Shrnutí webináře Dystrofin 101: vše, co jste kdy chtěli vědět o dystrofinu (a nebáli jste se zeptat) Francesco Muntoni (University College of London), John Porter (PPMD) Dystrofinopatie: DMD versus BMD cílem mnoha terapií je dostatečně zvýšit hladinu dystrofinu a změnit DMD fenotyp na BMD Funkce dystrofinu na svalové membráně (obr. Jill Rafael-Fortney) dystrofin je součástí dystrofin-glykoproteinového komplexu (DGC), který propojuje aktinová vlákna cytoskeletu uvnitř buňky (F-actin) s extracelulární matrix (mezibuněčnou hmotou). mutace v genu pro dystrofin vede k vytvoření zkráceného nebo žádného proteinu Patogeneze DMD při absenci dystrofinu přicházíme i o další složky dystrofin-glykoproteinového komplexu a ztrácí se kontakt mezi nitrobuněčným a mimobuněčným prostředím vytváří se trhliny v sarkolemě (cytoplazmatická membrána na povrchu svalových vláken) svalová kreatinkináza (mck) se dostává ven z buňky, vápníkové ionty ve zvýšené míře pronikají do buňky, aktivují se enzymy proteázy DGC také plní mnoho signalizačních funkcí, takže dojde k celé řadě změn v signalizačních drahách 1
Gen protein gen se skládá z exonů (kódujících oblastí) a intronů (nekódujících úseků), které však také plní určité funkce (například hrají roli v regulaci exprese apod.) gen (DNA) je transkribován a vzniká pre-rna a po vystřižení intronů hotová mrna mrna se překládá (translatuje) do pořadí aminokyselin, které vytváří protein Dystrofinový gen ohromný gen, který je umístěn na X chromozomu (lokus: Xp21) jeden z největších lidských genů má celkem 2,5 megabází (A,T,G,C) (exony + introny) v různých tkáních jsou exprimovány různé izoformy dystrofinu (např. kratší izoforma v mozku) vzhledem k velikosti genu dochází k záměnám nukleotidů po celé délce genu (jednonukleotidový polymorfismus) doposud bylo zaznamenáno 741 variant genu jen některé z nich vedou ke vzniku onemocnění, jiné nemají žádné důsledky Transkript dystrofinu (mrna) dystrofinový gen má 79 exonů velmi rozsáhlý, i po odstranění intronů má transkript 2400 kilobází vytvoření jedné kopie dystrofinové mrna (transkripce) trvá 16 hodin Protein dystrofin kompletní izoforma proteinu v kosterním svalu se skládá z 3500 aminokyselin actin binding sites místo, kde se dystrofin váže na aktinová vlákna uvnitř buňky uprostřed proteinu je mnoho opakujících se motivů spectrin-like repeats, díky kterým je možné využívat metody jako exon skipping (protože se můžeme obejít bez určitých těchto úseků) vazebná místa pro součásti dystrofin-glykoproteinového komplexu: dystroglykan, dystrobrevin, syntrofin mají důležité signalizační funkce nefunkční protein naruší funkci celého tohoto komplexu a jeho signalizační funkce 2
Mutace dystrofinu velké delece ( 1 exon) se týkají asi 65 % DMD/BMD pacientů 5 % pacientů má duplikace 15% chlapců má nonsense mutace zbytek pacientů má mutace s posunem čtecího rámce inzerce/delece, splice-site mutace a missense mutace DMD versus BMD velikost delece nekoreluje se závažností mutace (např. delece uprostřed mívá mírnější projevy, zatímco delece v klíčových doménách mívá vážné důsledky) nejpřesnější korelace mezi mutací a fenotypem je založena na tom, zda při deleci došlo či nedošlo k posunu čtecího rámce delece se zachováním čtecího rámce obvykle vedou k translaci proteinu s částečnou funkcí - BMD Molekulární strategie pro DMD cílem je: 1) nahradit dystrofinový gen (zatím pouze zvířecí modely) a) genová terapie (AAV) b) terapie kmenovými buňkami 2) nenahrazovat mutantní gen, ale ovlivnit jeho další zpracování (mrna) a) antisense oligonukleotidy: způsobí exon skipping (pacienti s delecí) b) malé molekuly čtení přes stop kodony 3
DMD gen ne všechny exony mají stejný tvar při deleci u DMD do sebe exony nezapadají, proto nevznikne funkční protein nezávisí tolik na velikosti delece, jako na konkrétním typu delece např. tato mutace vede k BMD (zachování genetického kódu), delece je sice větší než v předchozím případě, ale exony do sebe zapadají a může tedy vzniknout funkční protein díky tomu existuje možnost terapie pomocí exon skippingu (v tomto případě přeskočení exonu 51 u DMD), tím dojde k obnově čtecího rámce a vzniku funkčního transkriptu Nonsense mutace nechybí žádná část genu, ale dojde k záměně jednoho nukleotidu (jedno písmenko genetického kódu je špatně napsané), např. v exonu 11 Měření dystrofinu během klinických studií existuje několik možností v ranější fázi studie slouží k tomu, aby se potvrdilo, zda lék účinkuje tak, jak má (vede k produkci alespoň určitého množství dystrofinu), obvykle na jednom/několika málo klinických pracovištích v pokročilejší fázi studie (obvykle fáze II / III) může sloužit jako pomocný cíl spolu s další klinickými cíli, obvykle na mnoha pracovištích (př. 20 30) je otázkou, zda by se dystrofin mohl považovat za náhradní cíl (surrogate endpoint), zatím se tak ještě nestalo to znamená, že bychom automaticky předpokládali, že lék funguje, pokud množství dystrofinu přesáhne určitou hodnotu Může být dystrofin měřen spolehlivě? ANO různé laboratoře mohou používat lehce odlišné technologie, ale je potřeba, aby nedocházelo k různým výsledkům byla provedena studie zkoumající tuto variabilitu 5 laboratoří zkoumalo 6 biopsií pomocí imunohistochemie a Western Blot 4
