Příprava, charakterizace a porovnání nanočástic připravených tepelným rozkladem v pevné fázi a nanočástic vzniklých biomineralizací (bakteriální magnetické nanočástice) Obecný úvod Nanočástice oxidů železa Magnetické nanočástice oxidů železa jsou jednou z nejvíce dnes zkoumaných oblastí nanosvěta. To je dáno jejich specifickými vlastnostmi (velikost a distribuce částic, tvar resp. krystalografie, či jejich magnetické vlastnosti), které je možné řídit způsobem jejich přípravy. Magnetické nanočástice pak nacházejí uplatnění v řadě aplikací: magnetická rezonanční zobrazení (MRI), kontrastní látky, v protinádorové terapii využívající principu hypertermie, značení buněk. Pokud jsou nanočástice vhodně povrchově upraveny, pak mohou být též použity pro imobilizaci (vyvázání) léků, proteinů, enzymů, nukleových kyselin a dalších aktivních látek pro jejich purifikaci či transport do oblastí jejich účinku. Možnost uplatnění různých oxidů železa je především dáno jejich velikostí částic a magnetickými vlastnostmi, které patří mezi stěžejní charakteristiky nanočástic. Oxidy železa se vyskytují v několika formách, které se liší svými vlastnostmi. Nejznámějším z nich je hematit (alfa-fe 2 O 3 ). Jedná se o slabě feromagnetickou látku při pokojové teplotě, což znamená, že jeho výsledné magnetické pole je velmi slabé. Díky svým katalytickým vlastnostem je však využíván při fotochemických reakcích. Magnetit (Fe 3 O 4 ) a maghemit (gama-fe 2 O 3 ) pak patří mezi oxidy se silným magnetickým polem a díky jejich biokompatibilitě nacházejí uplatnění v medicínských i průmyslových aplikacích. Vzácnými formami oxidu železitého jsou pak beta- a epsilon- Fe 2 O 3, které se v přírodní formě prakticky nevyskytují. Nanočástice oxidů železa se běžně připravují pomocí chemických metod, avšak stále vyšší zájem se obrací i k využití magnetických nanočástic vzniklých v přírodě procesem biomineralizace (příkladem může být vznik biogenního magnetitu magnetotaktickými bakteriemi). Obr. 1 Ukázky magnetických nanočástic připravených (zleva) reakcí v pevné fázi (laboratorní cesta) a izolací z magnetozomů produkovaných magnetotaktickými bakteriemi.
Příprava nanočástic oxidů železa metodou tepelného rozkladu v pevné fázi Příprava nanočástic oxidů železa touto metodou spočívá v rozkladu pevnolátkového prekurzoru působením tepla. Kombinací vhodné teploty, času a prekurzoru, můžeme ovlivnit vlastnosti výsledných nanočástic. Výhodou této metody je především snadná příprava a to i většího množství částic, z toho vyplývá i jejich poměrně nízká cena. Jednou z vlastností takto připravených částic je schopnost ponechat si morfologii původního materiálu. Cílem této úlohy je připravit magnetické nanočástice tepelným rozkladem octanu železitého. Rozkladem tohoto prekurzoru vzniknou magnetické částice γ-fe 2 O 3 (maghemitu) s malou příměsí α-fe 2 O 3 (hematitu). Příprava nanočástic oxidů železa izolací z magnetozomů produkovaných magnetotaktickými bakteriemi Magnetospirillum gryphiswaldense Magnetotaktické bakterie (MTB) patří mezi zvláštní skupinu bakterií, které se mohou orientovat podle magnetického pole země za účelem určení