Detekce Leidenské mutace

Podobné dokumenty
Molekulární genetika II zimní semestr 4. výukový týden ( )

Využití DNA markerů ve studiu fylogeneze rostlin

Fingerprinting mikrobiálního společenstva (DGGE/TGGE, RFLP,T-RFLP, AFLA, ARDRA, (A)RISA)

Využití restriktáz ke studiu genomu mikroorganismů

MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE. 2. Polymerázová řetězová reakce (PCR)

Metody molekulární biologie

Co zjišťujeme u DNA ACGGTCGACTGCGATGAACTCCC ACGGTCGACTGCGATCAACTCCC ACGGTCGACTGCGATTTGAACTCCC

Inovace studia molekulární a buněčné biologie

Analýza DNA. Co zjišťujeme u DNA DNA. PCR polymerase chain reaction. Princip PCR PRINCIP METODY PCR

DETEKCE A IDENTIFIKACE FYTOPATOGENNÍCH BAKTERIÍ METODOU PCR-RFLP

Klonování DNA a fyzikální mapování genomu

Enzymy v molekulární biologii, RFLP. Molekulární biologie v hygieně potravin 3, 2014/15, Ivo Papoušek

Enzymy používané v molekulární biologii

Ivo Papoušek. Biologie 8, 2015/16

MOLEKULÁRNĚ BIOLOGICKÉ METODY V ENVIRONMENTÁLNÍ MIKROBIOLOGII. Martina Nováková, VŠCHT Praha

Genetické markery - princip a využití

Co zjišťujeme u DNA ACGGTCGACTGCGATGAACTCCC ACGGTCGACTGCGATCAACTCCC ACGGTCGACTGCGATTTGAACTCCC

Enzymy používané v molekulární biologii

Analýza DNA. Co zjišťujeme u DNA

Základy molekulární biologie KBC/MBIOZ

Genetický polymorfismus

Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a Státním rozpočtem ČR InoBio CZ.1.07/2.2.00/

ELEKTROFORETICKÁ SEPARACE NUKLEOVÝCH KYSELIN

Základy molekulární biologie KBC/MBIOZ

Klonování gen a genové inženýrství

ší šířen METODY ANALÝZY NUKLEOVÝCH KYSELIN Polymerázová řetězová reakce

Ivo Papoušek. Biologie 6, 2017/18

Genové knihovny a analýza genomu

Polymorfismus délky restrikčních fragmentů (RFLP)

Genetické markery, markery DNA

Využití molekulárních markerů v systematice a populační biologii rostlin. 10. Další metody

Bakteriální transpozony

Mgr. et Mgr. Lenka Falková. Laboratoř agrogenomiky. Ústav morfologie, fyziologie a genetiky zvířat Mendelova univerzita

Pulzní gelová elektroforéza Při konvenční gelové elektroforéze je rozdělení molekul je podmíněno rychlejším průchodem menších molekul pórovitou

Crossing-over. over. synaptonemální komplex

Metody používané v MB. analýza proteinů, nukleových kyselin

Metody studia historie populací. Metody studia historie populací

MODULARIZACE VÝUKY EVOLUČNÍ A EKOLOGICKÉ BIOLOGIE CZ.1.07/2.2.00/ Metodologie molekulární fylogeneze a taxonomie hmyzu Bi7770 Andrea Tóthová

DNA TECHNIKY IDENTIFIKACE ŽIVOČIŠNÝCH DRUHŮ V KRMIVU A POTRAVINÁCH. Michaela Nesvadbová

Mendelova genetika v příkladech. Genetické markery

ší šířen VAZEBNÁ ANALÝZA Vazba genů

Interakce proteinu p53 s genomovou DNA v kontextu chromatinu glioblastoma buněk

Kyselina hyaluronová. Kyselina hyaluronová. Streptococcus equi subsp. produkovaná kyselina hyaluronová a. Autor prezentace: Mgr.