výsledky dopadly velmi podobně mezi oběma technikami i jednotlivými laboratořemi (publikováno v Neurology) existují i další techniky ke spolehlivé kvantifikaci dystrofinu, např. hmotnostní spektrometrie zatím nemáme dostatek informací k tomu, zda by se množství dystrofinu mohlo považovat za surrogate endpoint, ale snad v budoucnu budeme mít a pak budeme vědět, zda to je možné Otázky 1. Je důležité, aby léky zaměřené na obnovení množství dystrofinu mohly prokázat produkci dystrofinu? pokud byste například vyvinuli nový lék na dosud nepřeskočený exon, tak byste asi nejdříve chtěli zjistit, zda má lék in vivo takový účinek, jaký má mít, a asi byste se nespoléhali jen na kulturu fibroblastů nebo myoblastů není tedy pochyb o tom, že zpočátku to je potřeba v současné fázi vývoje léků na DMD se stále dozvídáme mnoho informací o tom, jakým způsobem dochází k obnově dystrofinu u pacientů s měřením dystrofinu jsou samozřejmě spjaty i problémy na základě mdx modelů víme, že při biopsii je jistá variabilita v hladině dystrofinu z různých svalů jedné myši, proto je obtížné hodnotit, jak dobře tato myš reaguje, ale pokud vezmeme skupinu myší pro zjištění vhodné dávky, tak určitě můžeme dobře zkoumat různé dávkování pokud lze získat spolehlivé informace, pak je to určitě užitečné 2. Jaký je rozdíl mezi bodovou a nonsense mutací? bodová mutace je záměna jedné báze v DNA v důsledku toho může dojít k záměně aminokyseliny (např. kodon TGC kóduje cystein, zatímco při změně na TGG vznikne tryptofan), nebo může jít o tichou mutaci, kdy i při změně nukleotidu nedojde k záměně aminokyseliny a mutace nemá žádný klinický význam pokud by se bodovou mutací změnil kodon na TGA, což je stop kodon, znamenalo by to předčasné ukončení translace v tomto případě se jedná o nonsense mutaci (nonsense mutace je tedy podtypem bodové mutace). 3. Domníváte se, že všechny exon skipping strategie lze považovat za rovnocenné v produkci dystrofinu? všechny exon skipping léky vedou k přeskočení exonu a tvorbě dystrofinu účinnost každého léku může být trochu odlišná nedávno vyšel v Nature Medicine článek o tcdna, které mají odlišnou chemickou strukturu kromě účinnosti je tedy podle mě dalším významným faktorem přístupnost látky (nakolik je jí tkáň vystavena) tcdna se dostávají do tkání lépe a na rozdíl od mnoha v současnosti testovaných molekul přechází hematoencefalickou bariéru kromě toho záleží i na tom, jakou dávku lze bezpečně podat, např. některé morfolino oligomery jsou velmi účinné, ale mohou být toxické 4. Jaká je korelace výsledků získaných pomocí imunohistochemie a Western Blot? zmiňovaný článek z Neurology je k dispozici online (http://www.neurology.org/content/early/2014/10/29/wnl.0000000000001025.full.pdf) není to perfektní, ale stále velmi dobrá statistická korelace jednou z komplikací může být to, že při Western Blot (i hmotnostní spektrometrii) se zkoumá homogenizát svalu (když se však dystrofin neváže dobře na některém z konců k aktinu či dystrofin-glykoproteinovému komplexu, není na vzorku poznat, odkud dystrofin pochází a zda tedy plní svou funkci) (u zdravého svalu či při podávání léků zaměřených na změnu fenotypu na BMD je však vysoká korelace) 5
5. Mají pacienti s nonsense mutací jinou úroveň dystrofinu ve srovnání s pacienti s delecí? to je velmi individuální někteří pacienti s nonsense mutací mají mírnější fenotyp záleží na tom, kde k mutaci došlo (mutace nemusí být dostatečná na to, aby zničila mrna, takže se může produkovat určité množství dystrofinu) obecně jsou poměrně ekvivalentní nonsense mutace a delece se změnou čtecího rámce 6. Jaká je spolehlivost měření dystrofinu? je velký rozdíl v tom, zda studie probíhá na jednom/několika málo pracovištích nebo v mnoha centrech po celém světě, kdy může být získání a zpracování vzorků z tolika míst náležitým způsobem problematické s tím se potýkaly některé větší mezinárodní studie, vzniklo mnoho logistickým problémů, protože se takto velké studie dělaly poprvé musíme se toho ještě hodně naučit o metodologii a kvantifikaci dystrofinu současné metody ukazují, že léčba dokáže obnovit hladinu dystrofinu na úroveň, která pravděpodobně bude mít určité klinické benefity, což by mělo být využito k urychlení schvalovacího procesu namísto čekání na nové technologie současné technologie podle mě plně dostačují k tomu, aby odpověděly na otázku hladiny dystrofinu a výsledky byly reprodukovatelné mezi laboratořemi v budoucnu se určitě objeví další metody, které dokáží dystrofin kvantifikovat lépe, ale existuje určitý bod, kdy biologická variabilita dystrofinu výrazně převýší přesnost měření (můžete sice měřit velice přesně, ale pokud je mezi dvěma svaly např. 10% biologická variabilita, pak je přesnost měření na 0,000001% zbytečná) 20. března se bude konat workshop FDA o metodologii kvantifikace dystrofinu a bude k dispozici webcast 6