Časově rozlišená fluorescence

Časově rozlišená fluorescence Pokročilé biofyzikální metody v experimentální biologii Ctirad Hofr 18.10.2007 5 1

Ustálená a časově rozlišená fluorescence Ustálená fluorescence (Steady State) se měří při buzení kontinuálním zářením a dostáváme potom časovou střední hodnotu intenzity či polarizace fluorescence. Časově rozlišená fluorescence se měří pomocí pulzní excitace (délka pulzu je obvykle kratší než doba dohasínání fluorescence vzorku) nebo fázově modulovaného budícího záření a umožňuje analyzovat časové závislosti měřených parametrů. 5 2

Proč měřit časově rozlišenou fluorescenci? Udává nám informaci o poklesu intenzity fluorescence v čase Měření je relativní, často nezáleží na skutečné hodnotě intenzity Je závislá na vlastnostech okolí Dává informace o dynamice rotaci molekul 5 3

Časový průběh fluorescence Nejjednodušší je exponenciální pokles pro sférické částice t 1.2 1 I ( t) = I 0 e τ I I 0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 5-2 0 2 4 6 8 10 12 time (ns) 4

Čas dohasínání fluorescence τ τ je střední doba mezi excitací molekuly (tj.absorpcí fotonu) a emisí světla při návratu molekuly do základního stavu Jaká je intenzita fluorescence v čase τ po absorpci fotonu? I ( t) = I 0 e t τ Doba dohasínání τ = 2 ns, potom v tomto čase t = τ má fluorescence 37% 0 37% z intenzity než jakou měla čase 0 0-2 0 2 4 6 8 10 12 5 5 čas (ns) 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 Doba dohasínání 2 ns 37% z intenzity v čase 0 log I(t) 1 0.1 0.01 0.01 0.001

Proč měřit dobu dohasínání fluorescence τ? Absolutní měření doba dohasínání nezávisí na koncentraci vzorku Doba dohasínání je závislá na okolním prostředí a může být použita k určení jeho polarity, ph, teploty, koncentrace iontů, přítomnosti zhášedla Přidává další rozměr při fluorescenčním mapování zvyšuje jeho selektivitu Umožňuje měřit rotační korelační čas molekul rotační pohyblivost 5 6

Hlavní způsoby měření časové závislosti fluorescence Pulzní metoda (time-domain) zdrojem excitačního záření je krátký pulz Metoda fázově modulovaného budícího záření (frequency domain) zdrojem excitačního záření je sinusově modulované světlo 5 7

Pulzní metoda Vzorek je excitován krátkým pulzem s trváním mnohem kratším než doba dohasínání τ Závislost intenzity fluorescence na čase (dohasínání) je použita pro výpočet doby dohasínání τ 5 8

Počítání fotonů: Time-Correlated Single Photon Counting TSCP Při každém pulzu excitačního světla může být zaznamenán jeden emitovaný foton. Typické uspořádání je, že jeden foton připadá na 100 excitačních pulzů. Měří se čas mezi excitačním pulzem a zaznamenaným fotonem. time Vytváří se histogram, který znázorňuje časovou distribuci fotonů Pro vyhodnocení křivky dohasínání je potřeba mít soubor alespoň 4000 fotonů 5 9

Časové značení fotonu (Time Tagged Time-Resolved ) Zapisuje se nejen čas vyzáření fotonu po jednotlivém pulzu (start-stop-time; ps), ale také čas od začátku experimentu (real-time; ns) Podle firemní literatury PicoQuant http://www.picoquant.com/dl_notes/technote_tttr.pdf 5 10

Zdroje pro TCSPC Laserové diody Ší5ka pulzu FWHM = 70 ps (plná šířka v polovině maxima) Rychlost opakování pulzu 40 MHz LED (Light Emitting Diode) FWHM = 1,4 ns (plná šířka v polovině maxima) Rychlost opakování pulzu 40 MHz 5 11