Molekulární genetika IV zimní semestr 6. výukový týden ( )

Polymerázová řetězová reakce

Polymorfizmy detekované. polymorfizmů (Single Nucleotide

Implementace laboratorní medicíny do systému vzdělávání na Univerzitě Palackého v Olomouci. reg. č.: CZ.1.07/2.2.00/

MOLEKULÁRNÍ TAXONOMIE - 4

Elektroforéza nukleových kyselin

REKOMBINACE Přestavby DNA

Využití rep-pcr v bakteriální taxonomii

Inovace studia molekulární a buněčné biologie reg. č. CZ.1.07/2.2.00/

Obsah LABORATOŘ MOLEKULÁRNÍ DIAGNOSTIKY

Příprava vektoru IZOLACE PLASMIDU ALKALICKÁ LYZE, KOLONKOVÁ IZOLACE DNA GELOVÁ ELEKTROFORÉZA RESTRIKČNÍ ŠTĚPENÍ. E. coli. lyze buňky.

ZÁKLADY BAKTERIÁLNÍ GENETIKY

14. přednáška z BIOLOGIE pro Bakaláře studující fyzioterapii, optometrii a pro nutriční terapeuty M.Gabriel, BÚ LF MU

Metody používané v MB. analýza proteinů, nukleových kyselin

Globální pohled na průběh replikace dsdna

RESTRIKCE A MODIFIKACE FÁGOVÉ DNA

Inovace studia molekulární a buněčné biologie reg. č. CZ.1.07/2.2.00/

Podrobný seznam vyšetření - LMD

TEST: GENETIKA, MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE

Podrobný seznam vyšetření - LMD

Izolace, klonování a analýza DNA

2. Z následujících tvrzení, týkajících se prokaryotické buňky, vyberte správné:

Determinanty lokalizace nukleosomů

Hybridizace nukleových kyselin

Inovace studia molekulární a buněčné biologie

Terapeutické klonování, náhrada tkání a orgánů

Rekombinantní protilátky, bakteriofágy, aptamery a peptidové scaffoldy pro analytické a terapeutické účely Luděk Eyer

Referenční lidský genom. Rozdíly v genomové DNA v lidské populaci. Odchylky od referenčního genomu. Referenční lidský genom.

Elektroforéza Sekvenování

PO STOPÁCH BAKTERIÍ V/KOLEM NÁS

Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav biologie rostlin

Genetika bakterií. KBI/MIKP Mgr. Zbyněk Houdek

Seminář izolačních technologií

Kapitola 3 Biomolecular Design and Biotechnology. Překlad: Jaroslav Krucký

Amplifikační metody v molekulární diagnostice mikroorganismů. doc. RNDr. Milan Bartoš, Ph.D.

Inovace studia molekulární a buněčné biologie

Metody používané v MB. analýza proteinů, nukleových kyselin

Využití rekombinantní DNA při studiu mikroorganismů

Elektromigrační metody

Inovace studia molekulární a buněčné biologie

NUKLEOVÉ KYSELINY. Základ života

USING OF AUTOMATED DNA SEQUENCING FOR PORCINE CANDIDATE GENES POLYMORFISMS DETECTION

MIKROBIOLOGIE V BIOTECHNOLOGII

Biofyzikální ústav AV ČR, Laboratoř molekulární epigenetiky, Královopolská 135, Brno, tel.: ,

Některé vlastnosti DNA důležité pro analýzu

4. Centrální dogma, rozluštění genetického kódu a zrod molekulární biologie.

RIGORÓZNÍ OTÁZKY - BIOLOGIE ČLOVĚKA

Nukleové kyseliny (NK)

Základy molekulární biologie KBC/MBIOZ

Amplifikační metody umožňují detekovat. k dispozici minimálně kopií DNA,

Inovace studia molekulární a buněčné biologie reg. č. CZ.1.07/2.2.00/

Molekulárně biologické metody princip, popis, výstupy

Návrh směrnic pro správnou laboratorní diagnostiku Friedreichovy ataxie.