jejího nejpřirozenějšího prostředí. Do této skupiny bakterií patří i Magnetospirillum gryphiswaldense MSR-1, která patří mezi dobře laboratorně kultivovatelný druh. Tyto bakterie jsou schopny produkovat ferimagnetické nanočástice magnetitu (tvaru kubooctahedral) s průměrnou velikostí cca 40 nm, tedy magnetické nanočástice o velikosti chemickou cestou ve zkumavce obtížně připravitelné. Tyto nanočástice jsou však v buňce obaleny fosfolipidovou membránou, která tak vytváří speciální kompartmenty - magnetozomy, které jsou v buňce uspořádané do řetízků a fungují tak jako malé střelky kompasů, čímž umožňují buňce vnímat vnější magnetické pole a využít jej tak k vlastní orientaci. Magnetozomální membrána však neobsahuje pouze lipidy, ale i proteiny. Také endotoxin lipopolysacharidu může být asociovaný s touto membránou. Tyto složky pak mohou být příčinou zvýšení toxicity bakteriálního magnetitu, a pro porovnání se syntetickými nanočásticemi bude v následující úloze povrch magnetitu upraven, a to odstraněním membrány. Obr. 2 Snímek pořízený Transmisní elektronovou mikroskopií: Magnetospirillum gryphiswaldense MSR-1 obsahující řetízek magnetozomů
Metody charakterizace připravených nanočástic oxidů železa SDS-PAGE elektroforéza SDS-PAGE elektroforéza v polyakrylamidovém gelu v přítomnosti dodecylsíranu sodného, je technika používaná v biochemii, genetice, imunologii, mikrobiologii a molekulární biologii k separaci a identifikaci proteinů na základě jejich elektroforetické pohyblivosti. Zde bude tato metoda využita k identifikaci rozpuštění magnetozomální membrány a to stanovením zbytkových proteinů, které jsou v membráně integrovány či s magnetozomální membránou asociovány. Budou tak porovnány vzorky magnetozomů (tedy s membránou) a biogenního magnetitu, u nějž byla membrána odstraněna. Obr. 3 SDS-PAGE elektroforéza - porovnání. Line1 - proteiny magnetozomální membrány, Line2 - proteiny po rozpuštění membrány SDS nebyly detekovány, Line3 - nedokonalé odstranění membrány - byly detekovány proteiny, avšak v nižší koncentraci, Line4 - standart proteinů s jejich definovanou molekulovou hmotností Mössbauerova spektroskopie 57 Fe Mössbauerova spektroskopie je prvkově selektivní metoda pro strukturní a magnetickou charakterizaci železo obsahujících materiálů v pevné fázi. Její význam se projevuje zejména v případě nanomateriálů, neboť výsledky nejsou příliš ovlivněny krystalinitou vzorku, ani velikostí částic. Velmi snadno je například možné odlišit maghemit a magnetit, které jsou strukturně izomorfní a zejména v případě velmi malých nanočástic je velmi obtížné je užitím rentgenové práškové difrakce odlišit. Kromě identifikace železo obsahujících fází Mössbauerova spektroskopie poskytuje kvantifikaci zastoupení jednotlivých fází (s detekční mezí asi 3 %). Relativní plochy subspekter vyjádřené v procentech odrážejí relativní počty atomů železa v jednotlivých identifikovaných fází (tedy nemusí vyjadřovat hmotnostní zastoupení nutno přepočítat!) Na obr. 4 jsou zobrazena Mössbauerova spektra a) nanočástic magnetitu připraveného reakcí v pevné fázi, b) magnetozomů měřená při pokojové teplotě. Zatímco magnetit připravený reakcí v pevné fázi je prakticky stechiometrický (poměr ploch subspekter je přibližně 1:2), biogenní magnetit (magnetozomy) vykazuje značnou nestechiometrii jako důsledek částečné povrchové oxidace během samotného