Rychlý detektor (MCP PMT) Je nejdůležitější při sledování časové závislosti fluorescence V současností jsou nejrychlejší mikrokanálové deskové fotonásobiče (MicroChannel Plate PhotoMultiplier Tube) Mají rychlou odezvu, elektron putuje v detektoru méně než 1 ns. Ve srovnání s klasickým fotonásobičem je odezva 10 krát rychlejší. 5 12

Detektor - fotonásobič Fokusační elektroda Boční okno 24 mm 2 foton Fotokatoda fotoelektron Vakuum 10-4 Pa Násobiče elektronů (dynody) Anode 5 13 Light Detectors: Photomultiplier Tube (R928 Side-on) Poskytnuto HORIBA Jobin Yvon

Princip přístroje s TCSPC TBX-04 12000 PHOTON COUNTS 10000 8000 6000 4000 2000 Kumulativní histogram 0 36 35 34 33 32 31 30 29 28 27 26 25 24 23 22 21 20 19 18 17 16 15 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 TIME, CHANNELS nanoled S statistical single photon events periodic pulses SYNC CFD TAC rate 1MHz Coaxial Delay 50 Ns Sync delay 20 ns IBH 5000U MCA V TAC α 2% Poskytnuto HORIBA Jobin Yvon 5 14

Praktické určení τ I t t τ = I e ( ) 0 e 1 I 0. 37 I = I = ( τ ) 0 0 5 15

počet fotonů 100000 10000 1000 100 10 dohasínání po pulzu δ Princip skládání (konvoluce) signálů Intenzita je funkcí času: I(t)=α exp (-t/τ) PHOTON COUNTS 100000 10000 1-10 -5 0 5 10 ČAS, KANÁLY 1000 100 10 δ 4 δ 3 δ 2 δ 1 δ 0 Složený signál dohasínání Intenzita zdroje světla je také funkcíčasu L(t) Konvoluce fluorescence : F(t)= I(t) L(t) 1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011121314151617181920 TIME, CHANNELS 5 16

Časově rozlišená fluorescence fluoresceinu Fluorescein ve vodě při ph 9.0 Excitace 450 nm Pulzní LED s opakovací frekvencí 20 MHz IRF Instrument Response Function signál zdroje a odezva přístroje IRF je křivka odpovídající nejkratšímu možnému času dohasínání, který lze na daném přístroji měřit IRF 5 17

Více fluoroforů v systému: multiexponenciální dohasínání I I ( t) ( t) = α e 1 t τ1 2 t τ2 = α exp( t / τ ) i + α e i... + α N e t N τ α ι poměrné zastoupení fluoroforu τ ι doba dohasínání daného fluoroforu Celková intenzita je dána součtem (konvolucí) příspěvků od každého fluoroforu Při analýze je nutno použít dekonvoluce rozklad signálu na příspěvky jednotlivých fluoroforů 5 18

Rozlišení skládání signálů dvou fluoroforů (dekonvoluce) Při určování příspěvků od jednotlivých fluoroforů někdy není možno přesně určit α a τ, protože ke stejnému proložení můžeme použít jejich různé kombinace Různé dvojice α ι a τ ι mohou dát velmi podobný tvar křivky dohasínání 5 19

Časově rozlišená fluorescence lidského sérového albuminu HSA Fluoroforem je tryptofan V proteinu je tryptofan jenom jeden, přesto je časová závislost dohasínání vícexponenciální. Je to dáno různými konformacemi proteinu v roztoku Tryptofan se nachází ve více různých lokálních prostředích 5 Poskytnuto HORIBA Jobin Yvon 20

Metoda fázově modulovaného budícího záření 1. Vzorek je excitován sinusově modulovaným světlem s vysokým frekvenčním rozsahem srovnatelným s převrácenou hodnotou doby dohasínání 2. Když dojde k excitaci vzorku modulovaným zářením, emitované záření fluorescence odpovídá modulační frekvenci budícího absorbovaného záření 3. Emise je časově zpožděna ve srovnání s budícím zářením, což se projeví fázovým posunem. Fázový posun je použit k výpočtu doby dohasínání fluorescence τ 5 21

