Ing. Martina Almáši, Ph.D. OKH-LEHABI FN Brno, Babákova myelomová skupina při Ústavu patologické fyziologie, LF MU, Brno

Transkript

1 Zpracování a využití biologického materiálu pro výzkumné účely od nemocných s monoklonální gamapatií Ing. Martina Almáši, Ph.D. OKH-LEHABI FN Brno, Babákova myelomová skupina při Ústavu patologické fyziologie, LF MU, Brno

2 Laboratoř LEHABI OKH FN BRNO Zpracování a archivace biologického materiálu: Mnohočetný myelom MGUS Raritní hematologická onemocnění (Waldenströmova makroblobulinémie, Castlemanova choroba, Erdhaim- Chesterova choroba, histiocytózy, hemangiomatózy, IgA Pemfigus, POEMS syndrom)

3 ZPRACOVÁNÍ VZORKŮ PACIENTŮ S MG Laboratorní analýzy MGUS a MM založeny na separaci plazmatických buněk (PB) z kostní dřeně Patologické populace v kostní dřeni jsou heterogenní a mohou obsahovat méně zralé formy B lymfocytů Nedostatek nádorové frakce buněk

4 ZPRACOVÁVANÝ MATERIÁL Kostní dřeň 1/ flowcytometrické rutinní vyšetření 2/ plazma KD 3/ separace PB Periferní krev 1/ flowcytometrické rutinní vyšetření 2/ izolace DNA 3/ plazma PK 5/ sérum PK

5 Selekce PB z kostní dřeně 1. Odběr KD 2. Denzitní gradientová centifugace: separace mononukleárních buněk: - monocyty (20%), lymfocyty (70%) 3. Promytí peletu 4. Odstředění 5. Celkový počet mononukleárních buněk 6. Stanovení vstupní infiltrace PB 7. Separace PB

6 Separační techniky s použitím monoklonálních protilátek MACS (magnetic-activated cell sorting) - monoklonální protilátka konjugovaná s magnetickou partikulí, komerční soupravy k izolaci libovolné buněčné subpopulace FACS (fluorescence-activated cell sorting) - monoklonální protilátka konjugovaná s fluorochromem

7 SEPARAČNÍ TECHNIKY AutoMACSpro (Miltenyi Biotec) Inkubace s protilátkou namířenou proti CD138 FACS Aria (BD Biosciences) Inkubace s 5ti fluorescenčně značenými protilátkami: CD138- PE, CD19-PC7, CD56-FITC, CD38-APC, CD45-PercP

8 MACS magnetic-activated cell sorting Buňky po inkubaci procházejí kolonou v silném magnetickém poli Magneticky označené buňky jsou zadrženy v koloně a odděleny od neoznačených Po vyjmutí kolony z magnetického pole jsou zadržené buňky vymyty

9 FACS fluorescence-activated cell sorting Označená buňka procházející detektorem je pomocí el. výboje vychýlena ze své dráhy a směrována do sběrné zkumavky Vysoká čistota separace

10 SEPARAČNÍ ALGORITMUS % plazmatických buněk v mononukleární frakci < 5 % 5 % FACS MACS 10 % possel s 5-10 % possel d2 Buresova et al, Clin Chem Lab Med, 2012

11 Přehled publikací separace PB 1/ Fišerová A et al. Imunomagnetická separace myelomových buněk. Klin Onkol 2001; 14(2): / Čumová J et al. Selekce plazmatických buněk. Klin Onkol 2008; 21(Suppl): / Cumova J et al. Optimization of immunomagnetic selection of myeloma cells from bone marrow using magnetic activated cell sorting. Int J Hematol 2010;92(2): / Burešová I et al. Srovnání selekce plazmatických buněk metodami MACS a FACS. Klin Onkol 2008;21(Suppl): / Buresova I et al. Bone marrow plasma cell separation validation of separation algorithm. Clin Chem Lab Med 2012;50(6) 6/ Potacova A et al. Sample processing and methodological pitfalls in multiple myeloma research. Klin Oncol 2011; 24(Suppl):18-24.

12 Hlavní požadavky pro výzkumné analýzy Vstupní infiltrace = % CD buněk v mononukleární frakci Čistota PC = % plazmatických buněk v pozitivní frakci

13 Infiltrace vs. množství buněk Nízká inf. < 5% CD138+ Malé množství buněk (< buněk) Velké množství buněk > 30 x 10 6 FACS sortování na mikroskopická skla vario MACS+FACS VarioMACS Vysoká inf. 5% CD138+ Velmi malé množství < 1 x 10 6 Normální / velké množství buněk (Miltenyi Biotec) FACS MACS Buresova et al, Clin Chem Lab Med, 2012

14 Čistota nádorové frakce separovaných buněk (rok 2012) Medián (min-max) [ % ] Počet vzorků celkem N=195 MACS: CD138+CD38+ 87,6 (57,1-99,4) N = 71 FACS: 1/ Abnormální populace PB (CD138+CD19-CD56+/-) 2/ Normální populace PB (CD138+CD19+CD56-) 3/ CD ,3 (80,8-100) 99,3 (91,3-99,9) 99,0 (85,9-99,9) N= 124

15 MACS vs. FACS MACS metoda Separace podle jednoho znaku v jednom kroku Čistota je závislá na vstupní infiltraci Časově méně náročná Nižší náklady FACS metoda Separace podle několika znaků v jednom kroku Čistota nezávislá na vstupní infiltraci Časově náročná Vyšší náklady

16 VÝZKUMNÉ AKTIVITY Flow-cytometrické analýzy: - Studium detailního fenotypu B-lymfocytů a plazmocytů Molekulárně biologické analýzy: - změny exprese genů na úrovni RNA a mirna - dědičné predispozice (SNPs analýzy) Proteomické analýzy: - hledání markerů lékové rezistence Molekulárně cytogenetické analýzy: - I-FISH u MM a MGUS del(13)(q14), del(17)(p13), disrupce IGH, t(4;14), t(11;14), t(14;16), zisk 1q21, hyperdiploidie - čipové technologie (array-cgh) - hodnocení prognostického významu chromozomových aberací ve vztahu k transformaci MGUS do MM

17 Čipové technologie array-cgh Gene Expression Profile

18 Požadavky na čistotu a množství nádorové buněčné frakce Min. čistota Min. množství buněk FISH 70 % 0,04 0,1 x 10 6 acgh 85 % 0,15 x 10 6 PCR 90 % 0,35 x 10 6 GEP 90 % 0,65 x 10 6 proteomika 90 % 1,0 x 10 6

19 Izolace DNA MagNA Pure DNA izolátor (Roche) Nanodrop ND-1000

20 Využití vzorků DNA z periferní krve - SNPs Genetická variabilita populace Single nucleotide polymorphism záměny jedné báze v DNA Frekvence % Sledovány k: riziku vzniku onemocnění léčebné odpovědi V asociačních studiích sledováno tisíce SNPs najednou a hodnocena jejich souvislost s onemocněním Multi-instituční studie

21 Kryogenní skladování

22