izolačního procesu magnetozomů z bakterií. Tato nestechiometrie se ve spektru projevuje ve změně poměru ploch subspekter (asi 1:1) Obr. 4 a) Mössbauerova spektra a) nanočástic magnetitu připraveného reakcí v pevné fázi, b) magnetozomů. Zadání úlohy: Úloha A Příprava nanočástic oxidů železa reakcí v pevné fázi, strukturní a magnetická charakterizace nanočástic užitím Mössbauerovy spektroskopie - dle postupu připravte nanočástice oxidu železa - stanovte fázové složení připraveného materiálu užitím Mössbauerovy spektroskopie Úloha B Příprava nanočástic oxidů železa izolací z magnetosomů produkovaných magnetotaktickými bakteriemi Magnetospirillum gryphiswaldense, ověření odstranění membrány pomocí SDS-PAGE elektroforézy, charakterizace nanočástic užitím Mössbauerovy spektroskopie - dle postupu připravte nanočástice oxidu železa: odstraňte magnetozomální membránu a stanovte zbytkový obsah proteinů absorbovaného na povrchu nanočástic po jejím odstranění, a to metodou SDS-PAGE - stanovte fázové složení připraveného materiálu užitím Mössbauerovy spektroskopie
Úloha A Příprava nanočástic oxidů železa metodou reakce v pevné fázi Postup: - Octan železnatý předsušíme v elektrické laboratorní sušárně při teplotě 80 C po dobu jedné hodiny. Předsušením získáme materiál zbavený adsorbované vody. Takto připravený prekurzor ještě lehce podrtíme ve skleněné třecí misce. - Navážíme 1g této látky a v co možná nejtenčí a nejsouvislejší vrstvě volně rozsypeme na velkou plochou keramickou misku. - Misku se vzorkem vložíme do laboratorní pícky vyhřáté na teplotu 400 C a ponecháme v ní jednu hodinu. Je nutné, aby teplota v peci co nejméně kolísala kolem nastavené hodnoty a působila na vzorek v misce rovnoměrně. Proto je laboratorní pec vybavena kvalitním programovatelným regulátorem a přesnými čidly teploty. - Po uplynutí doby jedné hodiny vyjmeme misku se vzorkem z pece a necháme vychladnout. - Vzniklý prášek obsahující nanočástice sesypeme na achátovou třecí misku a lehkým protřením dokonale homogenizujeme. - S takto připravenými částicemi můžeme dále pracovat a podrobit je komplexní charakterizaci. Charakterizace připravených nanočástic užitím Mössbauerovou spektroskopie Postup: 15-20 mg vzorku zabalíme do vážicího papírku a následně do parafilmu. Dbáme na rovnoměrné rozvrstvení zabaleného vzorku. Zabalený vzorek vložíme do plastové měřicí cely a do Mössbauerova spektrometru pro měření při pokojové teplotě. Necháme načítat experimentální body spektra alespoň 24 hodin. Vyhodnotíme naměřené spektrum užitím vhodného software (např. Mosswinn, Confit). Na základě hodnot hyperjemných parametrů a relativních ploch subspekter provedeme identifikaci a kvantifikaci oxidů železa. Dle možností necháme vzorek charakterizovat pomocí rentgenové práškové difrakce, transmisní a skenovací elektronové mikroskopie, případně změříme specifickou plochu povrchu užitím fyzisorpce BET.