Určení doby dohasínání metodou fázové modulace Intenzita 2 1 0 Φ fázový posun excitační záření emise fluorescence b B Modulace excitace b/a (výška peaku/střední intenzita) Modulace emise B/A -1-2 0 2π (360 )/T Určení času dohasínání z fázového posunu Φ Φ stupně/čas 5 22 a 4π (720 )/2T A 6π (1080 )/3T tan Φ = ωτ 2 2 m = Relativní modulace m 1 m 1+ω τ = m B b / / Určení času dohasínání z modulace m A a

AMPLITUDE φ % 1.5 1 0.5 0-0.5-1 -1.5 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 φ M = ( ) ( ) TIME 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 1 10 100 1000 Frequency, MHz 5 Poskytnuto HORIBA Jobin Yvon 23 M Princip měření pomocí fázové modulace m = B b / / A a

Praktický příklad výpočtu Φ= 68 tan Φ = ωτ 2 2 τ Φ tan Φ = ω Φ 1+ω τ 5 24 τ m m = m= 0.4 1 m 1 1 = 1 2 ω m

Závislost parametrů získaných metodou fázové modulace na τ Čím je kratší doba dohasínání τ, tím více se posunuje průnik křivek k vyšším frekvencím Pro delší dobu dohasínání τ = 10 µs je nutno použít modulační frekvence 10 khz až 1 MHz Pro kratší dobu dohasínání τ = 100 ps je nutno použít modulační frekvence až 2GHz tedy 10 000 krát větší 5 25

Časově rozlišená fluorescence fluoroforů v rozdílném prostředí Protein se dvěma fluorofory - tryptofany Flourofory mají ve stejném prostředí stejnou hodnotu τ Po přidání zhášedla se sníží doba fluorescence u fluoroforu na povrchu τ 2 Výsledkem je prohnutá křivka Úkolem dekonvoluce je pak určit τ 1, τ 2 a poměrné příspěvky fluoroforů α 1,α 2 5 26 I( t ) = α e 1 t τ1 + α e 2 t τ 2

logr(t) Změna rotačního korelačního času při multimerizaci proteinu Časové závislosti polarizované fluorescence lze použít při sledování změny dynamiky systému molekul Sledování multimerizace fosfofruktokinázy θ = 5 ns M θ T = 20 ns 0 10 20 30 40 Čas (ns) 5 27

Fluorescence LifeTime Imaging Microcsopy FLIM Sledování časové závislosti fluorescence v 2D prostoru Umožňuje rozlišit prostředí ve kterém se fluorofory nacházejí Umožňuje sledovat zhášení flouroforů, ať už vlivem prostředí, zhášedla nebo interakce s jinými molekulami 5 28

Použití FLIM při sledování interakce proteinů Rychlejší dohasínání v přítomnosti zhášejícího proteinu Normální dohasínání H. Wallrabe and A. Periasamy, Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy, Current Opinion in Biotechnology, Volume 16, Issue 1, Analytical biotechnology, 2005, Pages 19-27. 5 29

Příklad detailního zobrazení FLIM Závislost doby dohasínání fluorescence NADH je dvouexponenciální s hodnotou 0.4 ns pro volnou a 3 ns pro navázanou molekulu NADH 5 30

Využití časově rozlišené fluorescence při proteomické analýze Gel barvený Sypro-Ruby Intenzita Časové rozlišení Intenzita je doplněna o pseudobarevné časové rozlišení, aby mohly být oba parametry zviditelněny současně Časové rozlišení fluorescence může pomoci při analýze proteinů vpřekrývajících 5 se pásech Upraveno podle materiálů Materialů Photonic Research Systems Ltd. www.prsbio.com 31

Literatura Lakowicz J.R.: Principles of Fluorescence Spectroscopy. Third Edition, Springer + Business Media, New York, 2006. Fišar Z.: FLUORESCENČNÍ SPEKTROSKOPIE V NEUROVĚDÁCH http://www1.lf1.cuni.cz/~zfisar/fluorescence/default.htm Poděkování Grafika z knihy Principles o Fluorescence byla pro účely této přednášky laskavě poskytnuta profesorem J.R. Lakowitzem. 5 32