MODERNÍ BIOFYZIKÁLNÍ METODY:

Inovace studia molekulární a buněčné biologie

Příprava rekombinantních molekul pro diagnostické účely

ALLELE FREQUENCY OF KIT GENE ASSOCIATED WITH TOBIANO SPOTTING PATTERN IN PAINT HORSE BREED

Transkript:

Detekce Leidenské mutace MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE 3. Restrikční štěpení, elektroforéza + interpretace výsledků

Restrikční endonukleasy(restriktasy) bakteriální enzymy štěpící cizorodou dsdna na kratší úseky restrikční fragmenty biologický význam: ochrana bakterií před cizí DNA (bakteriofágy, plazmidy) vlastní DNA je chráněna metylací v restrikčním místě rozpoznávají specifické sekvence (restrikční místa) vdna a DNA v nich štěpí restrikční místa dlouhá asi 4-8 nukleotidů, často mají charakter palindromů (obrácených repetic) označování: EcoRI podle rodového, respektive druhového jména organismu, ze kterého restriktasa pochází, např. Escherichia coli pořadové číslo označení kmene 5 - GAATTC-3 3 - CTTAAG-5

Palindrom -je jakákoliv sekvence symbolů -slovo, věta, číslo, sekvence DNA, kterou lze číst zprava doleva nebo zleva doprava a má vždy stejnývýznam nezařazen, Anna, Kuna nese nanuk, Palindrom v genetice sekvence NK (DNA nebo RNA), která je stejná pokud se čte od 5 konce k 3 konci jednoho vlákna a od 5 k 3 konci na komplementárním vlákně -------------------- 5 -G A AT TC 3 3 -C T TA AG 5 --------------------

endonukleázy - štěpí fosfodiesterovou vazbu uvnitř řetězce x exonukleázy - štěpí fosfodiesterovou vazbu od 3 nebo 5 konce (exo)

známo asi 3000 restriktáz, asi 600 komerčně dostupných Podle aktivity: I. typu - vyžadují ATP pro štěpení bifunkční enzymy spojující methylacia štěpení štěpí daleko od rozpoznávaného místa II. typu -nejčastěji využívané v genovém inženýrství nevyžadují ATP pro štěpení štěpí přímo v restrikčním místě nebo v jeho bezprostřední blízkosti frekvence štěpení závisí na délce rozeznávané sekvence 4 n III. typu - rozpoznávají dvě nepalindromické sekvence v inverzní orientaci štěpí 20 30 bází za rozpoznávacím místem IV. typu - štěpí modifikovanou DNA např. methylovanou

The Restriction Enzyme Database http://rebase.neb.com

Štěpení DNA restrikční endonukleázou nástroj ke štěpení a skládání fragmentů DNA do nových celků RE nerozlišují původ DNA jen svoji specifickou sekvenci

Příklad

Štěpení DNA restrikční endonukleázou EcoRI

Využitírestrikčních endonukleas fragmentaci DNA AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) STRP (Short Tandem Repeat Polymorphism) při molekulárním klonování fragmentu DNA do vektoru či spojování dvou fragmentů DNA dohromady

Využití restrikčních endonukleas k fragmentaci DNA DNA fingerprinting RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) PCR-RFLP = AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) STRP (Short Tandem Repeat Polymorphism) při molekulárním klonování fragmentu DNA do vektoru či spojování dvou fragmentů DNA dohromady

RE restrikční fragmenty separace pomocí ELFO

Rekombinace DNA vložení do bakterie kulfvace klonu

Moraxella nonliquefaciens

MnlI Moraxella non liquefaciens - atypický RE (restrikční enzym) - rozpoznává tuto sekvenci (asymetrické místo není palindromem): jednonukleotidový přesah -enzym je dodáván ve FastDigestGreen pufru obsahuje: modré barvivo (xylenová modř) rychlost migrace v 1 % agarosovémgelu -3-5 kbdna + žluté barvivo rychlost 10 bpdna

Vztah protein C hemokoagulační kaskáda degr. degr.

Stanovení Leidenské mutace záměna GA štěpné místo pro restrikční enzym MnlIchybí úsek DNA zůstává vcelku 1.PCR úseku DNA kde nastává mutace a okolí v rozsahu 288 bp 2. štěpení PCR produktu restrikčním enzymem 3. elektroforesa vyštěpených produktů