Úloha B Příprava nanočástic oxidů železa izolací z magnetosomů produkovaných magnetotaktickými bakteriemi Magnetospirillum gryphiswaldense Postup: Příprava magnetitu izolací z magnetozomů: odstranění membrány - Magnetozomální membránu odstraníme povařením magnetozomů v 1% roztoku SDS. - 5 ml magnetozomů o koncentraci 1 mg magnetitu/ml zakoncentrujeme pomocí magnetu. - Supernatant odpipetujeme a magnetozomy resuspendujeme v 5 ml 1% SDS a reakční směs ve skleněné vialce umístíme do vodní lázně vytemperované na 100 C a necháme 30 min povařit. - Poté suspenzi necháme zchladnout a za pomocí magnetické separace magnetit 5 x promyjeme stejným objemem destilované vody. Promývání provádíme vždy 10-ti minutovou sonikací v lázni a následnou magnetickou separací a odstraněním supernatantu. - Pro určení, zda membrána magnetozomů byla odstraněna, bude stanoveno zbytkové zastoupení proteinů na nanočásticích magnetitu a porovnáno s proteiny magnetozomální membrány bez působení SDS.Toto stanovení provedeme metodou diskontinuální elektroforézy v polyakrylamidovém gelu (SDS-PAGE) Příprava vzorku pro SDS - elektroforézu - Ke vzorku (100 µl, pro nanesení by mělo být ve vzorku asi 100 µg magnetitu) se přidá 100 µl Sampling buffer (Sample buffer, Laemmli 2x concentrate, Sigma) a povaří se 10 min. 20 µl suspense bez magnetické části (ta se stáhne magnetem) se nanese do důlku na gel pomocí pipety. - Pro elektroforézu použijte 2-5 µl standardu (LS- low standard). SDS-PAGE elektroforéza - Připravíme si sklíčka - odmastí se ethanolem, složí se do aparatury dle pokynů vedoucího praktika. - Podle tabulky si připravíme dělící gel (running gel): do kádinky - za stálého míchání se napipetují jednotlivé komponenty dle tabulky uvedené níže. Tabulka: dělící gel Gel AA/Bis [30%/0,8%] TRIS.HCl [1,5 M, ph 8,8] H 2 O 10% SDS 10% APS TEMED 12% 4 ml 2,5 ml 3,2 ml 0,1 ml 0,05 ml 0,01 ml - Po přídavku APS a TEMEDu začne gel tuhnout, proto jej rychle napipetujeme mezi skla (asi 1,2 cm pod okraj) a převrstvíme jej n-butanolem. - Gel necháme 20-30 min ztuhnout.
- Po uplynutí doby pro polymeraci gelu odstraníme z povrchu n-butanol a povrch gelu opláchneme destilovanou vodou - Podle tabulky si připravíme zaostřovací gel (stacking gel) - obdobně jako dělící gel. Tabulka: zaostřovancí gel Gel AA/Bis [30%/0,8%] TRIS.HCl [0,5 M, ph 6,8] H 2 O 10% SDS 10% APS TEMED 4% 0,65 ml 1,25 ml 2,95 ml 0,1 ml 0,06 ml 0,01 ml - Roztok po přidaní APS a TEMEDu rychle promícháme a přeneseme na dělící gel zarovno s menším sklem tak aby nikde nevznikly bublinky a pomalu vložíme hřeben (vkládáme jej zešikma) a rovně jej usadíme na sklo. - Gel necháme opět 30 min ztuhnout. - Po ztuhnutí vyjmeme skla a vložíme jej do aparaturky a tu následně do elektroforetické vany. - Dno (do asi 3 cm) a prostor mezi skly (až po jejich okraj) zalijeme SDS - running pufrem. - Opatrně vyjmeme hřebeny a odstraníme bublinky. - Naneseme vzorky. - Elektroforetickou vanu přikryjeme víčkem a připojíme ke zdroji elektrického napětí, který zapneme a nastavíme na 100 V pro zaostření (asi 10 min) a na 130 V pro dělení (asi 50 min). - Ihned po vyjetí barvičky z gelu aparaturu odpojíme od zdroje el. napětí, rozebereme ji a gely vyjmeme z meziskel (za pomocí špachtličky a vody). - Gely ponoříme do nádobky obsahující asi 15 ml barvícího roztoku (přes noc) - Poté gely odbarvíme v odbarvovacím roztoku dokud nevystoupí píky a gel se úplně neodbarví - gely je možné určitou dobu uchovat v 5% kys. octové Chemikálie pro SDS-PAGE AA/Bis [30%/0,8%] TRIS.HCl [1,5 M, ph 8,8] 10% SDS 10% APS (10% roztok persíranu amonného) TEMED TRIS.HCl [0,5 M, ph 6,8] n-butanol SDS-running pufr - 3,03 g TRIS.HCl, 14,4 g Glycine, 1 g SDS rozpustit v 1 L destilované vody Barvící roztok - 0,1% CBB R-250 v roztoku 15% kys. octové a 45% methanolu Odbarvovací roztok - 40% methanol, 10% kys. octová 5% kys. octové