VYUŽITÍ CYTOLOGICKÝCH A MOLEKULÁRNĚ BIOLOGICKÝCH METOD PŘI DETEKCI NÁDORŮ Definice problematiky Profil přístupů Nádorová heterogenita
Všechny nádory mají genetický podtext, ale některé mají tento podtext větší než jiné. Parafrázováno z Animal Farm - George Orwell
NEOPLÁZIE (TUMOR) Růst Diferenciace Funkce Organizace Lokalizace Regulace
CYTOLOGIE A MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE Původ Rozvoj Heterogenita Biomarkery Cíle zásahu
CYTOLOGIE A MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE Kvantitativně screeningový přístup profilování Kvalitativní individuální přístup
METODIKY I 1. Cílené přístupy Real-time PCR Mikroskopie Exprese proteinů, RNA FC http://www.cellsignal.com/products/images/3 094_wb_jb_040204.jpg 2. Celkové přístupy FACS PC hmotová spektrometrie HCS http://www.epmmagazine.com/labproducts/high-content-screeningwith-inverted-microscope-frame/
METODIKY II 1. Cílené přístupy locus (alelické imbalance) DNA-PCR-Mikrosatelity FISH Microdisekce PCR jedné buňky 2. Celkové přístupy Karyotypování CGH SNPs -Omiky
MUTACE Driver mutace: stimulace růstu, rozvoj nádoru, pozitivně selektovány Passenger mutace: biologicky neutrální Výsledky: 921 bázových substitucí 763 passenger mutací 159 driver mutací u 119 (66/210 vzorků nádorů) Greenman et al. (2007) Nature 446:153
INTERNATIONAL CANCER GENOME CONSORTIUM 25,000 nádorových genomů Genomická Epigenomická Transkriptomická
INTERNATIONAL CANCER GENOME CONSORTIUM Buňky karcinomu plic 23 000 mutací Buňky melanomu 33 000 mutací Buňky glioblastomu 30 000 mutací
INTERNATIONAL CANCER GENOME CONSORTIUM http://www.nature.com/nature/journal/v463/n7283/full/nature08768.html
INTERNATIONAL CANCER GENOME CONSORTIUM Téměř 750 nádorových linií 1/9 genů - delece 1/100 genů na chromozomu X inaktivace s němým dopadem 1/ 50 genů inaktivace u zdravých subjektů Nádory tolerantnější něž zdravé tkáně
PERSONALIZOVANÁ NÁDOROVÁ GENOMIKA
EPIGENETICKÉ ZMĚNY U NÁDORŮ Téměř všechny nádory 50% genů (familiární forma) umlčeny u sporadických forem Stochastický výskyt Defekty v epigenetických mechanizmech
TYPY EPIGENETICKÝCH ZMĚN DNA metylace Modifikace histonů Dysregulace nekódujících RNA Chromatinová organizace Telomerová stabilita a funkce
TP73 INAKTIVACE TSG MLH1 RASSF1 CDKN2A p16 INK4A + p14 ARF HIC1 TP53 BRCA2 cadherin BRCA1 Červená = pouze hypermetylace Zelená = pouze mutace Purpurová = oba mechanizmy HIC1 = hypermetylován u nádorů (častý LOH) Nature Rev 3:415, 2002
Nat Rev Cancer 6:866, 2006
mirna PROFILOVÁNÍ NOVÝ KLINICKÝ DIAGNOSTICKÝ NÁSTROJ Nat Rev Cancer 6:866, 2006
NEKÓDUJÍCÍ RNA
VNITŘNÍ HETEROGENITA Všechny odlišitelní fenotypické znaky Darwinovská evoluce Genetická heterogenita fenotypická heterogenita Heritabilní fenotypy vs nedědivé fenotypy
NEDĚDIVÉ ZDROJE DIVERSITY NÁDOROVÝCH POPULACÍ Nádorové kmenové buňky Fenotypická plasticita Environmentální signály Stochastické buněčně-autonomní mechanizmy?
FENOTYPICKÁ PLASTICITA Genotypy rozsah fenotypů (norma reakce) Mikroprostředí nádorů homogenní prostředí
FENOTYPICKÁ PLASTICITA v HOMOGENNÍCH PROSTŘEDÍCH Hluk v genové expresi Metastabilní intracelulární signální dráhy Baktérie (viry) perzistence Savčí buňky TRAIL, mofologie motilita
DĚDIVÉ ZDROJE DIVERZITY NÁDOROVÝCH BUNĚČNÝCH POPULACÍ Dědičné mutace Makroscopická (lineární) vs mikroskopická stádia (non-lineární) Evoluce mutací stochastický proces Náhodné mutace a výhoda, neutrální a mírná nevýhoda
INTRATUMORÁLNÍ KLONÁLNÍ DIVERZITA 1. Buněčná genetická heterogenita 2. Klonální genetická heterogenita genetické odlišnosti amplifikované klonální expanzí - leukémie - prsa - prostata - střevo - mozek - jícen - gynekologické
ODEBÍRÁNÍ VZORKŮ Biopsie (50% obsah nádoru sensitivita zachycených heterozygotních změn 25% u NGS) Postchirurgické vzorky Velikost Poměr signal-to-noise Kvantita a kvalita Mikrodisekce malé, homogenní
ZDROJE KLONÁLNÍ HETEROGENITY Jackpot mutace Selektivní síly (pozitivní selekce, téměř fixace) Odlišné klony - proliferující neoplastické buňky - parenchyma - stroma - pojivo a cévy Principy ekologie
HETEROGENITA METASTÁZ Klonální vztah mezi primárními a metastazujícími nádory? Úroveň heterogenity u metastazujících nádorů?
BIOLOGICKÝ DOPAD KLONÁLNÍ HETEROGENITY 1. Klonální diverzita vstup pro selekční tlak 2. Biologické interakce mezi klony 3. Extinkce tumoru a jeho evoluční adaptace (CML)
Nejsilnější interakce BIOLOGICKÉ INTERAKCE KOMPETICE Integrovaná tkáň intrinzně a extrinzně nádorově supresivní (senescence, smrt, ztráta kmenovosti, TSG), prostorová organizace SCs malé ostrůvky Ekologický systém Limitované zdroje
BIOLOGICKÉ INTERAKCE AMENSALIZMUS Interferenční kompetice Houby - baktérie Bcr-Abl upregulace 24p3 (iron transportér) In vitro a in vivo Primární vs metastatické nádory
BIOLOGICKÉ INTERAKCE ANTAGONIZMUS Predace and parasitism
BIOLOGICKÉ INTERAKCE KOMENSALIZMUS A MUTUALIZMUS Pozitivní interakce Přežívání a proliferace Experimentálně neprokázáno