alela normální GGTGCAGCACACCAACATGACACATGTATACATATGTAACAAACCTGCACGTTGTGCACA TGTACCCTAGAACTTAAAGTATAATTTAAAAAAAATAAAAATAAAAGAATTCCTTTTGCA ATATTAATTGGTTCCAGCGAAAGCTTATTTATTTATTTATTATCATGAAATAACTTTGCA AATGAAAACAATTTTGAATATATTTTCTTTCAGGCAGGAACAACACCATGATCAGAGCAG TTCAACCAGGGGAAACCTATACTTATAAGTGGAACATCTTAGAGTTTGATGAACCCACAG AAAATGATGCCCAGTGCTTAACAAGACCATACTACAGTGACGTGGACATCATGAGAGACA TCGCCTCTGGGCTAATAGGACTACTTCTAATCTGTAAGAGCAGATCCCTGGACAGGCGAG GAATACAGGTATTTTGTCCTTGAAGTAACCTTTCAGAAATTCTGAGAATTTCTTCTGGCT AGAACATGTTAGGTCTCCTGGCTAAATAATGGGGCATTTCCTTCAAGAGAACAGTAATTG TCAAGTAGTCCTTTTTAGCACCAGTGTGATAACATTTATTCTTTTTTTTTTTTTGTCTTG TCTATTTTTATCAGTACCATCACTGCCGAAGGCAAGTCTAGAGTGTGATAACATATTTTG FVL F 5 - GGA ACA ACA CCA TGA TCA GAG CA -3 23 mer FVL R 5 - TAG CCA GGA GAC CTA ACA TGT TC -3 23 mer

alela normální GGTGCAGCACACCAACATGACACATGTATACATATGTAACAAACCTGCACGTTGTGCACA TGTACCCTAGAACTTAAAGTATAATTTAAAAAAAATAAAAATAAAAGAATTCCTTTTGCA ATATTAATTGGTTCCAGCGAAAGCTTATTTATTTATTTATTATCATGAAATAACTTTGCA AATGAAAACAATTTTGAATATATTTTCTTTCAGGCAGGAACAACACCATGATCAGAGCAG TTCAACCAGGGGAAACCTATACTTATAAGTGGAACATCTTAGAGTTTGATGAACCCACAG AAAATGATGCCCAGTGCTTAACAAGACCATACTACAGTGACGTGGACATCATGAGAGACA TCGCCTCTGGGCTAATAGGACTACTTCTAATCTGTAAGAGCAGATCCCTGGACAGGCGAG GAATACAGGTATTTTGTCCTTGAAGTAACCTTTCAGAAATTCTGAGAATTTCTTCTGGCT AGAACATGTTAGGTCTCCTGGCTAAATAATGGGGCATTTCCTTCAAGAGAACAGTAATTG TCAAGTAGTCCTTTTTAGCACCAGTGTGATAACATTTATTCTTTTTTTTTTTTTGTCTTG TCTATTTTTATCAGTACCATCACTGCCGAAGGCAAGTCTAGAGTGTGATAACATATTTTG délka PCR produktu: 288 bp FVL F 5 - GGA ACA ACA CCA TGA TCA GAG CA -3 23 mer FVL R 5 - TAG CCA GGA GAC CTA ACA TGT TC -3 23 mer

alela normální GGTGCAGCACACCAACATGACACATGTATACATATGTAACAAACCTGCACGTTGTGCACA TGTACCCTAGAACTTAAAGTATAATTTAAAAAAAATAAAAATAAAAGAATTCCTTTTGCA ATATTAATTGGTTCCAGCGAAAGCTTATTTATTTATTTATTATCATGAAATAACTTTGCA AATGAAAACAATTTTGAATATATTTTCTTTCAGGCAGGAACAACACCATGATCAGAGCAG TTCAACCAGGGGAAACCTATACTTATAAGTGGAACATCTTAGAGTTTGATGAACCCACAG AAAATGATGCCCAGTGCTTAACAAGACCATACTACAGTGACGTGGACATCATGAGAGACA TCGCCTCTGGGCTAATAGGACTACTTCTAATCTGTAAGAGCAGATCCCTGGACAGGCGAG GAATACAGGTATTTTGTCCTTGAAGTAACCTTTCAGAAATTCTGAGAATTTCTTCTGGCT AGAACATGTTAGGTCTCCTGGCTAAATAATGGGGCATTTCCTTCAAGAGAACAGTAATTG TCAAGTAGTCCTTTTTAGCACCAGTGTGATAACATTTATTCTTTTTTTTTTTTTGTCTTG TCTATTTTTATCAGTACCATCACTGCCGAAGGCAAGTCTAGAGTGTGATAACATATTTTG délka PCR produktu: 288 bp wildtype: 158 bp 37 bp 93 bp FVL F 5 - GGA ACA ACA CCA TGA TCA GAG CA -3 23 mer FVL R 5 - TAG CCA GGA GAC CTA ACA TGT TC -3 23 mer

