S), viz 32

obr. 13, který obsahuje oproti dvěma zmíněným variantám akrylamidu více. Nejmarkantnější rozdíly jednotlivých vzorků byly v kategoriích barva a tvrdost. Barevná rozdílnost nejsvětlejšího vzorku oproti vzorku nejtmavšímu byla až 79 % a rozdíl nejměkčího vzorku oproti vzorku nejtvrdšímu byl až 64 %. Nejvyšší hodnoty obou parametrů byly přiřazeny vzorku s původním kypřidlem a kyselinou (AC). Tabulka 5: Výsledky senzorické analýzy perníků. a h: indexy lišící se významností (P < 0.05), post-hoc Tukeyův test hodnocený parametr varianta vzorku [mm] A AC S SC ACa ACaC SCa SCaC Barva 60,72 d 79,52 e 31,93 c 47,06 b 36,78 bc 12,54 a 26,33 b 7,33 a Tvar 40,19 a 40,31 a 24,94 a 25,89 a 21,93 a 28,17 a 25,85 a 22,83 a Povrch 42,87 c 41,33 c 31,54 bc 33,07 abc 38,78 c 17,63 ab 27,13 abc 12,30 a Vůně 54,89 b 55,70 b 20,87 a 44,96 b 40,63 ab 55,44 b 40,41 ab 36,19 ab Pórovitost 30,85 a 31,52 a 46,60 abc 56,44 bc 36,00 ab 44,26 abc 57,56 c 44,85 abc Tvrdost 55,52 bc 73,96 c 9,44 a 50,37 b 19,00 a 62,41 bc 54,78 bc 60,85 bc Chuť po koření Celková chuť Celkový dojem 40,07 a 46,67 a 39,67 a 38,44 a 26,33 a 36,89 a 45,44 a 36,60 a 49,30 bc 65,56 c 23,89 a 46,07 bc 49,96 bc 66,52 c 51,19 bc 38,41 ab 52,56 bcd 70,78 d 23,44 a 46,07 b 49,81 bc 67,66 cd 49,56 cd 44,93 bc 33

celkový dojem [mm] 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 d cd bcd bc cd b bc a AC ACaC A ACa SCa SC SCaC S vzorky Obrázek 7: Výsledky celkového dojmu vzorků senzorického hodnocení. 0 mm (celkový dojem vynikající) 100 mm (celkový dojem špatný); a d: indexy lišící se významností (P < 0.05), post-hoc Tukeyův test 5.2.2 Fyzikální parametry Pokud jde o otázku barevnosti vzorků, jde o parametr, který se kromě analýzy hodnotitelů stanovoval také pomocí instrumentální metody na spektrofotometru, viz kapitola 4.2.3. V rámci senzorického hodnocení byla nejtmavší barva přiřazena jednoznačně vzorku AC, jak již bylo poznamenáno. Vysokého hodnocení dosáhl i vzorek s původním kypřidlem (A). Nejsvětlejším vzorkem analýzy byl stanoven vzorek (SCaC), tedy vzorek s náhradním kypřidlem, kyselinou a kationtem. To odpovídá spektrofotometricky stanoveným výsledkům. Výsledkem měření barevnosti instrumentálně byly souřadnice L*a*b*. L* jako luminace neboli složka světlosti, a* chromatická složka, odpovídající zbarvení od zelené po červenou barvu a b* chromatická složka, odpovídající zbarvení od modré do žluté barvy. L*a*b* souřadnice jsou uvedeny v tabulce 6. Z výsledků barevnosti instrumentální metodou plyne, že nejsvětlejší byly varianty perníku obsahující kyselinu a ionty vápníku (SCaC a ACaC). Nejtmavší barvu měl vzorek s původním kypřidlem a kyselinou (AC). V porovnání se hodnoty barevnosti, zjištěné senzorickou analýzou a barvou měřenou instrumentálně, až na malé výjimky shodují. 34

Pevnost vzorků byla stanovena pomocí přístroje TIRATEST. Výsledky, zobrazené v tabulce 6, ukazují jako nejtvrdší vzorek, neboli kladoucí největší odpor, vzorek ACaC, tedy vzorek s původním kypřidlem s přídavkem kyseliny citronové a chloridu vápenatého. Výsledky senzorického dotazníku potvrzují tuto skutečnost, ohodnocením jako druhého nejtvrdšího vzorku. Nejmenší odpor pak kladla varianta S, s použitím náhradního kypřidla bez aditiv, a to v obou hodnocených případech, stanovená senzoricky i instrumentálně. Korelační koeficient mezi fyzickou a subjektivní pevností byl 0,54. Výsledky obou metod se víceméně shodují. Tabulka 6: Výsledky měření fyzikálních parametrů perníků hodnocený varianta vzorku parametr A AC S SC ACa ACaC SCa SCaC Pevnost [N] 3,1 4,73 1,78 2,84 2,66 5,38 4,40 4,67 barva [mm] L* 54 49 57 61 52 60 59 65 A* 13 12 13 10 12 10 11 9 B* 29 27 37 32 28 29 34 31 35