alela Leiden GGTGCAGCACACCAACATGACACATGTATACATATGTAACAAACCTGCACGTTGTGCACA TGTACCCTAGAACTTAAAGTATAATTTAAAAAAAATAAAAATAAAAGAATTCCTTTTGCA ATATTAATTGGTTCCAGCGAAAGCTTATTTATTTATTTATTATCATGAAATAACTTTGCA AATGAAAACAATTTTGAATATATTTTCTTTCAGGCAGGAACAACACCATGATCAGAGCAG TTCAACCAGGGGAAACCTATACTTATAAGTGGAACATCTTAGAGTTTGATGAACCCACAG AAAATGATGCCCAGTGCTTAACAAGACCATACTACAGTGACGTGGACATCATGAGAGACA TCGCCTCTGGGCTAATAGGACTACTTCTAATCTGTAAGAGCAGATCCCTGGACAGGCAAG GAATACAGGTATTTTGTCCTTGAAGTAACCTTTCAGAAATTCTGAGAATTTCTTCTGGCT AGAACATGTTAGGTCTCCTGGCTAAATAATGGGGCATTTCCTTCAAGAGAACAGTAATTG TCAAGTAGTCCTTTTTAGCACCAGTGTGATAACATTTATTCTTTTTTTTTTTTTGTCTTG TCTATTTTTATCAGTACCATCACTGCCGAAGGCAAGTCTAGAGTGTGATAACATATTTTG délka PCR produktu: 288 bp wildtype: 158 bp 130 bp FVL F 5 - GGA ACA ACA CCA TGA TCA GAG CA -3 23 mer FVL R 5 - TAG CCA GGA GAC CTA ACA TGT TC -3 23 mer

alela Leiden

Detekce Faktor V Leiden Fprimer A R primer GAACATGTTAGTTAGGTCTCTGGCTA 158bp 130bp 93bp 37 bp délka PCR produktu 288 bp

Stanovení Leidenské mutace pomocí PCR RFLP 158 bp 37 93 bp 3 5 alela normální 3 restrikční endonukleasa MnlI 158 bp 130 bp 5 alela Leiden

Elektroforéza 3 % agarózovýgel s TAE pufrem Agaróza z mořských řas, lineární polysacharid (D-gal a L-gal)

+ -

Elektroforéza 3 % agarózovýgel s TAE pufrem Agaróza z mořských řas, lineární polysacharid (D-gal a L-gal)

DNA marker směs purifikovaných DNA fragmentů je dodáván s nanášecím pufrem Loading Dye: - bromphenol blue barva, lepší orientace na gelu - glycerol zvyšuje hustotu vzorku -rychlost migrace na gelu přibl. 500 bp + - modré barvivo (xylenová modř)- rychlost migrace 3-5 kb TAE pufr 3 % agarosegel

Nanášení vzorků na gel

Nanášení vzorků na gel

Připojení k elektrickému zdroji Dělení - +

Dělení - +

Ukončení elektroforézy odpojení od zdroje elektrického napětí, vyjmutí gelu z elektroforetické vany Dělení - +

Ethidium bromid

158 bp 37 93 bp 3 5 restrikční endonukleasa MnlI 5 158 bp 130 bp alela normální alela Leiden 158bp 130bp 93bp 37 bp

Analýza produktů PCR po elektroforese na gelu 100 bp DNA ladder PCR produkt PCR produkt wt / wt Leiden / wt neg. kontrola 300 bp 200 bp 100 bp 288 bp 158 bp 130 bp 93 bp

195 (158+37) 158 bp 130 bp 93 bp (37 bp) 1 2 3 1. G/A 2. A /A 3. G/G 158 bp, 130 bp, 93 bp, (37 bp) heterozygot 158 bp, 130 bp homozygot s mutovanou alelou 158 bp, 93 bp, (37 bp) homozygot s normální alelou