6 DISKUSE 6.1 Obsah Akrylamidu Snižování obsahu akrylamidu v potravinách je hojně diskutované téma (Anese a kol., 2009). Již mnohé studie se zabývaly možnostmi snižování obsahu tohoto toxinu v různých výrobcích. Výsledky se mírně liší v závislosti na použitých aditivech, či v důsledku různého technologického postupu výroby. Společně se však shodují, že k eliminaci akrylamidu přispívá velkou měrou především náhrada kypřícího prostředku uhličitanu amonného za přípravek jiný. 6.1.1 Vliv jednotlivých aditiv Vliv jednotlivých aditiv na obsah akrylamidu v perníku je značný. Jak již bylo zmíněno, použitím alternativního kypřidla, chloridu vápenatého a kyseliny dává v kombinaci pozitivní výsledek účinné minimalizace obsahu akrylamidu až o 86 %. Toto procento snížení je velmi vysoké, nicméně různé studie potvrdily, že lze dosáhnout i poklesu většího. Podle Ciesarové a kol. (2009), až 97 %. Dosaženo těchto výsledků bylo s použitím enzymu L-asparaginázy. Kyselina citronová, jako prokazatelně nejúčinněji samostatně působící aditivum, je významná v receptuře i z hlediska výsledné barevnosti produktu. Podle Amreina a kol. (2007), s rostoucím obsahem použité kyseliny klesá obsah akrylamidu. To se potvrdilo i v naší studii. Stejně jako všechny kombinace aditiv, kde byla zahrnuta kyselina, vykazovaly nejnižší obsah akrylamidu. Množství kyseliny v těstě bylo okolo 7 g kg -1 těsta. Podle Amreina a kol. (2004), lze dosáhnout úspěšné eliminace akrylamidu již při přídavku 5 g kg -1 těsta. Posouzením vzhledu jednotlivých vzorků se jeví, že tam, kde byla kyselina citronová, došlo k tmavnutí a vzniku skvrnitosti v důsledku skladování po dobu 6 měsíců. To je dobře patrné ve variantě AC, kde je aditivem pouze kyselina. Zde jsou i na povrchu nápadné skvrny a celkové výrazné ztmavnutí. Varianta AC v průběhu skladování tedy výrazně změnila své vzhledové vlastnosti k horšímu. Ve variantě ACaC je toto ztmavnutí a skvrnitost menší, ale stále dobře patrná zejména na základně. Tyto vady nebyly patrny ještě ani po 2 3 měsících skladování. Lze se tedy domnívat, že vliv kyseliny alespoň částečně blokovaly ionty Ca 2+. Ty působí v těstě zvýšením ph, což vede k omezení vzniku HMF. Ještě výraznější předpokládaná blokovací funkce je ve variantě SC, což lze přičítat působení sody, a skvrny nejsou v žádném z opakování patrné. 36

Vápenaté ionty svým působením dosáhly kladných výsledků, nicméně jako samotně působící vykazují nejmenší vliv na akrylamid. Nepotvrzuje se tedy výsledek podle Gokmena a kol. (2007), že Ca 2+ působí jako úplná prevence vzniku akrylamidu. Ve variantách bez kyseliny, tj. S, SCa, ACa a A, se skvrnitost v důsledku skladování neprojevila. Ztmavnutí základny je patrné také ve dvou variantách, A a ACa, které mají i nejvyšší obsah akrylamidu. Už ve variantě S, tedy třetí v pořadí s nejvyšším obsahem akrylamidu, je již základ světlý, podobně jako u zbývajících variant bez vlivu kyseliny. Z toho lze usoudit, že tmavnutí způsobuje HMF. Výjimkou je varianta SCaC, která je jednoznačně nejsvětlejší, nejpravidelnějšího tvaru a bez vzhledových vad i po půlročním skladování. V této variantě nebyl akrylamid potvrzen v rámci detekčního limitu. To potvrzuje synergický efekt zkoušených aditiv, který dosud prokázán nebyl. Navíc zde zůstaly zachovány senzorické vlastnosti oproti kontrolní variantě, kterou vzhledově předčí zachováním jednotné barevnosti povrchu. Hypotézu o předpokládané existenci synergie se tedy podařilo prokázat. Tvrzení, že kyselina v receptu působí na snižování obsahu akrylamidu účinněji než kation vápníku, potvrzují i výsledné hodnoty získané přidáním ke kypřidlu. Tzn. vzorek ACa ve srovnání s AC a SCa ve srovnání s SC, kde byla v obou případech nižší hodnota za použití kyseliny. Amrein a kol. (2007) udává dokonce až 90 % snížení obsahu akrylamidu za použití NaHCO 3 a kyseliny. Přestože se v tomto případě jedná o kyselinu vinnou, lze předpokládat podobné účinky i s použitím kyseliny citronové. Porovnáme-li výsledné hodnoty vzorků upečených se stejnými aditivy a různým kypřidlem, zjistíme, že rozdíl obsaženého akrylamidu není velký. Lepších výsledků však dosahuje vzorek s kypřidlem alternativním, který měl obsah akrylamidu pod detekovatelnou hodnotou 25 µg kg -1, jak již bylo řečeno. Kurková a kol. (2013) zkoumala vliv kypřících prostředků na formování akrylamidu a hydroxymethylfurfuralu v cereálních produktech. Zatímco při použití uhličitanu amonného došlo k výraznému zvýšení akrylamidu, obsah hydroxymethylfurfuralu zůstal nezměněn. Při náhradě hydrogenuhličitanem však došlo k velmi vysoké redukci této látky, až 95 %. Jak bylo řečeno, přestože náhradou kypřidla původního za kypřidlo alternativní v perníku získáme velmi znatelný rozdíl obsahu akrylamidu, v kombinaci obou variant s aditivy se výsledný obsah akrylamidu liší pouze několika procenty. Z toho lze usuzo- 37